第九章生物大分子的分離與純化技術(shù)

第九章生物大分子的分離與純化技術(shù)2023/7/171第1頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第九章生物大分子的分離與純化技術(shù)9.1概述

生物大分子是指蛋白質(zhì)(包括酶)、多聚糖和核酸類化合物，一般分子量從幾千到幾百萬(wàn)。它們廣泛存在于各種生物體內(nèi)，與各種生命活動(dòng)息息相關(guān)。除了天然存在的外，還有生物工程培養(yǎng)和發(fā)酵的。生物大分子具有十分重要的生理功能和應(yīng)用價(jià)值。研究生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用已成為生命科學(xué)的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。蛋白質(zhì)藥物及其他生物制品在醫(yī)藥方面有著十分重要的應(yīng)用前景。不論從動(dòng)植物和微生物體內(nèi)提取或用生物工程制備的生物大分子產(chǎn)品，都是組成十分復(fù)雜的混合物，在使用前都要分離和純化。2023/7/172第2頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.1.1生物大分子分離純化的特殊性1、要求產(chǎn)品保持其生物活性，也就是說(shuō)要避免不可逆結(jié)構(gòu)變化發(fā)生。2、多孔填料必須使用大孔徑基質(zhì)。3、生物大分子的色譜特性常不同于有機(jī)小分子。所以在選擇色譜條件時(shí)不能隨便套用小分子的條件。2023/7/173第3頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.1.2生物大分子分離技術(shù)本章以下的方法主要以蛋白質(zhì)及酶為分離對(duì)象。2023/7/174第4頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.2蛋白質(zhì)的反相色譜（RPC）9.2.1分離機(jī)理蛋白質(zhì)的反相色譜中：①用C4～C8烷基作配基（將配基鍵合在固定基質(zhì)上作為固定相）為固定相，以水溶性有機(jī)溶劑（如甲醇、乙腈、異丙醇）加強(qiáng)酸作流動(dòng)相（流動(dòng)相極性大于固定相）。②蛋白質(zhì)分子中既有親水性基團(tuán)（-OH，-NH、-COOH、SH等），也有疏水性基團(tuán)（如苯環(huán)、-CH3、-CH2和-CH等）。③在水溶液中，疏水性基團(tuán)有避開(kāi)水而親合其他疏水性基團(tuán)的傾向，即溶質(zhì)分子的非極性部分在水中傾向于與水的接觸面減小，促進(jìn)了其與填料（疏水性配基）的親合。④不同的蛋白質(zhì)在相同流動(dòng)相中由于疏水基團(tuán)多少、種類以及表面分布情況不同，與填料的親合力也不同，從而得到分離。結(jié)果：疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)親合力大，出峰遲；疏水性小的蛋白質(zhì)就容易被洗脫。

2023/7/175第5頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.2.2色譜條件①固定相：常用C4

～C8鏈烴作為配基（鍵合在固體基質(zhì)上）為填料?？讖?5～50nm。②流動(dòng)相：水溶性有機(jī)溶劑（B液）（甲醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃）＋水（A液）＋強(qiáng)酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸）洗脫能力增大加酸作用：∵－SiOH==－SiO-

＋H+

蛋白質(zhì)易與—SiO-結(jié)合很難洗脫，加酸抑制上述平衡向右離解。減小蛋白質(zhì)的疏水性，使其保留減弱，易被洗脫。③溫度：常溫2023/7/176第6頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月④檢測(cè)：用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm和220nm。280nm檢測(cè)中含有含苯環(huán)的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的蛋白質(zhì)，一般蛋白質(zhì)都含有苯環(huán)，所以280nm檢測(cè)是普遍使用的波長(zhǎng)。

