冷凍干燥的保護劑和添加劑

冷凍干燥的保護劑和添加劑第1頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月在食品、藥品以及生物體的冷凍干燥和貯藏過程中，很多因素（例如，化學成分、凍結速率、凍結和脫水應力、玻璃化轉變溫度、干燥固體中剩余水分、貯藏環(huán)境的溫度和濕度等）都會影響其中活性組分的穩(wěn)定性甚至會導致失活。大量的實驗研究表明，除了一些食品、人血漿、牛奶等少數(shù)物料可以直接冷凍干燥外；大多數(shù)的藥品和生物制品，都需要添加合適的冷凍干燥保護劑和添加劑，配制成混合液后，才能進行有效的冷凍干燥和貯藏。第2頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月5.1凍干過程和儲藏過程的變性機理

1.冷凍和干燥過程 在生物制品的冷凍干燥過程中，主要有三種效應會導致生物制品中活性組分的變性：低溫效應、凍結效應和脫水效應。低溫效應生物制品中活性組分在降溫與復溫過程的一定溫度范圍內會發(fā)生變性。如對卵清蛋白(ovalbumin)的研究發(fā)現(xiàn)，在-10℃~-40℃之間，其活性顯著降低，而繼續(xù)降溫到在-192℃，活性幾乎沒有變化。第3頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月凍結效應（包括離子濃度的增加、冰晶的形成與生長、pH值變化以及相分離等

）（1）在生物制品的凍結過程中，不斷結晶會導致溶液的濃度快速升高。小分子糖在最大凍結濃縮基質中的計算濃度高達80%。當溶液濃度發(fā)生變化時，離子濃度增加，促進了化學反應。（2）在生物制品溶液在凍結過程中也會產生大量的冰-水界面。其中活性組分分子，如蛋白質，可能會被吸附到界面上，從而可能破壞蛋白質的天然褶皺結構，最終導致蛋白質變性。（3）在有些生物制品溶液的凍結過程中，溶液的pH值也會發(fā)生變化。如在添加有pH值為7的磷酸鹽緩沖液（NaH2PO4和Na2HPO4的摩爾比為0.72）的蛋白質溶液凍結過程中，由于NaH2PO4的溶解度遠遠大于Na2HPO4，當溶液達到三相共晶點時，它們之間的摩爾比為57，最終導致了pH值的很大改變。蛋白質發(fā)生物理聚集和化學變性。第4頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月脫水效應

（1）水溶液中蛋白質經過充分水合作用后，在蛋白質分子表面附著一單層水，這就是所說的水合層(hydrationshell)。一般來講，參與完全水合作用的水含量為0.3-0.35g（水）/g（蛋白質）。而在凍干蛋白質產品中水的含量一般不超過10%，因此，必定有一部分結合水在干燥過程中被除去。（2）結合水的去除很可能破壞蛋白質的天然結構，最終導致蛋白質變性。這是因為富含結合水的蛋白質在脫水過程中暴露在乏水環(huán)境中，將質子轉化為帶電羧酸基團，破壞了蛋白質中電荷平衡，電荷密度的降低可能促進蛋白質分子之間的疏水作用，從而使蛋白質發(fā)生聚集。第5頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月2.儲藏過程蛋白質凝聚：是凍干生物制品活性組分在貯藏過程中發(fā)生變性的主要因素之一。導致蛋白質凝集可能是物理（非共價）相互作用，也可能是蛋白質發(fā)生化學凝集（共價）。脫酰胺作用：也是蛋白質發(fā)生變性的主要途徑之一。天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）是蛋白質中易于發(fā)生脫酰胺作用的兩種氨基酸。非酶褐變：也稱作Maillard反應。它使得還原性糖（如葡萄糖）與蛋白質中的賴氨酸（lysine）和精氨酸（arginine）形成碳水絡合物。氧化反應：蛋白質中蛋氨酸Met，胱氨酸Cys，組氨酸His，色氨酸Trp和酪氨酸Tyr殘基的側鏈是發(fā)生氧化反應的可能位置。水解作用:雖然凍干的蛋白質中含有極少量的水分，但在貯藏過程中仍然會發(fā)生水解作用。

