分子發(fā)光分析法實(shí)用課件

分子發(fā)光分析法§5-1概述一、分子發(fā)光分析法及其分類某些物質(zhì)的分子吸收一定能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，以光輻射的形式從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光，在此基礎(chǔ)上建立起來的分析方法為分子發(fā)光分析法較高激發(fā)態(tài)基態(tài)吸收能量受激光輻射退激分子在退激過程中以光輻射形式釋放能量根據(jù)分子受激時(shí)所吸收能源及輻射光的機(jī)理不同分為以下幾類：光致發(fā)光：以光源來激發(fā)而發(fā)光

電致發(fā)光：以電能來激發(fā)而發(fā)光生物發(fā)光：以生物體釋放的能量激發(fā)而發(fā)光化學(xué)發(fā)光：以化學(xué)反應(yīng)能激發(fā)而發(fā)光—化學(xué)發(fā)光分析法熒光—熒光分析法磷光—磷光分析法二、分子發(fā)光分析法的特點(diǎn)1.靈敏度高熒光強(qiáng)度隨激發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)而增強(qiáng)（提高激發(fā)光強(qiáng)度，可提高熒光強(qiáng)度）

采用高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)可大大提高靈敏度，檢測(cè)限熒光分析法比分光光度法低2~4個(gè)數(shù)量級(jí)激發(fā)發(fā)射熒光強(qiáng)強(qiáng)激發(fā)光物質(zhì)2.選擇性好不同的物質(zhì)用不同的光進(jìn)行激發(fā)，選擇不同的激發(fā)光波長(zhǎng)不同的物質(zhì)發(fā)射的熒光不同，選擇不同的檢測(cè)熒光波長(zhǎng)比較容易排除其它物質(zhì)的干擾，選擇性好3.實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單4.待測(cè)樣品用量少；儀器價(jià)格適中；測(cè)定范圍較廣具發(fā)光強(qiáng)度可定量測(cè)定許多痕量的無機(jī)物和有機(jī)物，廣泛應(yīng)用在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)及農(nóng)牧產(chǎn)品分析、衛(wèi)生檢疫等領(lǐng)域。應(yīng)用還不夠廣泛，尚待拓寬。熒光法比磷光法應(yīng)用廣泛，但均不如分光光度法廣泛。許多物質(zhì)自身不會(huì)發(fā)射熒光（需衍生），且熒光分析對(duì)環(huán)境極為敏感：溫度、酸度、溶解氧、重金屬等均會(huì)產(chǎn)生影響或干擾。ii）量子效率足夠大：大多數(shù)含有酸性或堿性基團(tuán)的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受溶液pH的影響很大化學(xué)反應(yīng)必須產(chǎn)生足夠的化學(xué)能大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；05時(shí)，If與f、I0、和c有關(guān)，對(duì)一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度一定時(shí)，f、I0、ε和b為常數(shù)，合并為K沒食子酸、洛粉堿、過氧草酸鹽等。應(yīng)用還不夠廣泛，尚待拓寬。激發(fā)：excitated猝滅劑與熒光分子相互作用時(shí)發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移引起的猝滅。指激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用而轉(zhuǎn)移能量，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱或消滅（猝滅）3、可變波長(zhǎng)同步掃描熒光法合適的可減少光譜重疊：在430~440nm藍(lán)光照射下，發(fā)出綠色熒光，em=535nm下測(cè)I，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定利用魯米諾發(fā)光體系可以測(cè)定50余種元素和大量有機(jī)和無機(jī)化合物，靈敏度都比較高二、分子發(fā)光分析法的特點(diǎn)具有強(qiáng)熒光的分子多數(shù)有剛性平面結(jié)構(gòu)，可以減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減少，也減少了碰撞去活的可能性，熒光強(qiáng)度大。在刑偵學(xué)中的魯米諾反應(yīng)（LuminolTest），主要是指Luminol跟雙氧水和OH-離子間的反應(yīng)，血液中血紅素的鐵離子，是該反應(yīng)的催化劑。由于基團(tuán)的n電子（孤對(duì)電子）的電子云與苯環(huán)上的軌道平行，共享了共軛電子，擴(kuò)大了共軛體系，使熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)350分析速度快，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化§5-2分子熒光和分子磷光

molecularfluorescenceandphosphorescence一、熒光和磷光光譜的產(chǎn)生（一）激發(fā)過程具有不飽和基團(tuán)的基態(tài)分子光照后，價(jià)電子躍遷產(chǎn)生熒光和磷光

電子基態(tài)第一電子激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)動(dòng)能極躍遷振動(dòng)能級(jí)躍遷電子能級(jí)躍遷

