流式細(xì)胞儀課件

流式細(xì)胞儀概述流式細(xì)胞儀的定義:流式細(xì)胞儀是以激光為光源，集流體力學(xué)技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。流式細(xì)胞術(shù)的定義:應(yīng)用流式細(xì)胞儀對于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行快速的、多參數(shù)的定量分析和分選的技術(shù)稱為流式細(xì)胞術(shù)。1934年Moldavan使懸浮的血紅細(xì)胞從一個(gè)毛細(xì)玻璃管中流過，每個(gè)通過的細(xì)胞可被一個(gè)光電裝置記錄下來，這可謂流式細(xì)胞儀的最初模型。1965年Kamentsky用紫外吸收和可見光散射兩個(gè)參數(shù)同時(shí)測量未染色的細(xì)胞，給出了細(xì)胞中核酸的含量和細(xì)胞大小，奠定了多參數(shù)流式細(xì)胞測量的基礎(chǔ)。1967年VanDilla和LosAlamos采用了Crosland-Taylor設(shè)計(jì)的層流流動(dòng)室和氬離子激光器開發(fā)出了液流束、照明光軸，檢測系統(tǒng)三者互相垂直的流式細(xì)胞儀，成為目前各種流式細(xì)胞測量儀的基礎(chǔ)。1969年Fulwyler利用Sweet的靜電墨水噴射液滴偏轉(zhuǎn)技術(shù)，建立了流式細(xì)胞分選術(shù)。Ehrlich和Wheeless利用飛點(diǎn)掃描技術(shù)和縫掃描技術(shù)使零分辨率的流式細(xì)胞儀變成了低分辨率的流式細(xì)胞儀。噴嘴的振動(dòng)頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的數(shù)目。應(yīng)用流式細(xì)胞儀對于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行快速的、多參數(shù)的定量分析和分選的技術(shù)稱為流式細(xì)胞技術(shù)。由于細(xì)胞的快速流動(dòng)，每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時(shí)間僅為1μs左右，且細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強(qiáng)度。第一節(jié)流式細(xì)胞儀的工作原理當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時(shí)，流式細(xì)胞儀就會(huì)在這類細(xì)胞形成液滴時(shí)給含有這類細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時(shí)，依所帶電荷的符號(hào)分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)。Ts細(xì)胞增高，NK細(xì)胞減少或活力下降，B淋巴細(xì)胞群則在正常范圍；由于細(xì)胞的快速流動(dòng)，每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時(shí)間僅為1μs左右，且細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強(qiáng)度。血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮其功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，靜止期和活化期的血小板膜糖蛋白受體的種類、含量、結(jié)構(gòu)和功能顯著不同。在光電倍增管前放上一小孔，作為空間濾波器，排除其它雜散光信號(hào)，從而確保了A點(diǎn)光源進(jìn)不了B’點(diǎn)處，B點(diǎn)光源也進(jìn)不了A’點(diǎn)處。CD4＋/CD8＋明顯低于健康成人(P<0.在臨床檢測中，應(yīng)對各個(gè)工作環(huán)節(jié)和儀器性能進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和規(guī)范化操作，以保證各項(xiàng)檢測數(shù)據(jù)和指標(biāo)的可靠性。一、流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用圖），中心處能量最高。Ehrlich和Wheeless利用飛點(diǎn)掃描技術(shù)和縫掃描技術(shù)使零分辨率的流式細(xì)胞儀變成了低分辨率的流式細(xì)胞儀。分選速度指每秒可提取所要細(xì)胞的個(gè)數(shù)。流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)可分為流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；分選速度指每秒可提取所要細(xì)胞的個(gè)數(shù)。CD4＋/CD8＋明顯低于健康成人(P<0.（1）熒光信號(hào)線性測量和對數(shù)測量線性放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系，細(xì)胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測量一般選用線性放大測量。（六）FCM測量數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析80年代以來，流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)采集、存儲(chǔ)、顯示、分析日趨完善，隨著樣品制備方法的增多，新的熒光染料和細(xì)胞標(biāo)記物的出現(xiàn)，流式細(xì)胞儀的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大。