第6頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月如前所述，生物制品的冷凍干燥過程是一個多步驟過程，會產生低溫、凍結和脫水等多種效應；即使成功完成冷凍干燥過程后，在長期保存過程中也很難保證凍干生物制品活性組分的穩(wěn)定性。為了防止生物制品在冷凍干燥和貯藏過程中活性組分的變性，研究者們研究和探索了大量有效的保護添加劑。第7頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月5.2冷凍干燥保護添加劑的分類按分子量分類

低分子量化合物：又可以分為酸性物質、中性物質和堿性物質。酸性物質主要為谷氨酸、天冬氨酸、蘋果氨酸、乳酸等；中性物質主要為葡萄糖、肌醇、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山梨醇D、L-蘇氨酸、肌醇、木糖醇等；堿性物質主要為精氨酸和組氨酸等。高分子化合物：主要如白蛋白、明膠、蛋白胨、可溶性淀粉、糊精、肉汁、果膠、阿拉伯膠、羥甲基纖維素、藻類等以及天然混合物如脫脂牛奶、血清等。一般認為，低分子化合物在凍干過程中直接發(fā)揮作用；而高分子化合物則是促進低分子化合物的保護作用。因此，制備保護劑配方時，一般多將低、高分子化合物配合使用。第8頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月按保護劑功能和性質分類

凍干保護劑（lyoprotectant）：在凍結和干燥過程中，可以防止活性組分發(fā)生變性的物質，如甘油、二甲亞砜（DMSO）、海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等；填充劑（bulkingagent，bulkingcompound）：能防止有效組分隨水蒸氣一起升華逸散，并使有效組分成形的物質，如甘露醇、乳糖、明膠等；抗氧化劑（antioxidant）：用作防止生物制品在冷凍干燥過程以及貯藏過程中發(fā)生氧化變質的物質，如維生素D、維生素E、蛋白質水解物、硫代硫酸鈉等；酸堿調整劑（bufferagent,PHmodifier）：在冷凍干燥過程和貯藏過程中，能將生物制品的pH值調整到活性物質的最穩(wěn)定區(qū)域的物質，如磷酸、山梨醇、EDTA（乙二胺四醋酸二納）、氨基酸等。第9頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月按物質的種類分類糖/多元醇類(sugars/polyols)、聚合物類(polymers)、表面活性劑類(surfactants)、氨基酸類(aminoacids)鹽類(salts)第10頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月在冷凍干燥配方中，除了活性組分和溶劑以外，還要使用多種添加劑。這些添加劑，有的被稱為保護劑,有的被稱為添加劑，而又有的被稱為賦形劑（excipient），至今沒有統(tǒng)一的叫法。賦形劑一詞來源于藥劑學，原來是指構成藥物或抗原的無活性物質輔料(如阿拉伯膠、糖漿、淀粉)，特別是指在藥物混合物中有大量液體情況下，為使混合物有較高的粘性，以便制備丸劑或片劑而加入的物質。而后來，賦形劑的名稱被擴大了。根據文獻資料統(tǒng)計，“賦形劑”一詞在冷凍干燥配方中用得比較多。在生物制品的冷凍干燥配方中，有些賦形劑只能起到某一特定的作用；而有些賦形劑可以同時起到幾方面的作用。如PVP既可用作低溫保護劑，同時也可以用作填充劑。對保護劑在配方中具體起什么作用，有時很難嚴格區(qū)分開來。即使是同一種物質，在不同的凍干品也可能表現(xiàn)出不同的作用。