在光致激發(fā)和去激發(fā)光的過程中，分子中的價(jià)電子（、n電子）處于不同的自旋狀態(tài)，通常用電子自旋狀態(tài)的多重性來描述1、光譜項(xiàng)的多重型：M＝2S+1（1）單重態(tài)M=2S+1＝1（自旋相反）S＝0分子能級(jí)=電子能級(jí)(Ee)+振動(dòng)能級(jí)(Ev)+轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)(Er)。S0,S1,S2,S3分別代表基態(tài),第一,二,三激發(fā)單重態(tài)（2）三重態(tài)M=2S+1＝3（自旋平行）S＝1T1、T2、T3分別表示第一、二、三激發(fā)三重態(tài)優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，造價(jià)低，體積小，靈敏度高等Ip＝KCA+B→C*+DC*+F→F*+EF*→F+h當(dāng)物質(zhì)受光照射時(shí)，基態(tài)分子吸收光能產(chǎn)生電子能級(jí)躍遷，由基態(tài)躍遷至更高的單重態(tài)，電子自旋方向沒有改變（相反），凈自旋=0，這種躍遷是符合光譜選律的允許躍遷，S0→S1（二）化學(xué)發(fā)光效率和發(fā)光強(qiáng)度三、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型磷光儀器在熒光儀樣品池上增加磷光配件：低溫杜瓦瓶和斬光片。靈敏度為1ng·mL-1大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)主要用于某些氣體的監(jiān)測(cè)，有專用的監(jiān)測(cè)儀。分立取樣式和流動(dòng)注射式化學(xué)發(fā)光儀例1：CO+O（原子氧）→CO2*CO2*→CO2+h（1）碰撞猝滅（動(dòng)態(tài)猝滅）衡量物質(zhì)發(fā)射熒光的能力——廣泛應(yīng)用于大氣污染監(jiān)測(cè)、可監(jiān)測(cè)空氣中的O3；由于各種去活化過程的存在，無論開始電子被激發(fā)至什么高能級(jí)，它都經(jīng)過無輻射去激消耗能量后到S1的最低振動(dòng)能級(jí)，熒光輻射能通常要比激發(fā)能量低，熒光波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)。吸光吸光熒光磷光速率極大，10-14~10-12s完成。2、處于基態(tài)的分子吸收能量后發(fā)生躍遷：當(dāng)物質(zhì)受光照射時(shí)，基態(tài)分子吸收光能產(chǎn)生電子能級(jí)躍遷，由基態(tài)躍遷至更高的單重態(tài)，電子自旋方向沒有改變（相反），凈自旋=0，這種躍遷是符合光譜選律的允許躍遷，S0→S1

若分子中電子躍遷過程中伴隨著自旋方向的改變（平行），由基態(tài)單重態(tài)→激發(fā)三重態(tài)，凈自旋0。這種躍遷為禁阻躍遷，S0→T1

平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；S0S2S1T1（二）去活過程（去激過程)Deactivation）

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫無輻射躍遷激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大。1、無輻射去激不伴隨發(fā)光現(xiàn)象的過程叫無輻射去激，體系內(nèi)的多余的能量以熱的形式釋放（1）內(nèi)部轉(zhuǎn)換（IC，InternalConversion）當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非?？拷灾疗湔駝?dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，相同的多重態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，S2

→S1、T2-T1（2）振動(dòng)馳豫（VR，VibrationalRelaxation）同一電子能級(jí)中，從較高振動(dòng)能級(jí)到較低振動(dòng)能級(jí)的過程。速率極大，10-14~10-12s完成。無論分子被激發(fā)到哪個(gè)激發(fā)單重態(tài)，均通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。（3）系間竄躍(ISC，IntersystemConversion)不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí),通過自旋-軌道耦合改變電子自旋,不同的多重態(tài)之間的非輻射躍遷，禁阻躍遷.S1→T1

（4）外部轉(zhuǎn)移（ExternalConversion，EC）指激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用而轉(zhuǎn)移能量，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱或消滅（猝滅）發(fā)生系間竄躍電子需轉(zhuǎn)向，S1～T1間進(jìn)行，比內(nèi)部轉(zhuǎn)換困難T1S0ISCVRVRIC吸光吸光S0S1S2VR：振動(dòng)馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍2.輻射去激—產(chǎn)生熒光和磷光光譜（1）熒光當(dāng)電子從第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)S0各振動(dòng)能級(jí)（多為S1→S0躍遷）所產(chǎn)生的輻射叫熒光熒光是相同多重態(tài)間的允許躍遷，產(chǎn)生速度快，10-9~10-6s，又叫快速熒光或瞬時(shí)熒光，外部光源停止照射，熒光馬上熄滅由于各種去活化過程的存在，無論開始電子被激發(fā)至什么高能級(jí)，它都經(jīng)過無輻射去激消耗能量后到S1的最低振動(dòng)能級(jí)，熒光輻射能通常要比激發(fā)能量低，熒光波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)。熒激>T1S0ISCVRVRIC吸光吸光熒光圖5-1分子熒光光譜產(chǎn)生過程示意圖S0S1S2VR：振動(dòng)馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍（2）磷光由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)(T1→S0躍遷）產(chǎn)生a.

電子由S0→T1的可能過程：（禁阻躍遷）S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移S→系間跨越T→振動(dòng)弛豫→T1b.

從T1

S1要改變電子自旋，發(fā)光速度慢，約為10-4~10s，光照停止后，磷光仍可持續(xù)一段時(shí)間c.

分子相互碰撞的無輻射能量塤耗大，所以磷光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)

磷>熒>激

*易產(chǎn)生熒光

n*易產(chǎn)生磷光T1S0ISCVRVRIC吸光吸光熒光

磷光圖5-1分子熒光、磷光光譜產(chǎn)生過程示意圖S0S1S2VR：振動(dòng)馳豫IC：內(nèi)部轉(zhuǎn)換ISC：系間竄躍VR用機(jī)械切光裝置——磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。例1：NO+O3→NO2*+O2NO2*→NO2+h使發(fā)射單色器與激發(fā)單色器之間保持一個(gè)恒定的波數(shù)差根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度間接測(cè)定葡萄糖。一、熒光和磷光光譜的產(chǎn)生吸收光譜中能級(jí)越高波長(zhǎng)越短，發(fā)射光譜中能級(jí)越高，波長(zhǎng)越長(zhǎng)。熒激ex/nmem/nm46365400一、熒光和磷光光譜的產(chǎn)生采用高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)可大大提高靈敏度，檢測(cè)限熒光分析法比分光光度法低2~4個(gè)數(shù)量級(jí)利用熒光壽命短，磷光壽命長(zhǎng)消除熒光干擾。固體表面室溫磷光分析法已成為多環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物的快速、靈敏的分析手段?！址Q核黃素，是一種生長(zhǎng)促進(jìn)劑，常存在于動(dòng)物肝臟、肉類、蛋黃、豆類、花生、蘑菇和海藻中。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大第二單色器作用：發(fā)射單色器，濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來選擇測(cè)定用的熒光波長(zhǎng)em。（1）內(nèi)部轉(zhuǎn)換（IC，InternalConversion）一般來說，溶劑的極性增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增大合適的可減少光譜重疊：合適的可減少光譜重疊：脂肪族有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，本身能發(fā)熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫二、激發(fā)光譜和熒光、磷光光譜1、激發(fā)光譜熒光和磷光均為光致發(fā)光，合適的激發(fā)光波長(zhǎng)需根據(jù)激發(fā)光譜確定Iex固定em熒光波長(zhǎng)固定測(cè)量波長(zhǎng)為熒光（或磷光）最大發(fā)射波長(zhǎng)em

