基因工程的基本程序

基因工程的基本程序第1頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定第2頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月一、目的基因的獲取

目的基因主要是______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因

獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫(kù)中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成第3頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月1.從基因文庫(kù)中獲取目的基因1)基因文庫(kù)的概念:

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因。2)基因文庫(kù)的種類:基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)第4頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系第5頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月3)基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)某生物體內(nèi)全部DNA

許多DNA片段受體菌群體限制酶與運(yùn)載體連接導(dǎo)入基因組文庫(kù)cDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運(yùn)載體連接導(dǎo)入cDNA文庫(kù)某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNA第6頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月基因組文庫(kù)和部分基因組文庫(kù)(cDNA文庫(kù))比較怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因呢?第7頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性4)從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法第8頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月1、構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)時(shí)，首先應(yīng)分離細(xì)胞的A、染色體DNA

B、線粒體DNAC、總mRNA

D、tRNA2、目的基因可從基因文庫(kù)中獲得，下列有關(guān)基因文庫(kù)的描述正確的是A、某生物的全套基因就是一個(gè)基因文庫(kù)B、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導(dǎo)入某個(gè)生物體內(nèi)，則這個(gè)生物就是一個(gè)基因文庫(kù)C、含有一種生物所有基因的基因文庫(kù)叫做基因組文庫(kù)D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫(kù)叫cDNA文庫(kù)AC第9頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第10頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。第11頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月

以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n方式

使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增結(jié)果原理：DNA雙鏈復(fù)制PCR技術(shù)第12頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月前提：原料PCR擴(kuò)增儀一段已知目的基因的核苷酸序列模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）第13頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)的操作過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加___倍一第14頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制PCR技術(shù)場(chǎng)所原理?xiàng)l件解旋方式酶特點(diǎn)結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再?gòu)?fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶等第15頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月反轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA目的基因化學(xué)合成法肽鏈氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推測(cè)推測(cè)單鏈DNA合成3.人工合成—化學(xué)合成法基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀人工合成第16頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月3、在遺傳工程中，若有一個(gè)控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTG／TACAC，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術(shù)進(jìn)行人工復(fù)制，復(fù)制時(shí)應(yīng)給予的條件是①雙鏈DNA分子為模板②ATGTG或TACAC模板鏈③四種脫氧核苷酸④四種核苷酸⑤DNA聚合酶⑥熱穩(wěn)定DNA聚合酶⑦引物⑧溫度變化⑨恒溫A．①③④⑦⑨B．①④⑥⑦⑧C．②⑤⑥⑦⑨D．①③⑥⑦⑧D第17頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月4、在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，其中腺嘌呤脫氧核苷酸是460個(gè)）放入DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增4代，那么，在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個(gè)數(shù)是A.540個(gè) B.8100個(gè) C.17280個(gè) D.7560個(gè)B1000個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，即2000個(gè)核苷酸。由于A=T=460個(gè)，所以，C=G=540個(gè)。所以，一個(gè)目的基因有胞嘧啶脫氧核苷酸540個(gè)。擴(kuò)增4代可產(chǎn)生16個(gè)DNA分子，根據(jù)DNA半保留復(fù)制原則，其中有一個(gè)DNA分子“相當(dāng)”于親代的DNA。所以，在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸數(shù)為（16-1）*540=8100個(gè)。第18頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月5、在已知序列信息的情況下，獲取目的基因的最方便方法是A、化學(xué)合成法

B、基因組文庫(kù)法C、cDNA文庫(kù)法

D、聚合酶鏈反應(yīng)6、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是①?gòu)幕蛭膸?kù)中獲取目的基因②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因③反轉(zhuǎn)錄法④通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③AD第19頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

——基因工程的核心1、目的：所需物質(zhì)：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。它們各自的作用是什么?第20頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月2、基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因它們各自的作用是什么?第21頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來第22頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意第23頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月基因表達(dá)載體除含有目的基因外，還需要以下元件：1、啟動(dòng)子2、終止子3、標(biāo)記基因第24頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月