第11頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月5.3糖/多元醇類保護劑

1.糖和多元醇的定義

糖的主要組成元素是碳、氫、氧；而且其中氫和氧的比例總是2：1，恰好與水中氫和氧的比例相同，所以，糖類也被稱為碳水化合物（carbohydrate）。糖類一般可分為單糖、低聚糖和多糖三類。單糖是糖類中不能再水解的化合物，是最小分子的糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖等；低聚糖指能被水解成2-10個單糖分子的糖，主要有蔗糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖、棉子糖等；多糖指能被水解成更多的單糖和低聚糖的糖，主要有淀粉、纖維素、果膠等。含有兩個或兩個以上羥基的醇統(tǒng)稱為多元醇，又稱糖醇（sugaralcohol）。在生物制品的低溫凍結、解凍、冷凍干燥以及保存過程中，使用較多的是多元醇包括丙三醇（甘油）、山梨醇和甘露醇。由于糖和多元醇的官能團都是羥基，所以，它們用作低溫保護劑和冷凍干燥保護劑時，具有一定的共性。第12頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月2.單糖從理論上講，在生物制品的冷凍干燥過程中，如果糖類與生物制品活性組分的分子形成氫鍵而替代了原有水的位置，那么，它對這些生物制品就能夠提供保護作用。實驗證明，單糖（如葡萄糖、半乳糖）對蛋白質的冷凍干燥過程不能起到保護作用，這是因為單糖在凍結過程中只能提供非常微弱的穩(wěn)定作用，使得蛋白質在脫水干燥前就發(fā)生了不可逆變性。而相同濃度的海藻糖在凍結過程和脫水過程中卻都能提供有效的保護作用。目前的生物制品的冷凍干燥配方中，一般不單獨使用單糖作為保護劑，而是經常和其它賦形劑聯(lián)用。第14頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月3.低聚糖在許多生物制品的冷凍干燥過程中，常常采用低聚糖，尤其是二糖作為保護劑，這是因為二糖既能在凍結過程中起到低溫保護劑的功能；又能在干燥脫水過程中起到脫水保護劑的作用。二糖又分為還原性二糖和非還原性二糖，其中還原性二糖包括乳糖（lactose）、麥芽糖（maltose）等，非還原性二糖包括海藻糖（trehalose）和蔗糖（sucrose）等。就冷凍干燥過程而言，無論還原性二糖還是非還原性二糖都具有很好的保護效果，但在生物制品冷凍干燥后的貯藏過程中，由于還原性二糖的存在會使得凍干品發(fā)生Maillard反應（蛋白質褐變反應），最終導致凍干品發(fā)生變質。所以，在食品、藥品以及生物體的冷凍干燥配方中，蔗糖和海藻糖是最常用的兩種保護劑。第15頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月海藻糖的特異性海藻糖是一種天然糖類,是由特殊雙糖分子構成的非還原性糖，非常穩(wěn)定，能夠在高溫、高寒、干燥失水等惡劣的條件下在細胞表面形成特殊的保護膜，有效地保護生物分子結構不被破壞，從而維持生命體的生命過程和生物特征。第16頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月4.多元醇甘露醇為白色結晶粉末，無臭、味甜；在水中易溶，在乙醇、乙醚中幾乎不溶；熔點166-170℃，沸點290-295℃；在無菌溶液中較穩(wěn)定，不易被空氣氧化。在生物制品的冷凍干燥過程中，甘露醇一般用作填充劑，這是因為在慢速凍結時會結晶，從而為活性組分提供支撐結構；同時甘露醇也不會與活性組分發(fā)生反應。山梨醇是甘露醇的同分異構體，但其溶解度比甘露醇大，在常溫下呈粘稠狀透明液體，有旋光性；略有甜味，具有吸濕性，能溶解多種金屬，高溫下不穩(wěn)定。在冷凍干燥配方中，山梨醇一般用作填充劑。丙三醇又叫甘油，為無色透明的粘稠狀液體，無臭而有甜味，熔點17.9℃，沸點290℃；吸水性強，能從空氣中吸取水分；可以以任意比例與水、乙醇相混合，微溶于乙醚，不溶于苯、氯仿、四氯化碳和二硫化碳等有機溶劑，不溶于油脂。在冷凍干燥配方中，一般用作低溫保護劑。第17頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月5.糖/多元醇的濃度對保護效果的影響

糖/多元醇對生物制品冷凍干燥過程的保護效果與其添加的濃度直接相關。當糖/多元醇濃度提高到一定程度時，對蛋白質的穩(wěn)定作用能力可能達到了極限，過高的濃度甚至會使得冷凍干燥過程中蛋白質發(fā)生變性。

凍干PFK活性恢復率（%）海藻糖濃度（mM）海藻糖初始濃度對磷酸果糖激酶（PFK）的凍干保護效果的影響第18頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月5.4聚合物類保護劑