，然后改變激發(fā)波長(zhǎng)，根據(jù)激發(fā)光波長(zhǎng)ex對(duì)熒光（磷光）強(qiáng)度I作圖得激發(fā)光譜曲線。

激發(fā)：excitated發(fā)射：emission

激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！這是因?yàn)榉肿游展饽艿倪^程就是分子的激發(fā)過程。激發(fā)光譜曲線：I

～

ex吸收曲線：A

～

兩者在性質(zhì)上是不同的Iex固定em熒光波長(zhǎng)Iem固定ex激發(fā)光波長(zhǎng)固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線，以I為縱坐標(biāo)，em為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜從曲線上找出最大的em2.發(fā)射光譜－熒光光譜(或磷光光譜)由于不同物質(zhì)具有不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)從圖中看出磷＞熒＞

激吸收峰熒光峰磷光峰3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。

b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)

不管激發(fā)波長(zhǎng)如何，分子受激后可到達(dá)不同能層的激發(fā)態(tài)，但通過去活化（內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫），電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能層。

c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。具有強(qiáng)熒光的分子多數(shù)有剛性平面結(jié)構(gòu)，可以減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減少，也減少了碰撞去活的可能性，熒光強(qiáng)度大。試樣需在液氮溫度（77K）或液氦（4K）下測(cè)定－低溫磷光（將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶?jī)?nèi)）在光致激發(fā)和去激發(fā)光的過程中，分子中的價(jià)電子（、n電子）處于不同的自旋狀態(tài)，通常用電子自旋狀態(tài)的多重性來描述多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測(cè)定∑Ki為非輻射躍遷的速率常數(shù)之和——主要取決于化學(xué)環(huán)境，也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大熒光量子效率f=氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑酚酞：無氧橋把兩個(gè)環(huán)固定，不能很好的共平面，為非熒光物質(zhì)具有過氧化物中間產(chǎn)物的氧化還原反應(yīng)可滿足要求。在刑偵學(xué)中的魯米諾反應(yīng)（LuminolTest），主要是指Luminol跟雙氧水和OH-離子間的反應(yīng)，血液中血紅素的鐵離子，是該反應(yīng)的催化劑。05時(shí)，方括號(hào)中其它各項(xiàng)與第一項(xiàng)相比可忽略不計(jì)，上式簡(jiǎn)化01~40g·mL-1不等這種躍遷為禁阻躍遷，S0→T1（二）熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（內(nèi)因）芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光激發(fā)：基態(tài)→第一激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，振動(dòng)能級(jí)越（2）振動(dòng)馳豫（VR，VibrationalRelaxation）Ip＝KC三維熒光光譜圖若分子中電子躍遷過程中伴隨著自旋方向的改變（平行），由基態(tài)單重態(tài)→激發(fā)三重態(tài)，凈自旋0?！址Q核黃素，是一種生長(zhǎng)促進(jìn)劑，常存在于動(dòng)物肝臟、肉類、蛋黃、豆類、花生、蘑菇和海藻中。吸光吸光熒光根據(jù)分子受激時(shí)所吸收能源及輻射光的機(jī)理不同分為以下幾類：動(dòng)化，分析效率低01~40g·mL-1不等沒食子酸、洛粉堿、過氧草酸鹽等。A*+羅丹明B→羅丹明B*+B（二）熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（內(nèi)因）01~40g·mL-1不等單重態(tài)激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和未激發(fā)的熒光物質(zhì)碰撞，濃度較高時(shí)常發(fā)生。固定激發(fā)光波長(zhǎng)(選最大激發(fā)波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線，以I為縱坐標(biāo)，em為橫坐標(biāo)得左圖，即熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度可大大提高熒光強(qiáng)度在可見光區(qū)觀察化學(xué)發(fā)光，需170~300kJ·mol-1激發(fā)能。例：3，4–苯并芘在光致激發(fā)和去激發(fā)光的過程中，分子中的價(jià)電子（、n電子）處于不同的自旋狀態(tài)，通常用電子自旋狀態(tài)的多重性來描述無論分子被激發(fā)到哪個(gè)激發(fā)單重態(tài)，均通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度間接測(cè)定葡萄糖。（三）金屬螯合物的熒光因此，發(fā)光反應(yīng)可視為一級(jí)反應(yīng)

c.

