黃酮分離課件

第11章黃酮類化合物(2)Flavonoids----黃酮類的提取和分離1第十一章黃酮類化合物概述1黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)和分類2黃酮類化合物的理化性質(zhì)3黃酮類化合物的提取和分離4黃酮類化合物的檢識(shí)和結(jié)構(gòu)鑒定52黃酮類化合物的提取和分離原理：黃酮類化合物的溶解性和酸性

相似相溶與酸堿理論提?。很赵簶O性小的溶劑，如氯仿、乙醚、乙酸乙酯等回流提取苷及極性大的苷元：

用丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、醇-水加熱提取極性稍大的甙元一般指：羥基黃酮、雙黃酮、橙酮、查爾酮多糖苷類：一般用沸水提取

提取3黃酮類化合物的提取和分離溶劑萃取法（系統(tǒng)分離法）堿提酸沉法炭粉吸附法

粗分4黃酮類化合物的提取和分離藥材水或醇-水，加熱提取提取液濃縮，加3-4倍醇醇水液沉淀（水雜）濃縮，回收醇，加水水液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取石油醚層氯仿層乙酸乙酯層正丁醇層水層葉綠素等脂溶性成分黃酮苷元大極性苷元小極性的苷黃酮苷多糖蛋白質(zhì)原理：利用黃酮類與其它雜質(zhì)極性不同，選不同溶劑進(jìn)行萃取溶劑萃取法5黃酮類化合物的提取和分離原理：活性炭吸附黃酮苷類化合物用途：主要用于含量較高的黃酮苷類的精制操作：植物的甲醇提取物中，分次加入活性炭，攪拌，靜置，定性檢查上清液無黃酮反應(yīng)時(shí)為止。過濾，收集活性炭，依次用沸水、沸甲醇、7%酚/水、15%酚/醇溶劑進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)各部分洗脫液進(jìn)行定性檢查。大部分黃酮苷類可以用7%酚/水洗下?；钚蕴课椒?黃酮類化合物的提取和分離

極性氫鍵分子大?。浚┧嵝蕴厥饨Y(jié)構(gòu)硅膠聚酰胺凝膠梯度pH萃取法金屬鹽絡(luò)合法柱色譜法分離方法8黃酮類化合物的提取和分離硅膠是一種高活性吸附材料，其化學(xué)分子式為mSiO2·nH2O

應(yīng)用范圍：主要分離小極性和中等極性的化合物，應(yīng)用最為廣泛。異黃酮、二氫黃酮（醇）、高度甲基化（乙?；┑狞S、酮及黃酮醇多羥基黃酮、黃酮醇及其苷類：硅膠加水去活化吸附規(guī)律：

極性大吸附能力強(qiáng)eg：A苷元B二糖苷C單糖苷

Rf：A>C>B硅膠柱色譜9黃酮類化合物的提取和分離原理：氫鍵吸附（作用）洗脫規(guī)律：（先—后）母核上羥基增加，洗脫順序遞減羥基數(shù)目相同時(shí)，有締合羥基>無締合羥基苷元相同：三糖苷>雙糖苷>單糖苷>苷元

不同類型黃酮類化合物的洗脫先后順序?yàn)椋?/p>

異黃酮＞二氫黃酮醇＞黃酮＞黃酮醇。分子中芳香程度高、共軛雙鍵多，則聚酰胺對(duì)其的吸附力強(qiáng)，故難于洗脫。應(yīng)用范圍：適合各種類型的黃酮類化合物，包括苷、苷元、查耳酮及二氫黃酮聚酰胺柱色譜10正相與反相層析硅膠固定相（硅醇）極性>流動(dòng)相（醇）極性時(shí)為正相聚酰胺固定相（聚酰胺脂肪鏈）極性<流動(dòng)相（醇水）極性時(shí)為反相槲皮素對(duì)照品槲皮素蘆丁蘆丁對(duì)照品槲皮素對(duì)照品槲皮素蘆丁蘆丁對(duì)照品聚酰胺TLC硅膠TLC11黃酮類化合物的提取和分離常用型號(hào)：Sephadex-G和Sephadex-LH20原理：吸附作用和分子篩對(duì)游離黃酮，主要是吸附作用,吸附程度取決于游離酚羥基的數(shù)目，苷元的羥基數(shù)目越多，越難洗脫。對(duì)黃酮苷，主要是分子篩原理,洗脫時(shí)按分子量由大到小先后洗脫下來。常用洗脫劑：堿性水溶液（0.1mol/LNH4OH），鹽水溶液(0.05mol/LNaCl)

醇及含水醇，如甲醇，甲醇-水，乙醇等。其它溶劑：含水丙酮、甲醇-氯仿(凝膠會(huì)膨脹，體積變大)。葡聚糖凝膠柱色譜12黃酮類化合物的提取和分離規(guī)律：苷元的羥基數(shù)越多，Ve/Vo越大，越難以洗脫。