1.聚合物的定義

聚合物是指由簡單的小分子(稱為單體)，經過聚合反應，所形成的巨大分子。其分子量通常相當大，可能含數(shù)千到數(shù)十萬個原子。有的聚合物形成鏈狀,有的形成網狀。聚合物具有能提高生物制品混合溶液的玻璃化轉變溫度等有利因素，因而在有些生物制品的配方中常常加入多種聚合物類保護劑。聚合物類保護劑一般同時起著低溫保護劑和脫水保護劑的作用。其中，最典型的的聚合物類保護劑有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、牛血清（BSA）、右旋糖苷（dextran）、聚乙二醇（PEG）等。第19頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月2.常用聚合物類保護劑 在一般情況下，在生物制品冷凍干燥配方中添加的聚合物具有以下的性質：聚合物在凍結過程中優(yōu)先析出；具有一定的表面活性；在蛋白質分子之間產生位阻（sterichindrance）作用；提高溶液黏度；顯著提高玻璃化轉變溫度；抑制小分子賦形劑（如蔗糖）的結晶；抑制溶液pH的降低。第20頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月第21頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月聚乙烯吡咯烷酮（PVP）

常被用作澄清劑、色素穩(wěn)定劑和膠體穩(wěn)定劑。PVP對生物材料的低溫保存，和冷凍干燥，都是很好的保護劑。同時它在生物制品的脫水干燥過程中又是很好的填充劑，為生物制品提供很強的支撐作用。

牛血清白蛋白（BSA） 冷凍干燥粉末，常為白色或類白色；溶于水，其水溶液加熱至60-70℃時蛋白會凝固沉淀。牛血清在很低的濃度下就能起到很好的保護效果，其保護作用原理與PVP一樣。第22頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月右旋糖酐

右旋糖苷是若干葡萄糖分子脫水的聚合產物，又叫葡聚糖。其分子量各不相同，相對分子量50000-90000為中分子（如右旋糖苷70），25000-50000為低分子（如右旋糖苷40），10000-25000為小分子，＜10000為微分子。抑制冰晶的長大，提供冷凍穩(wěn)定性。右旋糖苷常被用作許多生物制品冷凍干燥的低溫保護劑。聚乙二醇（PEG）

乙二醇可與環(huán)氧乙烷作用生成聚乙二醇，聚乙二醇工業(yè)上用途很廣，可用作乳化劑、軟化劑、表面活化劑等。PEG在生物材料的低溫保存和冷凍干燥過程中也是很有效的低溫保護劑，其保護效果與PEG的分子量有關。在一定程度上，它的低溫保護能力遠遠大于其它低分子化合物（如蔗糖）。

第23頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月PEG與蔗糖對乳酸脫氫酶（LDH）的凍干保護能力

低溫保護劑濃度%（w/v）LDH活性恢復率（%）第24頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月5.5表面活性劑類、氨基酸類的保護劑

1.表面活性劑類的保護劑通常把凡是能降低界面張力的，由親水和親油基組成的化合物，稱為表面活性劑。它們分子中的碳氫鏈部分是造成溶于油的原因；而分子中的極性基（如-COOH，-OH）則對水有親和力。當這些分子處于空氣—水界面或油—水界面時，親水基會定位在水相，而親油基則指向氣相或油相。表面活性劑可分為離子型和非離子型兩大類。凡是溶于水時能電離成離子的，稱為離子型表面活性劑；否則，稱為非離子型表面活性劑。在生物制品的冷凍干燥全過程中，表面活性劑既能在凍結和脫水過程中降低冰水界面張力所引起的凍結和脫水變性；又能在復水過程中對活性組分起到潤濕劑和重褶皺劑的作用。第25頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月非離子型表面活性劑具有相對較低的臨界膠束濃度（CriticalMicelleConcentration,CMC），通常使用較低濃度就可以滿足保護效果。其中吐溫系列是最常用的非離子型表面活性劑。第26頁，課件共32頁，創(chuàng)作于2023年2月2.氨基酸類的保護劑

氨基酸是蛋白質的基本構成單位，其中最主要的是α-氨基酸。它是由一個氨基（-NH2）、一個羧基（-COOH）、一個氫原子（-H）和一個R基團（-R）連結在一個α碳原子所組成。α-氨基酸及其兩性離子的結構通式如下：氨基酸氨基酸的兩性離子由于氨基酸離子具有酸、堿兩性，因此能夠在生