鏡像規(guī)則

基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類似。激發(fā)：基態(tài)→第一激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，振動(dòng)能級(jí)越高，能級(jí)差越大，波長(zhǎng)就越短。發(fā)射熒光：從第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)，基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)越高，其能量差越小，波長(zhǎng)就越長(zhǎng)。吸收光譜中能級(jí)越高波長(zhǎng)越短，發(fā)射光譜中能級(jí)越高，波長(zhǎng)越長(zhǎng)?；殓R像

基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

二、熒光、磷光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（內(nèi)因）產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：

i）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）；

ii）量子效率足夠大：（一）熒光效率（熒光量子產(chǎn)率、量子效率）衡量物質(zhì)發(fā)射熒光的能力

熒光量子效率f=發(fā)熒光的分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子總數(shù)f

是一個(gè)物質(zhì)熒光特性的重要參數(shù)，反映了熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，f

越大，熒光越強(qiáng)，在0~1之間若以各種躍遷速率常數(shù)來表示Kf為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)——取決于物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)∑Ki為非輻射躍遷的速率常數(shù)之和——主要取決于化學(xué)環(huán)境，也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)分析上有應(yīng)用價(jià)值的熒光化合物的熒光效率在0.1~1之間合適的可減少光譜重疊：A*+羅丹明B→羅丹明B*+B具有過氧化物中間產(chǎn)物的氧化還原反應(yīng)可滿足要求。A+B→C*+DC*+F→F*+EF*→F+h熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度可大大提高熒光強(qiáng)度同一電子能級(jí)中，從較高振動(dòng)能級(jí)到較低振動(dòng)能級(jí)的過程。所得的熒光強(qiáng)度I和波長(zhǎng)曲線為同步熒光光譜。磷>熒>激如：甲基藍(lán)溶液的熒光被Fe2+離子猝滅同一電子能級(jí)中，從較高振動(dòng)能級(jí)到較低振動(dòng)能級(jí)的過程。熒光量子效率f=05時(shí)，If與f、I0、和c有關(guān)，對(duì)一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度一定時(shí)，f、I0、ε和b為常數(shù)，合并為K01~10000g·mL-1芳環(huán)上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強(qiáng)，磷光增強(qiáng)，熒光減弱。比較容易排除其它物質(zhì)的干擾，選擇性好在氣相中O3能氧化NO、乙烯等產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，原子氧也能氧化NO、SO2、CO等產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。例：3，4–苯并芘二、分子發(fā)光分析法的特點(diǎn)3、可變波長(zhǎng)同步掃描熒光法熒光猝滅法也是熒光分析中經(jīng)常采用的方法。（二）熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（內(nèi)因）1、躍遷類型通常，具有*和n*躍遷結(jié)構(gòu)的分子才能吸收紫外可見光，產(chǎn)生熒光

具有π—π*躍遷的量子效率比n—π*躍遷的要大得多（前者ε大、壽命短）總之，躍遷是產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。2、共軛效應(yīng)具有共軛體系的芳環(huán)或雜環(huán)化合物，電子共軛程度越大，越易產(chǎn)生熒光;環(huán)越多，共軛程度越大，產(chǎn)生熒光波長(zhǎng)越長(zhǎng)（紅移），發(fā)射的熒光強(qiáng)度越強(qiáng)fex/nm

em/nm0.112052780.292863100.46365400苯萘蒽350菲線狀環(huán)結(jié)構(gòu)比非線狀結(jié)構(gòu)的熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)

芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測(cè)定

3，4-苯并芘是強(qiáng)致癌物ex=386nm

em=430nm3、剛性平面結(jié)構(gòu)—較穩(wěn)定的平面結(jié)構(gòu)具有強(qiáng)熒光的分子多數(shù)有剛性平面結(jié)構(gòu)，可以減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減少，也減少了碰撞去活的可能性，熒光強(qiáng)度大。熒光素：氧橋把兩個(gè)環(huán)固定在一個(gè)平面上，具有平面結(jié)構(gòu)，強(qiáng)熒光物質(zhì)酚酞：無氧橋把兩個(gè)環(huán)固定，不能很好的共平面，為非熒光物質(zhì)例1，2-二苯乙烯反式：平面構(gòu)型強(qiáng)熒光體順式：非平面構(gòu)型非熒光體4、取代基效應(yīng)——取代基對(duì)熒光物質(zhì)的熒光特征和強(qiáng)度也有很大影響。分成三類：（1）增強(qiáng)熒光的取代基

——

有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等給電子基團(tuán)由于基團(tuán)的n電子（孤對(duì)電子）的電子云與苯環(huán)上的軌道平行，共享了共軛電子，擴(kuò)大了共軛體系，使熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（2）減弱熒光的取代基

——-COOH、-NO2

、-COOR、-NO、-SH吸電子基團(tuán),使熒光波長(zhǎng)短移，熒光強(qiáng)度減弱芳環(huán)上被F、Cl、Br、I取代后，使系間竄躍加強(qiáng)，磷光增強(qiáng)，熒光減弱。其熒光強(qiáng)度隨鹵素原子量增加而減弱，磷光相應(yīng)增強(qiáng)，這種效應(yīng)為重原子效應(yīng)。重原子效應(yīng)溶液中若含有原子序數(shù)較高的重原子的分子或離子，如溴化物、碘化物等，導(dǎo)致容易發(fā)生系間跨越效應(yīng)稱重原子效應(yīng)。其原因是重原子的電子自旋和軌道運(yùn)動(dòng)間的相互作用變大，原子核附近產(chǎn)生磁場(chǎng)，使單重態(tài)向多重態(tài)系間跨越的幾率增加。含重原子的化合物熒光很弱，甚至無熒光，但磷光增強(qiáng)。（3）影響不明顯的取代基