進(jìn)入90年代，標(biāo)本制備儀和自動(dòng)進(jìn)樣器的問世，以及適合臨床應(yīng)用的單克隆抗體的增加，使流式細(xì)胞儀不僅出現(xiàn)在大專院校和科研單位，它也逐漸進(jìn)入醫(yī)院的中心實(shí)驗(yàn)室和檢驗(yàn)科。第一節(jié)流式細(xì)胞儀的工作原理一、生物學(xué)顆粒分析原理流式細(xì)胞技術(shù)是在單細(xì)胞水平上，對于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的大量細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)，現(xiàn)已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究最先進(jìn)的分析技術(shù)之一。應(yīng)用流式細(xì)胞儀對于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行快速的、多參數(shù)的定量分析和分選的技術(shù)稱為流式細(xì)胞技術(shù)。生物學(xué)顆粒包括大的免疫復(fù)合物、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、細(xì)菌、霉菌、染色體、真核細(xì)胞、雜交細(xì)胞、聚集細(xì)胞等，所檢測的生物顆粒的理化性質(zhì)包括細(xì)胞大小、細(xì)胞形態(tài)、胞漿顆?；潭?、DNA含量、總蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞膜完整性和酶活性等。

將懸浮分散的單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放人樣品管。在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細(xì)胞懸液形成樣品流垂直進(jìn)入流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室，染色的細(xì)胞受激光照射后發(fā)出熒光，同時(shí)產(chǎn)生光散射。鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個(gè)圓柱流束，與水平方向的激光束垂直相交，染色的細(xì)胞受激光照射后發(fā)出熒光，這些信號(hào)分別被光電倍增管熒光檢測器和光電二極管散射光檢測器接收，經(jīng)過計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存、計(jì)算、分析這些數(shù)字化信息，就可得到細(xì)胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性質(zhì)等物理和生化指標(biāo)。1.樣品的進(jìn)入流動(dòng)室：將懸浮分散的單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放人樣品管。在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細(xì)胞懸液形成樣品流垂直進(jìn)入流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室，沿流動(dòng)室的軸心向下流動(dòng)。2.鞘液的作用：流動(dòng)室軸心至外壁的鞘液也向下流動(dòng)，形成包繞細(xì)胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個(gè)圓柱流束，自噴嘴的圓形孔噴出，與水平方向的激光束垂直相交，相交點(diǎn)稱為測量區(qū)。3.信號(hào)的產(chǎn)生與接收：染色的細(xì)胞在測量區(qū)受激光照射后發(fā)出熒光，同時(shí)產(chǎn)生光散射。這些信號(hào)分別被光電倍增管和光電二極管接收，經(jīng)過計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存、計(jì)算、分析這些數(shù)字化信息，就可得細(xì)胞的大小和核酸含量等指標(biāo)。在壓電晶體上加上頻率為30kHz的信號(hào)，使液柱斷裂成一連串均勻的液滴。當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時(shí)，流式細(xì)胞儀就會(huì)在這類細(xì)胞形成液滴時(shí)給含有這類細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時(shí)，依所帶電荷的符號(hào)分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)，從而達(dá)到細(xì)胞分類收集的目的。二、流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選原理