吸附作用苷的分子量越大,其上聯(lián)結(jié)糖的數(shù)目越多,Ve/Vo越小,容易洗脫。

分子篩原理苷比苷元先洗脫。葡聚糖凝膠柱色譜13黃酮類化合物的提取和分離原理：黃酮類化合物具有酸性、且不同數(shù)目和不同位置的酚羥基的酸性強(qiáng)弱不同適用范圍：適用于分離酸性強(qiáng)弱不同的黃酮苷元酸性：7,4′-OH＞7-或4′-OH＞一般酚OH＞5-OH溶于5%NaHCO3溶于5%NaCO3溶于不同濃度NaOH梯度pH萃取法14黃酮類化合物的提取和分離乙醚液（脂雜）乙醚液乙醚液乙醚液乙醚液堿液(3或5-OH黃酮)堿液(一般酚OH黃酮)堿液(7,4’-二OH黃酮)堿液(7或4’-OH黃酮)5%NaHCO35%Na2CO30.2%NaOH4%NaOH梯度pH萃取法15黃酮類化合物的提取和分離原理：利用分子中某些特定官能團(tuán)性質(zhì)進(jìn)行分離具有鄰二酚羥基的成分，用醋酸鉛沉淀不具有鄰二酚羥基的成分，用堿式醋酸鉛沉淀

具有鄰二酚羥基的黃酮類化合物還可以與硼酸反應(yīng)形成溶于水的硼酸絡(luò)合物，可以與不具有鄰二酚羥基的其它黃酮類化合物分離金屬鹽絡(luò)合法16第十一章黃酮類化合物概述1黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)和分類2黃酮類化合物的理化性質(zhì)3黃酮類化合物的提取和分離4黃酮類化合物的檢識(shí)和結(jié)構(gòu)鑒定517黃酮類化合物的檢識(shí)和結(jié)構(gòu)鑒定

一色譜法的應(yīng)用

二紫外光譜

三1H-NMR

四13C-NMR

五質(zhì)譜18黃酮類化合物的檢識(shí)顏色：多呈黃色母核檢識(shí)：鹽酸-鎂粉反應(yīng)黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇

四氫硼鈉反應(yīng)二氫黃酮（醇）類取代基團(tuán)檢識(shí)：鋯鹽-枸櫞酸反應(yīng)

3-OH、5-OH黃酮鑒別氨性氯化鍶反應(yīng)鄰二酚羥基色譜檢識(shí):硅膠TLC聚酰胺TLC紙色譜（PC）理化檢識(shí)19黃酮類化合物的檢識(shí)和結(jié)構(gòu)鑒定硅膠TLC：

用于分析與鑒定弱極性黃酮類化合物。展開劑：甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5:4:1)，苯-甲醇，氯仿-甲醇等。聚酰胺TLC：

適合于含游離酚OH的黃酮及其苷類的分析。

聚酰胺對(duì)黃酮類化合物吸附能力強(qiáng)，大多數(shù)展開劑中含有醇、酸或水。紙色譜（PC）：適用于各種黃酮類化合物及其苷類的分析色譜法20黃酮類化合物的檢識(shí)和結(jié)構(gòu)鑒定第一相展開采用醇性展開劑如:BAWn-BuOH:HOAc:H2O=4:1:5上層TBAt-BuOH:HOAc:H2O=3:1:1水飽和n-BuOH色譜行為:Rf值:苷元>單糖苷>雙糖苷一般:苷元在0.70以上，而苷則小于0.7。分配作用第二相展開采用水性展開劑

如：2~6%HOAc水溶液3%NaCl水溶液HOAc:濃HCl:H2O=30:3:10色譜行為:連接糖鏈越長(zhǎng),Rf越大(>0.5);苷元Rf較小，有的留在原點(diǎn)。吸附作用ABCDABCD苷元苷元紙色譜21雙向PC

第I向醇性展開劑第II向水性展開劑（BAW、TBA、水飽和正丁醇）（2~8%HAc、3%NaCl、1%HCl）

正相色譜反相色譜固定相（水）極性>流動(dòng)相

Rf規(guī)律：極性小的化合物Rf大極性大的化合物Rf大

苷元（0.7以上）>單糖苷>雙糖苷（0.7以下）苷元中，平面型分子>非平面型分子Rf規(guī)律與左邊相反母核相同，2-OH>3-OH>4-OH>5-OH黃酮苷元的分離鑒別黃酮苷及花色素類22黃酮類化合物的檢識(shí)和結(jié)構(gòu)鑒定紙色譜（PC）：采用雙向紙色譜。

苷元:

平面型分子:

黃酮(醇)、查耳酮的Rf小,幾乎留在

原點(diǎn)不動(dòng)(Rf<0.02);

非平面型分子:

二氫黃酮(醇)、二氫查耳酮的Rf大,

因親水性較強(qiáng)(Rf0.10-0.30)。

色譜檢查方法：

①觀察熒光,用紫外光燈照射看到有色斑點(diǎn)，NH3處理

產(chǎn)生明顯的色變。

②用2%AlCl3甲醇液噴霧,UV燈下呈亮黃色熒光斑點(diǎn)。紙色譜23黃酮類化合物結(jié)構(gòu)鑒定一般步驟：1待測(cè)樣品在甲醇中的UV光譜2待測(cè)樣品在甲醇中加入各種診斷試劑后的UV光譜