——-NH3+、-R、-SO3H等（三）金屬螯合物的熒光大多數(shù)無機(jī)鹽類金屬離子，不能產(chǎn)生熒光，但某些螯合物都能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光，可用于痕量金屬離子的測(cè)定不少有機(jī)配體是弱熒光體或不發(fā)熒光，但與Mn+形成螯合物后變?yōu)槠矫鏄?gòu)型，就會(huì)使熒光加強(qiáng)或產(chǎn)生熒光例：8-羥基喹啉為弱熒光體，與Mn+—Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成剛性結(jié)構(gòu)，熒光加強(qiáng)使發(fā)射單色器與激發(fā)單色器之間保持一個(gè)恒定的波數(shù)差儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低廉不同的物質(zhì)用不同的光進(jìn)行激發(fā)，選擇不同的激發(fā)光波長(zhǎng)脂肪族有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，本身能發(fā)熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析在光致激發(fā)和去激發(fā)光的過程中，分子中的價(jià)電子（、n電子）處于不同的自旋狀態(tài)，通常用電子自旋狀態(tài)的多重性來描述使兩單色器在掃描過程中以不同的速率同時(shí)進(jìn)行掃描合適的可減少光譜重疊：因此，發(fā)光反應(yīng)可視為一級(jí)反應(yīng)利用表面活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變磷光體的微環(huán)境、增加定向約束力，從而減小內(nèi)轉(zhuǎn)換和碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性。二、熒光、磷光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（內(nèi)因）可測(cè)定結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大量有機(jī)物質(zhì)，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農(nóng)藥等魯米諾化學(xué)發(fā)光體系還可用于許多生化反應(yīng)研究，常常涉及到H2O2的產(chǎn)生或H2O2參加反應(yīng)，例如測(cè)定葡萄糖：食品加工過程也會(huì)產(chǎn)生3，4–苯并芘，尤其是煙熏、油炸、烘烤食品使發(fā)射單色器與激發(fā)單色器之間保持一個(gè)恒定的波數(shù)差同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)差越小，波長(zhǎng)就越長(zhǎng)。3、可變波長(zhǎng)同步掃描熒光法熒光強(qiáng)度隨激發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)而增強(qiáng)（提高激發(fā)光強(qiáng)度，可提高熒光強(qiáng)度）用機(jī)械切光裝置——磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。要有有利的化學(xué)反應(yīng)歷程。三、影響熒光強(qiáng)度的因素（外因）1.溶劑的影響同一熒光物質(zhì)在不同的溶劑中可能表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)一般來說，溶劑的極性增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增大

2.溫度的影響——低溫下測(cè)定，提高靈敏度因?yàn)檩椛滠S遷的速率基本不隨溫度變，而非輻射躍遷隨溫度升高顯著增大。大多數(shù)熒光物質(zhì)都隨溶液溫度升高熒光效率下降，熒光強(qiáng)度減弱。溫度對(duì)磷光影響更大3.pH的影響大多數(shù)含有酸性或堿性基團(tuán)的芳香族化合物的熒光性質(zhì)受溶液pH的影響很大共軛酸堿對(duì)是具有不同熒光性質(zhì)的兩種型體，具有各自的熒光效率和熒光波長(zhǎng)例：苯酚離子化后，熒光消失pH≈1有熒光pH≈13無熒光但兩個(gè)苯環(huán)相連的化合物，又表現(xiàn)出相反的性質(zhì)，分子形式無熒光，離子化后顯熒光例：—苯酚有熒光無熒光另外，表面活性劑也會(huì)影響熒光強(qiáng)度和特性4.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象

自吸現(xiàn)象：內(nèi)濾光中的一種，化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與其吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。

內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色氨酸中的重鉻酸鉀；5、溶解氧的影響溶液中的氧分子可使熒光溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度降低甚至熄滅。其原因較為復(fù)雜。溶解氧幾乎對(duì)所有的有機(jī)熒光物質(zhì)均有不同程度的熄滅作用，對(duì)芳香烴尤為顯著。6、熒光猝滅——熒光物質(zhì)與溶劑或其它物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，或發(fā)生碰撞后使熒光強(qiáng)度下降或熒光效率f下降稱為熒光猝滅。使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為熒光猝滅劑氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑猝滅類型有：（1）碰撞猝滅（動(dòng)態(tài)猝滅）處于單重態(tài)的熒光分子M*與猝滅劑分子Q碰撞，使M*以無輻射躍遷方式回到基態(tài)，產(chǎn)生猝滅。M非輻射躍遷M+熱碰撞猝滅（2）靜態(tài)猝滅（組成化合物的猝滅）部分熒光物質(zhì)與猝滅劑生成非熒光的配合物。這一過程往往還會(huì)引起物質(zhì)吸收光譜的改變。（3）轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅由于系間跨越躍遷，分子由單重態(tài)躍遷至三重態(tài)，轉(zhuǎn)入三重態(tài)的分子在室溫下不發(fā)光，易與其它分子碰撞而使熒光猝滅，若發(fā)射發(fā)射則為磷光。（4）發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的猝滅猝滅劑與熒光分子相互作用時(shí)發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移引起的猝滅。如：甲基藍(lán)溶液的熒光被Fe2+離子猝滅I-、Br-，S2O32-等易于給出電子的陰離子，使奎寧、羅丹明等熒光猝滅。（5）熒光自猝滅單重態(tài)激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和未激發(fā)的熒光物質(zhì)碰撞，濃度較高時(shí)常發(fā)生。動(dòng)化，分析效率低使兩單色器在掃描過程中以不同的速率同時(shí)進(jìn)行掃描沒食子酸、洛粉堿、過氧草酸鹽等。例1：NO+O3→NO2*+O2NO2*→NO2+hn*易產(chǎn)生磷光吸收曲線：A～S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移S→系間跨越T→振動(dòng)弛豫→T1利用魯米諾發(fā)光體系可以測(cè)定50余種元素和大量有機(jī)和無機(jī)化合物，靈敏度都比較高二、激發(fā)光譜和熒光、磷光光譜比較容易排除其它物質(zhì)的干擾，選擇性好發(fā)光機(jī)理有待進(jìn)一步研究根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關(guān)系，同步掃描可分為固定波長(zhǎng)差()和固定能量差及可變波長(zhǎng)三種：05時(shí)，If與f、I0、和c有關(guān)，對(duì)一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度一定時(shí)，f、I0、ε和b為常數(shù)，合并為Kf是一個(gè)物質(zhì)熒光特性的重要參數(shù)，反映了熒光物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，f越大，熒光越強(qiáng)，在0~1之間溫度的影響——低溫下測(cè)定，提高靈敏度優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，造價(jià)低，體積小，靈敏度高等食品加工過程也會(huì)產(chǎn)生3，4–苯并芘，尤其是煙熏、油炸、烘烤食品四、熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系用強(qiáng)度為I0的入射光，照射到液池內(nèi)的熒光物質(zhì)時(shí)，產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度If