220nm主要檢測(cè)肽鍵；所以所有蛋白質(zhì)普遍適用。核酸可在260nm檢測(cè)。⑤洗脫方式：梯度洗脫——逐漸增加洗脫強(qiáng)度。

有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)在反相色譜中的洗脫曲線不一樣。以B液的百分含量和蛋白質(zhì)的容量因子k′作圖，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在圖上有一突躍。即在某一區(qū)間內(nèi)，B液含量的一個(gè)較小的變化會(huì)引起某個(gè)蛋白質(zhì)容量因子很大的變化。在此區(qū)間內(nèi)B液一個(gè)小的增大使k′很快減小，使蛋白質(zhì)從基本上不移動(dòng)到很快洗脫下來(lái)。不同蛋白質(zhì)到達(dá)這突躍區(qū)時(shí)所需B液的濃度不同，從而可以得到分離。蛋白質(zhì)的分離一般就需要用梯度洗脫，否則有些蛋白質(zhì)已達(dá)到突躍會(huì)很快被洗脫下來(lái)，有些蛋白質(zhì)還遠(yuǎn)離突躍區(qū)，實(shí)際上無(wú)法被洗脫。而有機(jī)小分子的反相色譜中未發(fā)現(xiàn)此種突躍現(xiàn)象。實(shí)際工作中梯度洗脫時(shí)間約為20～60min，B液的變化速度約為每分鐘5%～15%。2023/7/177第7頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.2.3應(yīng)用最大優(yōu)點(diǎn)：分離度最高；最大缺點(diǎn)：容易使蛋白質(zhì)變性失活。例子：人的膠原蛋白I型α1和α2鍵的色譜分離圖9-1人的膠原蛋白I型α1和α2鍵的色譜分離2023/7/178第8頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.3疏水相互作用色譜概念：用適度疏水性的配基作固定相，以鹽水體系作流動(dòng)相，用疏水作用來(lái)分離生物大分子化合物的液相色譜法，叫疏水相互作用色譜(HydrophobicInteractionChromatography,HIC)或疏水作用色譜。9.3.1分離原理在HIC中：固定相表面有疏水性基團(tuán)，（如-CH2，-CH3

，-ph等）。而蛋白質(zhì)分子是一個(gè)外部有一親水層包圍，內(nèi)部有疏水核的具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜體系。蛋白質(zhì)表面親水性很強(qiáng)，但也有一些疏水性的基團(tuán)，同時(shí)團(tuán)狀的蛋白質(zhì)還存在疏水基團(tuán)較多的裂隙。在不同的介質(zhì)中裂隙的伸展和收縮程度不同，從而使疏水基團(tuán)暴露的多少也不同。疏水色譜是利用鹽水體系中樣品組分的疏水基團(tuán)和固定相的疏水配基之間疏水作用力的不同而達(dá)到分離的目的。2023/7/179第9頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月配基和蛋白質(zhì)分子之間的吸附推動(dòng)力和樣品組分的洗脫機(jī)理（即：溶質(zhì)在色譜中的保留行為）：用“疏溶劑化理論”：蛋白質(zhì)與配基的結(jié)合是由于溶質(zhì)分子有一個(gè)減少其與水接觸的非極性表面的傾向，它們?cè)邴}水溶液中，兩個(gè)非極性的表面趨向于避開(kāi)水相而互相接觸。溶質(zhì)和疏水配基的結(jié)合是伴隨著它們非極性表面暴露在水中的面積的多少而進(jìn)行的。（即蛋白質(zhì)在鹽水體系中，有一傾向產(chǎn)生：避開(kāi)水相而吸附在固定相上?！呱镂镔|(zhì)界面自由能比水低，與表面自由能低的固定相產(chǎn)生親合力）在疏水作用色譜中，溶質(zhì)的容量因子K’與流動(dòng)相鹽濃度等因素的關(guān)系：討論可見(jiàn)：鹽的摩爾濃度增大，蛋白質(zhì)在HIC柱上的保留長(zhǎng)。2023/7/1710第10頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)論

疏水作用色譜中，蛋白質(zhì)在固定相上的保留性質(zhì)是四個(gè)可變因素綜合作用的結(jié)果。這四個(gè)因素是：樣品分子、填料、流動(dòng)相組成及性質(zhì)和溫度。2023/7/1711第11頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.3.2填料由基質(zhì)和鍵合在基質(zhì)上的配基兩部分組成。（基質(zhì)＋配基）基質(zhì)：有“軟”、“硬”兩類，它們必須有25～100nm的內(nèi)孔徑或者有較大間隙的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（孔徑要大）。軟基質(zhì)：交聯(lián)瓊脂糖凝膠，交聯(lián)葡聚糖凝膠、高分子聚合物。硬基質(zhì)：主要是大孔徑硅膠。配基：是一些含氮和氧原子的中等疏水性基團(tuán)；