當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時(shí)，流式細(xì)胞儀就會(huì)在這類細(xì)胞形成液滴時(shí)給含有這類細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時(shí)，依所帶電荷的符號(hào)分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)。另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記細(xì)胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號(hào)，通過對這類熒光信號(hào)的檢測和定量分析能了解所研究細(xì)胞的性質(zhì)和數(shù)量。由于細(xì)胞的快速流動(dòng)，每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時(shí)間僅為1μs左右，且細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強(qiáng)度。白血病是白細(xì)胞在分化到某個(gè)階段受阻后呈克隆性異常增殖的結(jié)果，它的發(fā)病是多階段的，不同病因引起的白血病的發(fā)病機(jī)制不同，在治療和預(yù)防上也不同，所以，利用白細(xì)胞分化不同階段出現(xiàn)的細(xì)胞表面標(biāo)志，可以對白血病進(jìn)行免疫分型，對其進(jìn)行導(dǎo)向治療。用于血液/腫瘤細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)研究第三節(jié)流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)一、流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用如當(dāng)人類感染免疫缺陷病病毒(Humanimmuno-deficiencyvirus，HIV)后，HIV主要選擇地侵入人類具有重要免疫功能的T淋巴細(xì)胞亞群中的輔助性T細(xì)胞，即Th細(xì)胞(CD4＋)，使具有重要免疫功能的T細(xì)胞群被破壞，繼而累及全身免疫器官，使機(jī)體免疫功能下降。信號(hào)的產(chǎn)生與接收：染色的細(xì)胞在測量區(qū)受激光照射后發(fā)出熒光，同時(shí)產(chǎn)生光散射。利用流式細(xì)胞儀，采用多色熒光標(biāo)記的單克隆抗體，分析黏附性T細(xì)胞表面CD3＋CD4＋或CD8＋CD19－CD16－CD45RO＋CD62＋CD27＋CD57抗原，從而對LFA-1-adhesiveT細(xì)胞快速準(zhǔn)確地測定。圖），中心處能量最高。前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測量到0.近年來熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及熒光探針標(biāo)記的單克隆抗體，為流式細(xì)胞技術(shù)研究各種腫瘤抗原、腫瘤蛋白、致癌基因開辟了新途徑，極大地提高了腫瘤學(xué)的研究水平，并為流式細(xì)胞技術(shù)在腫瘤學(xué)的研究中開辟了更廣闊的應(yīng)用前景。臨床型只有分析功能，沒有分選功能，操作簡便，易學(xué)易掌握。第一節(jié)流式細(xì)胞儀的工作原理一、檢測樣品制備的重要性為保證樣品檢測時(shí)儀器處于最佳工作狀態(tài)，采用質(zhì)控品進(jìn)行PMT校準(zhǔn)，必要時(shí)進(jìn)行電壓補(bǔ)償。流式細(xì)胞分析儀器是一項(xiàng)集多學(xué)科知識(shí)綜合應(yīng)用的復(fù)雜儀器，除了對儀器各方面性能指標(biāo)有嚴(yán)格的要求以外，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品處理方面也需要有豐富的基礎(chǔ)理論及操作經(jīng)驗(yàn)。冷卻水須用過濾器，并保證壓力和流量。被檢細(xì)胞直徑大于激光光斑直徑，細(xì)胞通過光束時(shí)各部分被依次掃描。激光電源的波動(dòng)范圍應(yīng)小于±10%。儀器操作必須有經(jīng)過培訓(xùn)的人員操作。第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)一、流式細(xì)胞儀的分類流式細(xì)胞儀根據(jù)功能不同可分為臨床型和科研型。臨床型只有分析功能，沒有分選功能，操作簡便，易學(xué)易掌握?？蒲行图扔蟹治龉δ苡钟蟹诌x功能，可快速將所感興趣的細(xì)胞分選出來。流式細(xì)胞儀根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同又可分為一般流式細(xì)胞儀和狹縫掃描流式細(xì)胞儀。前者的光斑直徑大于被檢細(xì)胞體積，只能提供細(xì)胞內(nèi)某種生物化學(xué)成分的參數(shù)。狹縫掃描流式細(xì)胞儀被檢細(xì)胞直徑大于激光光斑直徑，可計(jì)算出細(xì)胞直徑大小、核直徑大小、核漿比例等一系列的形態(tài)學(xué)信息的定量資料。狹縫掃描流式細(xì)胞儀被檢細(xì)胞直徑大于激光光斑直徑，細(xì)胞通過光束時(shí)各部分被依次掃描。

流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)可分為流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；激光光源及光束成形系統(tǒng)；光學(xué)系統(tǒng)；信號(hào)檢測與存貯、顯示、分析系統(tǒng)；細(xì)胞分選系統(tǒng)等五個(gè)部分。二、流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)（一）流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個(gè)孔，供細(xì)胞單個(gè)流過，檢測區(qū)在該孔的中心，流動(dòng)室內(nèi)充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。樣品流在鞘流的環(huán)包下形成聚焦，保證每個(gè)細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。