用儀器測(cè)得，在熒光濃度很稀(A<0.05)時(shí)，熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度If與濃度有下面的關(guān)系If=fIa=f（I0-I）Ia為吸收的輻射強(qiáng)度I0為入射光強(qiáng)度熒光池I0IIf熒光強(qiáng)度檢測(cè)器If=f（I0-I010-A

）

=fI0

（1-10-A

）I=I010-A將上式展開當(dāng)A﹤0.05時(shí)，方括號(hào)中其它各項(xiàng)與第一項(xiàng)相比可忽略不計(jì)，上式簡(jiǎn)化

If=2.3fI0A=2.3fI0

εbc當(dāng)A﹤0.05時(shí)，

If與f、I0、和c有關(guān)，對(duì)一給定物質(zhì)，當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)和強(qiáng)度一定時(shí)，f、I0、

ε和b為常數(shù)，合并為K

If=KC

定量分析依據(jù)熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，If=KC只有在濃度低時(shí)使用，熒光物質(zhì)測(cè)定的是微量或痕量組分，靈敏度高濃度高時(shí)，If與C不呈線形關(guān)系，有時(shí)C增大，If反而降低因?yàn)楣絒]中后面影響，有時(shí)發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)If=

fI0

（1-10-A

）=fI0

（1-10-εbc

）（一）熒光分析儀器——主要由光源、單色器、液槽、檢測(cè)器和顯示器組成與分光光度計(jì)有兩點(diǎn)不同①兩個(gè)單色器②檢測(cè)器與激發(fā)光互成直角光源第一單色器激發(fā)單色器液池檢測(cè)器第二單色器發(fā)射單色器檢測(cè)器放大器及記錄器exemI0I五、熒光和磷光分析儀器與分光光度計(jì)有兩點(diǎn)不同具有不飽和基團(tuán)的基態(tài)分子光照后，價(jià)電子躍遷產(chǎn)生熒光和磷光激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！可測(cè)定結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大量有機(jī)物質(zhì)，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農(nóng)藥等應(yīng)用還不夠廣泛，尚待拓寬。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，造價(jià)低，體積小，靈敏度高等熒光和磷光均為光致發(fā)光，合適的激發(fā)光波長(zhǎng)需根據(jù)激發(fā)光譜確定i）分子具有與輻射頻率相應(yīng)的熒光結(jié)構(gòu)（內(nèi)因）；磷光儀器在熒光儀樣品池上增加磷光配件：低溫杜瓦瓶和斬光片。酚酞：無氧橋把兩個(gè)環(huán)固定，不能很好的共平面，為非熒光物質(zhì)脂肪族有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，本身能發(fā)熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析大多數(shù)熒光光度計(jì)一般采用兩個(gè)光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜（1）碰撞猝滅（動(dòng)態(tài)猝滅）多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測(cè)定其原因是重原子的電子自旋和軌道運(yùn)動(dòng)間的相互作用變大，原子核附近產(chǎn)生磁場(chǎng)，使單重態(tài)向多重態(tài)系間跨越的幾率增加。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，造價(jià)低，體積小，靈敏度高等第一單色器作用：激發(fā)單色器，分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)ex。>60nm時(shí)，只顯示色氨酸的特征光譜，實(shí)現(xiàn)分別測(cè)定。所得的熒光強(qiáng)度I和波長(zhǎng)曲線為同步熒光光譜。一、熒光和磷光光譜的產(chǎn)生1、光源激發(fā)光源一般要求比吸收測(cè)量中的光源有更大的發(fā)射強(qiáng)度；適用波長(zhǎng)范圍寬熒光光度計(jì)中常用高壓汞燈和氙弧燈利用汞蒸氣放電發(fā)光的光源；常用其發(fā)射365nm、405nm、436nm三條譜線以365nm的譜線最強(qiáng)應(yīng)用最廣泛的一種光源，可發(fā)射250~800nm很強(qiáng)的連續(xù)光源激光誘導(dǎo)熒光LIF，laserinductivefluorescence——熒光物質(zhì)與溶劑或其它物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，或發(fā)生碰撞后使熒光強(qiáng)度下降或熒光效率f下降稱為熒光猝滅。二、分子發(fā)光分析法的特點(diǎn)基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。分立取樣式和流動(dòng)注射式化學(xué)發(fā)光儀根據(jù)發(fā)光峰面積的積分值或峰高進(jìn)行定量分析儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低廉一、分子發(fā)光分析法及其分類激發(fā)：基態(tài)→第一激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，振動(dòng)能級(jí)越氧分子及產(chǎn)生重原子效應(yīng)的溴化物、碘化物等都是常見的熒光猝滅劑If=f（I0-I010-A）（二）熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（內(nèi)因）使發(fā)射單色器與激發(fā)單色器之間保持一個(gè)恒定的波數(shù)差熒激利用魯米諾發(fā)光體系可以測(cè)定50余種元素和大量有機(jī)和無機(jī)化合物，靈敏度都比較高化學(xué)發(fā)光是吸收化學(xué)反應(yīng)所釋放化學(xué)能而使分子發(fā)光所建立的分析方法吸光吸光>60nm時(shí)，只顯示色氨酸的特征光譜，實(shí)現(xiàn)分別測(cè)定。具有強(qiáng)熒光的分子多數(shù)有剛性平面結(jié)構(gòu)，可以減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減少，也減少了碰撞去活的可能性，熒光強(qiáng)度大。=2.激發(fā)光譜曲線：I～ex二、熒光、磷光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（內(nèi)因）2、單色器大多數(shù)熒光光度計(jì)一般采用兩個(gè)光柵單色器，有較高的分辨率，能掃描圖譜，既可獲得激發(fā)光譜，又可獲得熒光光譜第一單色器作用：激發(fā)單色器，分離出所需要的激發(fā)光，選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)