or是丁基、苯基這些疏水基團(tuán)鍵合在一個(gè)親水性表面。9.3.3色譜條件主要有：a.具有中等疏水性表面的填料；b.鹽析性鹽的水溶液為流動(dòng)相；c.紫外檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)220或280nm，核酸在260nm；d.流動(dòng)相pH值接近中性；e.由高鹽濃度到低鹽濃度的梯度洗脫，梯度時(shí)間20～60min；f.常溫或4℃下操作。2023/7/1712第12頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、流動(dòng)相的組成有A液和B液兩種。A液：疏水性濃鹽水溶液，并含有緩沖液作用的鹽以穩(wěn)定pH值。常用的A液為1.0～3.0mol/L(NH4)2SO4加0.01～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液；B液：稀的緩沖液，濃度與A液中的緩沖作用的鹽的濃度相等。常用的B液為0.01～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液。鹽有兩類。鹽析性鹽：使蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定，會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)自身間的疏水作用而析出，or促進(jìn)蛋白質(zhì)與配基之間的疏水作用而保留在柱上。不失活，溶解度減小。常用：(NH4)2SO4鹽溶性鹽：提高蛋白質(zhì)的水溶性，同時(shí)會(huì)使蛋白質(zhì)變性。如硫氰酸鹽、鹽酸胍等會(huì)。2023/7/1713第13頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、流動(dòng)相的pH值一般地pH4～8；常選pH7左右。3、溫度一般在常溫或低于常溫下操作。HIC中蛋白質(zhì)的保留對(duì)溫度較敏感。①在HIC體系中蛋白質(zhì)處在活性狀態(tài)，T↑使蛋白質(zhì)的團(tuán)狀結(jié)構(gòu)伸展，暴露出更多的疏水基團(tuán)，疏水作用增強(qiáng)，保留值增大。（其他色譜，T↑保留增大）②T↑傳質(zhì)加快，使保留減小。（對(duì)所有色譜均適用）

總之，在疏水色譜中，①比②大，∴T↑，保留增大。4、洗脫方式梯度洗脫。（高濃度鹽→低濃度鹽）2023/7/1714第14頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.3.4疏水作用色譜的應(yīng)用只用于生物大分子的分離，不用于有機(jī)小分子分離。優(yōu)點(diǎn)：首先是其色譜條件溫和，蛋白質(zhì)活性回收率高，一般都在85%以上。其次是不用有毒和昂貴的有機(jī)溶劑。第三是分離性能好。第四含高濃度鹽的樣品可以直接進(jìn)疏水作用色譜柱進(jìn)行分離。第五對(duì)生物工程產(chǎn)品的粗品可直接上樣，一次完成蛋白質(zhì)的初步分離、脫鹽和復(fù)性三個(gè)目的。2023/7/1715第15頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月例如：基因重組人干擾素r是一種基因工程產(chǎn)品，其粗品是7mol/L鹽酸胍溶液。干擾素在鹽酸胍溶液中處于可逆性失活狀態(tài)。因鹽濃度太高無(wú)法直接上其他柱，除去鹽酸胍后干擾素又容易析出來(lái)。若使用疏水作用色譜柱，將此樣品直接進(jìn)樣，既脫除了鹽酸胍，又達(dá)到了復(fù)性的效果。而且一步分離后，干擾素純度可達(dá)到90%。圖9-2IFN-r粗品的HIC分離2023/7/1716第16頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月疏水作用色譜與反相色譜的區(qū)別相同：蛋白質(zhì)與填料之間的保留是疏水力作用的結(jié)果。區(qū)別：填料不同（HIC，表面中等疏水性作為配基；RPC，表面是烷基C4－8等疏水性強(qiáng)的為配基。）疏水力不同（HIC，疏水作用較弱；RPC，強(qiáng)）。兩色譜中洗脫液主要成分不同（正是上面的差異引起的）∴在HIC中可以加入少量有機(jī)溶劑以增強(qiáng)流動(dòng)相的洗脫能力；在RPC中加入鹽來(lái)改變蛋白質(zhì)的保留值2023/7/1717第17頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.4親合色譜(AffinityChromatography)AC9.4.1親合色譜的原理AC是吸附色譜的一種。但溶質(zhì)的保留是一種特異的有選擇性的親合力。填料只是有選擇地對(duì)一種生物大分子或一類生物大分子有吸附，對(duì)其他物質(zhì)無(wú)吸附作用，洗脫時(shí)先被分離，分段洗脫或梯度洗脫再將生物大分子從填料上洗脫下來(lái)，從而達(dá)到分離目的。親合色譜填料：是在基質(zhì)上鍵合一個(gè)特殊的配基（配位體）制得。例如酶的底物、產(chǎn)物、抑制劑、輔酶、變構(gòu)效應(yīng)物，抗物的抗原，激素的結(jié)合蛋白等都可以作為配位體用于分離對(duì)應(yīng)的酶，抗體和激素。有些配體可以用于一類化合物的吸附分離。如伴刀豆球蛋白可以特異地吸附糖蛋白；三嗪染料作配基也會(huì)對(duì)某些蛋白質(zhì)有選擇性吸附。配體與分離對(duì)象的作用：是一種特異的生物親合力，是配體與被吸物之間范德華力、疏水力、靜電力和其他力的綜合作用的結(jié)果。這種綜合作用力是有選擇性的，只對(duì)一個(gè)或一類生物大分子起作用，對(duì)其他物質(zhì)不起作用。故AC選擇性很高。2023/7/1718第18頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.4.2填料（由基質(zhì)、間隔臂和配體三部分組成）AC填料的基質(zhì)：分兩類。一類為有機(jī)聚合物，用得最多的是多糖聚合物，如纖維素，交聯(lián)葡聚糖、交聯(lián)瓊脂糖等。還有聚丙烯酰胺也是一類常用的基質(zhì)。多糖基質(zhì)表面羥基密度大，易制得柱容大的填料，而且其表面羥基對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)非特異性吸附。但這類基質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度低，不耐高壓。第二類基質(zhì)是多孔玻璃和硅膠。這類基質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度高，但柱容較小，表面硅羥基的非特異性吸附難以完全克服。2023/7/1719第19頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.4.3實(shí)驗(yàn)技術(shù)1、裝柱柱子有玻璃柱和不銹鋼柱兩種。軟基質(zhì)填料裝在玻璃柱內(nèi)，用于常壓色譜。硅膠和多孔玻璃基質(zhì)填料可裝在不銹鋼柱內(nèi)用在高效液相色譜上。玻璃柱采用普通的濕法裝柱，溶劑應(yīng)不損害配體的活體，一般用緩沖溶液作分散劑來(lái)裝柱。不銹鋼柱一般采用勻漿法裝柱，但裝柱壓力要低一些。分散劑常用親水的醇類。2、洗脫方式