已知標(biāo)記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基因，現(xiàn)探討某細(xì)菌的質(zhì)粒中有無標(biāo)記基因或標(biāo)記基因是什么？請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并得出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。對(duì)照組：不添加抗生素實(shí)驗(yàn)組1：添加一定濃度的四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組2：添加一定濃度的氨芐青霉素實(shí)驗(yàn)組3：添加一定濃度的四環(huán)素和氨芐青霉素練習(xí)第25頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組1實(shí)驗(yàn)組2實(shí)驗(yàn)組3結(jié)論預(yù)期一＋＋＋＋預(yù)期二＋＋－－預(yù)期三＋－＋－預(yù)期四＋－－－對(duì)照組：不添加抗生素實(shí)驗(yàn)組1：添加一定濃度的四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組2：添加一定濃度的氨芐青霉素實(shí)驗(yàn)組3：添加一定濃度的四環(huán)素和氨芐青霉素既含有抗四環(huán)素基因也含有抗氨芐青霉素基因只含有抗四環(huán)素基因只含有抗氨芐青霉素基因既不含有抗四環(huán)素基因也不含有抗氨芐青霉素基因第26頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月基因表達(dá)載體除含有目的基因外，還需要以下元件：1、啟動(dòng)子2、終止子3、標(biāo)記基因第27頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月三.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.轉(zhuǎn)化：2.方法：將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)第28頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：易感染雙子葉植物和裸子植物對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：

Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法第29頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月③過程：適用于雙子葉植物裸子植物第30頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月原理：染色體的DNATi質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上第31頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中有二次拼接和二次導(dǎo)入。第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒上TDNA的中間部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的TDNA被拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的TDNA進(jìn)入受體細(xì)胞。第32頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月

因?yàn)閯?dòng)物體細(xì)胞的全能性受到一定限制，故一般將目的基因?qū)雱?dòng)物的受精卵或卵細(xì)胞，而不是體細(xì)胞；而植物體細(xì)胞的全能性相對(duì)容易表達(dá)，故一般將目的基因?qū)胫参锏捏w細(xì)胞，然后再通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植株。第33頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）基因槍法:適用于單子葉植物（3）花粉管通道法適用于被子植物第34頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①方法：顯微注射法②程序：目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動(dòng)物第35頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①原核生物特點(diǎn)：

繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少②方法：用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子在低滲氯化鈣溶液中，便會(huì)造成細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)。如大腸桿菌經(jīng)CaCl2處理，成為容易受質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。第36頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月

四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少。目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？不一定，需要檢測(cè)第37頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月1、鑒定——分子水平的鑒定轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：指用熒光或放射性同位素標(biāo)記的DNA分子方法——DNA分子雜交技術(shù)(DNA和DNA之間)變性變性第38頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月基因探針---是一段帶有檢測(cè)標(biāo)記，且序列已知的，與目的基因互補(bǔ)的核酸序列。基因探針通過分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號(hào)，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來。

根據(jù)雜交原理，作為探針的核酸序列至少必須具備以下兩個(gè)條件：①應(yīng)是單鏈，若為雙鏈，必須先行變性處理。②應(yīng)帶有容易被檢測(cè)的標(biāo)記。

基因探針來源有3種：一種來自基因組中有關(guān)的基因本身，稱為基因組探針,另一種是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄得到的探針，還可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補(bǔ)的DNA片段稱為寡核苷酸探針第39頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月？

為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，要對(duì)探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào)。（通常采用同位素放射性標(biāo)記，如用放射性同位素32P標(biāo)記探針的核苷酸的磷酸基或用熒光標(biāo)記等）探針為什么需帶有一定的標(biāo)記第40頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月基因探針有哪些用途？DNA探針可以用于病毒性肝炎的診斷，遺傳性疾病的診斷，可用于檢測(cè)飲用水病毒含量等。

具體方法：用一個(gè)特定的DNA片段制成探針，與被測(cè)的病毒DNA雜交，從而把病毒檢測(cè)出來。與傳統(tǒng)方法相比具有快速、靈敏的特點(diǎn)。傳統(tǒng)的檢測(cè)一次，需幾天或幾個(gè)星期的時(shí)間，精確度不高，而用DNA探針只需一天。據(jù)報(bào)道，能從1噸水中檢測(cè)出10個(gè)病毒來，精確度大大提高第41頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月用目的基因作為基因探針，與待測(cè)DNA混合，若出現(xiàn)雜交帶，說明二者互補(bǔ)?？梢宰C明目的基因?qū)氤晒?。?2頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月下列有關(guān)“基因探針”的敘述，最恰當(dāng)?shù)氖牵ǎ〢．基因探針的工作原理是堿基互補(bǔ)配對(duì)B．待測(cè)的DNA分子首先要解旋變?yōu)閱捂?，才可用基因探C．基因探針技術(shù)可用于疾病診斷和環(huán)境監(jiān)測(cè)D．以上都正確A對(duì)，基因探針的工作原理就是利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行工作；B對(duì)，待測(cè)DNA分子必須是單鏈，才能與探針進(jìn)行堿基配對(duì)；C對(duì)，這是基因探針的用途。針測(cè)序第43頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月1、鑒定——分子水平的鑒定變性方法——分子雜交技術(shù)(DNA和mRNA之間)（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA第44頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月1、鑒定——分子水平的鑒定提?。?）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)第45頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月