ex

。第二單色器作用：發(fā)射單色器，濾掉一些雜散光和雜質(zhì)所發(fā)射的干擾光，用來選擇測(cè)定用的熒光波長(zhǎng)

em。在選定的

em

下測(cè)定熒光強(qiáng)度，定量分析3、樣品池盛放測(cè)定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上邊4、檢測(cè)器熒光的強(qiáng)度一般較弱，要求檢測(cè)器有較高的靈敏度，熒光光度計(jì)采用光電倍增管熒光分析比吸收光度法具有高得多的靈敏度，是因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度可大大提高熒光強(qiáng)度5、讀出裝置記錄儀記錄或打印機(jī)打印出結(jié)果，掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜同步熒光光譜1971年Lloyd首先提出用同步掃描技術(shù)來繪制光譜圖，即同時(shí)掃描激發(fā)單色器和發(fā)射單色器波長(zhǎng)的條件下測(cè)繪光譜圖。所得的熒光強(qiáng)度I和波長(zhǎng)曲線為同步熒光光譜。同步掃描技術(shù)

根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關(guān)系，同步掃描可分為固定波長(zhǎng)差()和固定能量差及可變波長(zhǎng)三種：1、固定波長(zhǎng)差同步掃描熒光法

＝ex-em＝常數(shù)2、固定能量差同步掃描熒光法使發(fā)射單色器與激發(fā)單色器之間保持一個(gè)恒定的波數(shù)差3、可變波長(zhǎng)同步掃描熒光法使兩單色器在掃描過程中以不同的速率同時(shí)進(jìn)行掃描

同步掃描技術(shù)可簡(jiǎn)化光譜，譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率。

合適的可減少光譜重疊：酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴(yán)重重疊，但<15nm的同步光譜只顯示酪氨酸特征光譜；>60nm時(shí)，只顯示色氨酸的特征光譜，實(shí)現(xiàn)分別測(cè)定。六、熒光光譜法與紫外-可見分光光度法比較（一）相同點(diǎn)（二）不同點(diǎn)磷光分析法phosphorescence與熒光相比，磷光的特點(diǎn)：1、磷光壽命比熒光長(zhǎng)2、磷光輻射的波長(zhǎng)比熒光長(zhǎng)（一）磷光強(qiáng)度：

Ip＝KC（二）溫度對(duì)磷光強(qiáng)度的影響試樣需在液氮溫度（77K）或液氦（4K）下測(cè)定（三）磷光分析儀器與熒光分析儀器相似，主要差異如下：1.試樣室試樣需在液氮溫度（77K）或液氦（4K）下測(cè)定－低溫磷光（將液池放在盛放液氮的杜瓦瓶?jī)?nèi)）

固體表面室溫磷光分析需特制試樣室2.磷光鏡有些物質(zhì)既可產(chǎn)生熒光，又能產(chǎn)生磷光。用機(jī)械切光裝置——磷光鏡區(qū)別熒光和磷光。利用熒光壽命短，磷光壽命長(zhǎng)消除熒光干擾。磷光儀器在熒光儀樣品池上增加磷光配件：低溫杜瓦瓶和斬光片。如右圖所示。斬光片的作用是利用其分子受激所產(chǎn)生的熒光與磷光的壽命不同獲取磷光輻射（四）室溫磷光低溫?zé)晒庑璧蜏貙?shí)驗(yàn)裝置且受到溶劑選擇的限制，1974年后發(fā)展了室溫磷光（RTP）。1）固體基質(zhì)室溫磷光在室溫下以固體基質(zhì)（如纖維素等）吸附磷光體，增加分子剛性、減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率。2）膠束增穩(wěn)室溫磷光利用表面活性劑在臨界濃度形成具多相性的膠束，改變磷光體的微環(huán)境、增加定向約束力，從而減小內(nèi)轉(zhuǎn)換和碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性。3）敏化溶液室溫磷光（二）熒光分析法的應(yīng)用1.無機(jī)化合物的分析無機(jī)化合物中，能直接產(chǎn)生熒光并應(yīng)用于測(cè)定的為數(shù)不多，但與有機(jī)化合物生成發(fā)熒光的有機(jī)配合物后，進(jìn)行熒光分析的元素達(dá)70多種，其中較常采用熒光法測(cè)定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素能夠同金屬離子形成熒光配合物的有機(jī)試劑絕大多數(shù)是芳香族化合物，形成五元環(huán)或六元環(huán)的螯合物，分子的剛性平面結(jié)構(gòu)增大，變?yōu)閺?qiáng)熒光體熒光猝滅法也是熒光分析中經(jīng)常采用的方法?？刹捎脽晒忖绶ㄩg接測(cè)定的離子有：F-、S2-、Co2+、Ni2+、Cu2+等2.有機(jī)化合物的分析脂肪族有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，本身能發(fā)熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)熒光；可直接用熒光法測(cè)定。對(duì)于具有致癌活性的多環(huán)芳烴——熒光分析法是最主要的測(cè)定方法可測(cè)定結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大量有機(jī)物質(zhì)，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和輔酶以及各種藥物、毒物和農(nóng)藥等3、基因研究及檢測(cè)遺傳物質(zhì)DNA自身的熒光效率很低，一般檢測(cè)不到其熒光。常選用某些熒光分子作探針，通過探針分析熒光的變化研究DNA與小分子及藥物的作用機(jī)理，從而探討致病原因及篩選和設(shè)計(jì)新藥。典型的熒光探針分子：溴化乙錠（EB）、吖啶類染料。例：3，4–