AC最常用的洗脫方式是分段洗脫，還有脈沖洗脫和梯度洗脫。分段洗脫的過(guò)程是：平衡柱子(平衡液)→上樣→平衡液洗滌→洗脫液洗下目標(biāo)蛋白→再生→平衡→第二次上樣脈沖洗脫是在平衡、上樣、洗滌后，用一段少量的洗滌液讓其象一條密集的脈沖帶流過(guò)柱子，以洗下某個(gè)特定的蛋白。2023/7/1720第20頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、流動(dòng)相（有平衡液和洗脫液兩種）平衡液：起平衡柱子和上樣后洗去不吸附的雜蛋白及其他雜質(zhì)的作用。其成分是稀鹽緩沖溶液。洗脫液：是使吸附在柱子上的蛋白質(zhì)解吸的流動(dòng)相。分：非特異性洗脫：利用洗脫液的組成、濃度、pH值和溫度的改變使蛋白質(zhì)與配體作用減弱而洗脫下來(lái)。特異性洗脫：利用一種對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)也有親合作用的游離配體使其與固定相上配體產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用把蛋白質(zhì)拉下來(lái)的洗脫。4、共價(jià)親合色譜一種特殊的AC。利用一種特殊的配體，與待純化的蛋白質(zhì)形成某種不太強(qiáng)的共價(jià)健，將蛋白質(zhì)固定在柱子上，待洗去雜蛋白后，用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法，將被固定的蛋白質(zhì)重新釋放出來(lái)。例如：2023/7/1721第21頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月硫醇—二硫化物交換色譜可以用來(lái)純化許多含硫醇的蛋白質(zhì)將谷胱甘肽[N2HCH(COOH)CH2CH2CONHCN(CH2SH)CONHCH2COOH]先鍵合到基質(zhì)上得到