第一步，將目的基因在大腸桿菌中表達(dá)出蛋白質(zhì)；

第二步，將表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動(dòng)物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出抗體（一抗）；

第三步，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，走凝膠電泳；

第四步，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；

第五步，將抗體（一抗）與硝酸纖維素膜上的蛋白雜交，這時(shí)抗體（一抗）與目的基因表達(dá)的蛋白（抗原）會(huì)特異結(jié)合。

由于這種抗原—抗體的結(jié)合顯示不出條帶，所以加入一種稱為二抗的抗體，它可以與一抗結(jié)合，二抗抗體上帶有特殊的標(biāo)記。如果目的基因表達(dá)出了蛋白質(zhì)，則結(jié)果為陽性。

具體做法是：

第一步，將目的基因在大腸桿菌中表達(dá)出蛋白質(zhì)；

第二步，將表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動(dòng)物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出抗體（一抗）；

第三步，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，走凝膠電泳；

第四步，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；

第五步，將抗體（一抗）與硝酸纖維素膜上的蛋白雜交，這時(shí)抗體（一抗）與目的基因表達(dá)的蛋白（抗原）會(huì)特異結(jié)合。

由于這種抗原—抗體的結(jié)合顯示不出條帶，所以加入一種稱為二抗的抗體，它可以與一抗結(jié)合，二抗抗體上帶有特殊的標(biāo)記。如果目的基因表達(dá)出了蛋白質(zhì)，則結(jié)果為陽性。

第一步：將目的基因在大腸桿菌(或其他生物）中表達(dá)出蛋白質(zhì)；第二步，將表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動(dòng)物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出抗體（一抗）；

第二步：將表達(dá)出的蛋白質(zhì)（相當(dāng)于抗原）注射動(dòng)物進(jìn)行免 疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出抗體；

第三步，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，走凝膠電泳；

第三步，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，走凝膠電泳；

第三步：由于這種抗原—抗體的結(jié)合顯示不出條帶，所以加入一種稱為二抗的抗體，由于這種抗原—抗體的結(jié)合顯示不出條帶，由于這種抗原—抗體的結(jié)合顯示不出條由于這種抗原—抗體的結(jié)合顯示不出條由于這種抗原—抗體的結(jié)合從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)（相當(dāng)于抗原）與將抗體雜交，若目的基因表達(dá)翻譯成蛋白質(zhì)，這時(shí)抗體與目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)會(huì)特異結(jié)合，出現(xiàn)雜交帶。第46頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月2、鑒定——個(gè)體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。第47頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫(kù)利用PCR人工合成（反轉(zhuǎn)錄法、化學(xué)方法）構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：第48頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月第49頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月1、基因表達(dá)載體必要的元件除目的基因外，還需有_______、_______和_________2、檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入的方法________________；檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄的方法___________________;檢測(cè)目的基因是否翻譯的方法____________________作業(yè):金版P11--13第50頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的

處，DNA連接酶作用于

處。（填“a”或“b”）第51頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和

法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用

技術(shù)，該技術(shù)的核心是

和

。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的

作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè)，又要用

方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。第52頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月答案：（1）aa（2）基因槍法（花粉管通道法）（3）植物組織培養(yǎng)（1分）脫分化（去分化）再分化（4）耐鹽基因（目的基因）一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）第53頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月①基因組文庫(kù)的構(gòu)建（2）基因文庫(kù)的構(gòu)建方法通過對(duì)受體菌的培養(yǎng)而儲(chǔ)存基因第54頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月②cDNA文庫(kù)的構(gòu)建-----反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)第55頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月1)基因組文庫(kù)是指將某種生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組后，導(dǎo)入受體細(xì)菌的群體中儲(chǔ)存，這個(gè)群體就稱為該生物的基因組文庫(kù)。其目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因。一、目的基因的獲取基因組DNA限制酶基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝（一）從基因文庫(kù)中直接獲取1.基因文庫(kù)第56頁，課件共64頁，創(chuàng)作于2023年2月1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有