苯并芘為強(qiáng)致癌物質(zhì)煤炭、石油、天然氣等燃料不完全燃燒以及吸煙、焚燒垃圾都會(huì)產(chǎn)生3，4–

苯并芘，汽車尾氣也是主要來源食品加工過程也會(huì)產(chǎn)生3，4–

苯并芘，尤其是煙熏、油炸、烘烤食品例：VB2——又稱核黃素，是一種生長(zhǎng)促進(jìn)劑，常存在于動(dòng)物肝臟、肉類、蛋黃、豆類、花生、蘑菇和海藻中。在低濃度情況下，I=KC，I與C呈線性關(guān)系，在pH6~7熒光最強(qiáng)在430~440nm藍(lán)光照射下，發(fā)出綠色熒光，em=535nm下測(cè)I，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定缺VB2會(huì)得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮炎維生素B2（三）磷光分析法應(yīng)用能產(chǎn)生磷光的物質(zhì)數(shù)量很少，磷光分析不及熒光分析普遍，但磷光分析法已在藥物分析、臨床及環(huán)境分析領(lǐng)域得到一定的應(yīng)用。低溫磷光分析已應(yīng)用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多環(huán)芳烴及含O、S、N的雜環(huán)化合物分析固體表面室溫磷光分析法已成為多環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物的快速、靈敏的分析手段。農(nóng)藥、生物堿、植物生長(zhǎng)激素的分析煙堿、降煙堿、新煙堿等分析§5-3化學(xué)發(fā)光分析法

Chemiluminescence,CL一、概述化學(xué)發(fā)光是吸收化學(xué)反應(yīng)所釋放化學(xué)能而使分子發(fā)光所建立的分析方法化學(xué)發(fā)光與熒光的主要區(qū)別：受激發(fā)時(shí)所需的能量來源不同，需要化學(xué)反應(yīng)過程中所提供的化學(xué)能化學(xué)發(fā)光分析具有以下特點(diǎn)靈敏度高——例：用熒光素酶和三磷酸腺苷ATP的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可測(cè)定低至2×10-17mol·L-1ATP線性范圍寬——一般有5~6個(gè)數(shù)量級(jí)儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，成本低廉分析速度快，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化局限性：可供發(fā)光用的試劑有限發(fā)光機(jī)理有待進(jìn)一步研究二、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理（一）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的基本條件發(fā)光反應(yīng)必須滿足以下條件1.化學(xué)反應(yīng)必須產(chǎn)生足夠的化學(xué)能化學(xué)發(fā)光基于化學(xué)反應(yīng)提供足夠的能量

A+B→C*+D產(chǎn)物接受反應(yīng)能被激發(fā)

C*→C+h在可見光區(qū)觀察化學(xué)發(fā)光，需170~300kJ·mol-1激發(fā)能。具有過氧化物中間產(chǎn)物的氧化還原反應(yīng)可滿足要求?；瘜W(xué)反應(yīng)多是在有O3、H2O2等參加的氧化還原反應(yīng)中2.要有有利的化學(xué)反應(yīng)歷程。3.處于激發(fā)態(tài)分子能夠以輻射躍遷的方式返回基態(tài)（二）化學(xué)發(fā)光效率和發(fā)光強(qiáng)度1、化學(xué)發(fā)光效率CL激發(fā)態(tài)分子的化學(xué)效率激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率r取決于發(fā)光所依據(jù)的化學(xué)反應(yīng)本身f與熒光效率的影響因素相同，既取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，也受環(huán)境的影響2、化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度具有高效率的化學(xué)發(fā)光是生物體中，亦稱生物發(fā)光。如：螢火蟲發(fā)光反應(yīng)的效率幾乎接近100%，非生物體的化學(xué)發(fā)光效率一般不超過1%?；瘜W(xué)發(fā)光強(qiáng)度ICL（t）與反應(yīng)速度、化學(xué)發(fā)光效率有如下關(guān)系對(duì)下列化學(xué)發(fā)光反應(yīng)A+B→C*+D

C+hICL隨時(shí)間和反應(yīng)物消耗的變化逐漸減小A+B→C*+DA為待測(cè)物質(zhì)，C為發(fā)光物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)物B的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量于待測(cè)物濃度時(shí)，B的濃度可認(rèn)為是常數(shù)。因此，發(fā)光反應(yīng)可視為一級(jí)反應(yīng)t時(shí)刻的發(fā)光強(qiáng)度與該時(shí)刻的分析物濃度成正比化學(xué)發(fā)光總強(qiáng)度與分析物濃度呈線性關(guān)系。常用發(fā)光總強(qiáng)度來定量分析發(fā)光總強(qiáng)度三、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型1.液相化學(xué)發(fā)光——研究和應(yīng)用的比較廣泛的有：魯米諾、光澤精、沒食子酸、洛粉堿、過氧草酸鹽等。魯米諾是最常用的發(fā)光試劑，它可以測(cè)定Cl2、HClO、ClO-、H2O2、O2和NO2，產(chǎn)生