(結(jié)構(gòu)見(jiàn)右)。簡(jiǎn)寫為：再與二吡啶基二硫化物反應(yīng)得到填料。含硫醇基的蛋白質(zhì)可牢固地固定在定固定相上，必須用含硫醇基的洗脫液將其洗脫下來(lái)，柱子還得用二吡啶基二硫化物再生。2023/7/1722第22頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5、其他色譜條件上樣體積流速溫度蛋白質(zhì)濃度的影響6、柱子的再生與保護(hù)再生：用洗脫液充分洗滌后即可再次進(jìn)樣。但是重復(fù)使用幾次后對(duì)目標(biāo)蛋白的吸附率常會(huì)降低。所以用2mol/LKCl加6mol/L尿素洗滌。保護(hù)：柱子平時(shí)應(yīng)保存在4℃。柱內(nèi)充滿稀緩沖溶液。為了防止細(xì)菌，液體可含萬(wàn)分之二的疊氮化鈉。2023/7/1723第23頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.4.4應(yīng)用親合色譜應(yīng)用于酶、蛋白質(zhì)等生物大分子的分離純化。例如：α淀粉酶的分離可以使硅膠為基質(zhì)、淀粉為配體的親合色譜柱來(lái)完成。以去離子水為平衡液，以0.15mol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH7.0作洗脫液，從工業(yè)粗酶中純化α淀粉酶，活性回收率為93.6%，純化后的比活提高了20倍。柱子壽命為600次以上。吸附容量4.6mg/g填料。色譜圖見(jiàn)右圖。圖9-3α淀粉酶的親合色譜分離2023/7/1724第24頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.5電泳分離技術(shù)電泳：帶電粒子在電場(chǎng)作用下向著與其自身所帶的電荷相反的電極的移動(dòng)。電泳技術(shù)：樣品以一支持物為載體，在一定的電解質(zhì)溶液中，各組分在電場(chǎng)的作用下，以不同的速度進(jìn)行遷移，從而得到分離。電泳技術(shù)分類：按支持物的不同，分為：凝膠電泳、紙上電泳和薄膜電泳等。按操作原理分為：一般電泳、等速電泳、等電聚焦電泳和免疫電泳等。對(duì)分離物的要求：在介質(zhì)中必須帶電。2023/7/1725第25頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.5.1凝膠電泳（主要介紹聚丙烯酰胺凝膠電泳）1、原理：不同帶電粒子在同一外加電場(chǎng)作用下泳動(dòng)的速度是不同的，泳動(dòng)度取決于帶電顆粒的性質(zhì)，顆粒所帶凈電荷越多、直徑越小，越接近球形、泳動(dòng)速度越大。此外，還與介質(zhì)PH值（蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，有一等電點(diǎn)，在不同pH值下所帶凈電荷的符號(hào)及數(shù)量均不同，∴在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率也就不同了。）、電場(chǎng)強(qiáng)度（電場(chǎng)強(qiáng)度越高，粒子泳動(dòng)速度越快。）、離子強(qiáng)度（介質(zhì)離子強(qiáng)度越大，粒子的泳動(dòng)越慢。一般在0.02～0.2之間。）、電滲等實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)。2、凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)由丙烯酰胺單體聚合成長(zhǎng)鏈，長(zhǎng)鏈之間用N,N-甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成多孔狀結(jié)構(gòu)?？椎拇笮】梢杂秒p丙烯酰胺的濃度來(lái)調(diào)節(jié)。濃度增大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的空隙（孔徑）減小。2023/7/1726第26頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月形

成

凝

膠

的

反

應(yīng)

式3、丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)①具有很高的分辨率。大小不同的分子在通過(guò)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的空隙泳動(dòng)時(shí)受到的阻力不同，大分子物質(zhì)受到的阻力比小分子的大。這樣就使聚丙烯酰胺凝膠電泳兼有分子篩和電泳的雙重功能，提高了分辨力。②凝膠空隙的大小可以人為地調(diào)節(jié)，以適應(yīng)不同分子量的樣品。③聚丙烯酰胺凝膠電泳中電滲現(xiàn)象很小。④凝膠機(jī)械強(qiáng)度較好，彈性大，易保存。⑤丙烯酰胺可以提得很純，不會(huì)污染樣品。2023/7/1727第27頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、連續(xù)與不連續(xù)平板凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳常用的是平板電泳儀。裝置見(jiàn)下圖

凝膠電泳分為：連續(xù)和不連續(xù)兩類。連續(xù)電泳：是指整個(gè)電泳系統(tǒng)所用的緩沖液、pH值和凝膠組成都相同。不連續(xù)電泳：是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液、pH值和凝膠。優(yōu)點(diǎn)：稀的蛋白質(zhì)樣品在電泳過(guò)程中被濃縮，提高了分辨力。

圖9-4連續(xù)(a)與不連續(xù)(b)平板凝膠電泳示意圖2023/7/1728第28頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5、SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳

原理：SDS—不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳是一個(gè)在緩沖液中加有SDS，并且樣品事先用含SDS的溶液作解離處理的電泳體系。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在過(guò)量的SDS溶液中加熱時(shí)，天然蛋白質(zhì)的球形狀態(tài)就變成線形。變性后的蛋白質(zhì)，幾乎是定量地1克蛋白質(zhì)結(jié)合1.4gSDS，使蛋白質(zhì)的亞基多肽帶上了大量的負(fù)電荷，也就是說(shuō)多肽的SDS復(fù)合物上單位量上的電荷相等，即電荷密度相等。在電場(chǎng)中這種電荷密度相等的粒子嚴(yán)格按照其分子的大小具有不同的流動(dòng)度。樣品按多肽分子量的大小分離，研究人員可以用已知分子量的樣品作對(duì)照測(cè)定未知物的肽鏈大小。2023/7/1729第29頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6、凝膠電泳的應(yīng)用廣泛用于分離蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子及其他帶電的有機(jī)物。①生物大分子的分離及分子量測(cè)定樣品組分在電泳中按照其帶電情況和分子大小不同而有不同的遷移率，在膠板上得到分離。在SDS不連續(xù)凝膠電泳中，樣品組分按分子量大小排列，分子量的對(duì)數(shù)與遷移率之間有一個(gè)線性關(guān)系。因此在電泳時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)分子量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣，可以測(cè)定未知樣的分子量。②樣品組分的回收凝膠電泳可以作μg級(jí)樣品的分離制備?；厥諛悠方M分的方法有：擴(kuò)散洗脫和電泳洗脫。2023/7/1730第30頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月9.5.2聚焦電泳（又叫等電點(diǎn)聚焦）用于分離具有不同等電點(diǎn)的物質(zhì)。不同蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或多肽放在一個(gè)通直流電而產(chǎn)生的一個(gè)pH梯度的體系中時(shí)，不同的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)作用下會(huì)向不同的方向移動(dòng)，并聚焦在相應(yīng)于其等電點(diǎn)的pH位置處，即為等電聚焦，或叫聚焦電泳。2023/7/1731第31頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月等電聚焦的特點(diǎn)是：分辨率高?？梢詫⒌入婞c(diǎn)相差0.01～0.02pH單位的蛋白質(zhì)分離開(kāi)。不管蛋白質(zhì)樣品加在什么部位，由聚焦作用使其總是聚焦到等電點(diǎn)處，所以很稀的樣品也可以進(jìn)行分離。這一點(diǎn)是其優(yōu)于一般電泳和色譜的地方。分離是依據(jù)等電點(diǎn)不同而進(jìn)行的，所以重現(xiàn)性很好。用于蛋白質(zhì)及多肽的分析及等電點(diǎn)的測(cè)定，也可以用于分離和制備。一般電泳中隨著時(shí)間加長(zhǎng)和泳動(dòng)距離的加大，物質(zhì)區(qū)帶因擴(kuò)散作用而加寬。等電聚焦中不存在這個(gè)問(wèn)題。缺點(diǎn)：樣品溶液要求無(wú)鹽。樣品組分分別聚焦在其等電點(diǎn)處，所以對(duì)于一些在其等電點(diǎn)處不溶或變性的蛋白質(zhì)此方法不適用。

2023/7/1732第32頁(yè)，課件共36頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、原理在有兩性載體的溶液中，通穩(wěn)定的直流電時(shí)，兩性載體會(huì)形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐漸增加的pH梯度。陽(yáng)極端兩性載體得到質(zhì)子帶正電，陰極端會(huì)失去質(zhì)子帶負(fù)電，帶電粒子在電場(chǎng)作用下向帶相反電荷的電極方向移動(dòng)。若一個(gè)等電點(diǎn)低的載體A由陰極移向陽(yáng)極時(shí)，會(huì)逐步失去負(fù)電荷而停止運(yùn)動(dòng)，所在位置即為其等電點(diǎn)。若另一個(gè)等電點(diǎn)比A稍高的物質(zhì)B向陽(yáng)極移動(dòng)時(shí)，在靠近A而不到A的位置處即會(huì)停止運(yùn)動(dòng)，這處即為B的等電點(diǎn)。B的等電點(diǎn)應(yīng)在A物靠陰極一側(cè)。在這樣一個(gè)穩(wěn)定的pH梯度場(chǎng)