診斷試劑：NaOCH3,NaOAc,NaOAc/H3BO3,AlCl3,AlCl3/HCl3苷類水解后的UV光譜。UV24黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定苯甲?；鶐I：220~280nm桂皮?；鶐：300~400nmUV25兩者UV光譜圖形相似，但帶I位置不同。整個(gè)母核上氧取代程度越高，則帶I將向長(zhǎng)波方向位移（紅移）。

不同類型黃酮的UV基本特征a.b.

黃酮黃酮醇26帶II吸收峰為主峰，

帶I很弱，常在主峰的長(zhǎng)波方向有一肩峰。c.

d.不同類型黃酮的UV基本特征245-270nm270-295nm異黃酮、二氫黃酮二氫黃酮醇27共同特征是帶I很強(qiáng)，為主峰而帶II則較弱，為次強(qiáng)峰。帶I的位置不同。e.f.不同類型黃酮的UV基本特征查耳酮橙酮類28不同類型黃酮的UV基本特征峰形帶II（240~285nm，苯甲酰系統(tǒng)）帶I（300~400nm，桂皮酰系統(tǒng)）類型取代240-285304-350黃酮類OH取代可以使相應(yīng)的帶I或II紅移，Ｂ環(huán)具有３’,4’羥基，帶II為雙峰328-385黃酮醇類（3-OR）352-385黃酮醇類（3-OH）245-270300-400異黃酮類B環(huán)OH和OMe對(duì)帶I影響不大270-295二氫黃酮220-270340-390查爾酮類2’-OH使帶I紅移370-430橙酮類帶I有3-4個(gè)小峰29診斷試劑在結(jié)構(gòu)測(cè)定中的應(yīng)用常用的診斷試劑：

甲醇鈉(NaOCH3)醋酸鈉(NaOCOCH3)醋酸鈉/硼酸(NaOCOCH3/H3BO3)三氯化鋁(AlCl3)三氯化鋁/鹽酸(AlCl3/HCl)30診斷試劑在結(jié)構(gòu)測(cè)定中的應(yīng)用1.NaOMe：堿性強(qiáng)，酚OH易形成鈉鹽。PhOHPhO-Na+，從而增加電子云密度和流動(dòng)性紅移。2.NaOAc：

未熔融:堿性較弱，只能使黃酮母核上酸性較強(qiáng)的酚OH解離而使UV譜紅移。

熔融：堿性,表現(xiàn)出與NaOMe類似的效果。31診斷試劑在結(jié)構(gòu)測(cè)定中的應(yīng)用3.NaOAc/H3BO3：用于鑒定鄰二酚OH。在醋酸鈉堿性下，鄰二酚OH與硼酸絡(luò)合，引起峰帶紅移。32診斷試劑在結(jié)構(gòu)測(cè)定中的應(yīng)用4.AlCl35.AlCl3/HCl：

分子中有3-OH，5-OH，鄰二酚OH時(shí)，可與Al3+絡(luò)合，引起吸收峰紅移。鋁絡(luò)合物穩(wěn)定性：

黃酮醇3-OH＞黃酮5-OH＞二氫黃酮5-OH＞鄰二酚OH＞二氫黃酮醇3-OH33診斷試劑對(duì)黃酮類化合物UV譜圖的影響及結(jié)構(gòu)的關(guān)系診斷試劑帶II帶I歸屬NaOCH3紅移40-60nm,強(qiáng)度不降示有4’-OH紅移50-60nm,強(qiáng)度下降示有3-OH,

但無4’-OH吸收譜隨時(shí)間延長(zhǎng)而衰退示有對(duì)堿敏感的取代方式NaOAc（未熔融）紅移5-20nm在長(zhǎng)波一側(cè)有明顯肩峰示有7-OH示有4’-OH，但無3或7-OHNaOAc（熔融）紅移40-65nm強(qiáng)度下降示有4’-OH吸收譜隨時(shí)間延長(zhǎng)而衰退示有對(duì)堿敏感的取代方式34診斷試劑帶II帶I歸屬NaOAc/H3BO3紅移5-10nm示A環(huán)有鄰二酚羥基，但不包括5,6-二羥基紅移12-30nm示B環(huán)有鄰二酚羥基AlCl3及AlCl3/HClAlCl3/HCl譜圖

=AlCl3譜圖

示結(jié)構(gòu)中無鄰二酚羥基AlCl3/HCl譜圖

≠AlCl3譜圖

示結(jié)構(gòu)中可能有鄰二酚羥基帶I或Ia紫移30-40nm示B環(huán)有鄰二酚羥基帶I或Ia紫移50-65nm示A、B環(huán)上均有鄰二酚羥基AlCl3/HCl譜圖

=CH3OH譜圖

示