由右圖可知，空氣泵產(chǎn)生壓縮空氣，通過鞘流壓力調(diào)節(jié)器加在鞘液上一恒定的壓力，這樣鞘液以勻速運(yùn)動(dòng)流過流動(dòng)室，在整個(gè)系統(tǒng)運(yùn)行中流速是不變的。（二）激光光源與光束成形系統(tǒng)激光是一種相干光源，它能提供單波長、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照。由于細(xì)胞的快速流動(dòng)，每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時(shí)間僅為1μs左右，且細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強(qiáng)度。

由于激光焦點(diǎn)處能量分布為正態(tài)分布（見圖），中心處能量最高。因此，當(dāng)樣本速率選擇高速時(shí)，處在樣本流不同位置的細(xì)胞或顆粒，受激光照射的能量不一樣，從而被激發(fā)出的熒光強(qiáng)度也不相同。（三）光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片和小孔組成。濾光片主要分為：1.長通濾光片長通濾光片使特定波長以上的光通過。2.短通濾光片特定波長以下的光通過。3.帶通濾光片帶通濾光片允許一定波長范圍內(nèi)的光通過1967年VanDilla和LosAlamos采用了Crosland-Taylor設(shè)計(jì)的層流流動(dòng)室和氬離子激光器開發(fā)出了液流束、照明光軸，檢測系統(tǒng)三者互相垂直的流式細(xì)胞儀，成為目前各種流式細(xì)胞測量儀的基礎(chǔ)。（六）FCM測量數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析樣品的進(jìn)入流動(dòng)室：將懸浮分散的單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放人樣品管。圖），中心處能量最高。前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測量到0.流式細(xì)胞分析儀器是一項(xiàng)集多學(xué)科知識(shí)綜合應(yīng)用的復(fù)雜儀器，除了對儀器各方面性能指標(biāo)有嚴(yán)格的要求以外，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品處理方面也需要有豐富的基礎(chǔ)理論及操作經(jīng)驗(yàn)。熒光信號(hào)當(dāng)激光光束與細(xì)胞正交時(shí)，一般會(huì)產(chǎn)生兩種熒光信號(hào)。如當(dāng)人類感染免疫缺陷病病毒(Humanimmuno-deficiencyvirus，HIV)后，HIV主要選擇地侵入人類具有重要免疫功能的T淋巴細(xì)胞亞群中的輔助性T細(xì)胞，即Th細(xì)胞(CD4＋)，使具有重要免疫功能的T細(xì)胞群被破壞，繼而累及全身免疫器官，使機(jī)體免疫功能下降。一、生物學(xué)顆粒分析原理應(yīng)用流式細(xì)胞儀對于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行快速的、多參數(shù)的定量分析和分選的技術(shù)稱為流式細(xì)胞技術(shù)。由于細(xì)胞的快速流動(dòng)，每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時(shí)間僅為1μs左右，且細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強(qiáng)度。對同一細(xì)胞的參數(shù)測定技術(shù)則導(dǎo)致了對細(xì)胞周期的一些新發(fā)現(xiàn)，典型的方法是吖啶橙雙染色技術(shù)。第四節(jié)流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求生物學(xué)顆粒包括大的免疫復(fù)合物、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、細(xì)菌、霉菌、染色體、真核細(xì)胞、雜交細(xì)胞、聚集細(xì)胞等，所檢測的生物顆粒的理化性質(zhì)包括細(xì)胞大小、細(xì)胞形態(tài)、胞漿顆?；潭取NA含量、總蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞膜完整性和酶活性等。白血病是白細(xì)胞在分化到某個(gè)階段受阻后呈克隆性異常增殖的結(jié)果，它的發(fā)病是多階段的，不同病因引起的白血病的發(fā)病機(jī)制不同，在治療和預(yù)防上也不同，所以，利用白細(xì)胞分化不同階段出現(xiàn)的細(xì)胞表面標(biāo)志，可以對白血病進(jìn)行免疫分型，對其進(jìn)行導(dǎo)向治療。血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮其功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，靜止期和活化期的血小板膜糖蛋白受體的種類、含量、結(jié)構(gòu)和功能顯著不同。當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時(shí)，流式細(xì)胞儀就會(huì)在這類細(xì)胞形成液滴時(shí)給含有這類細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時(shí)，依所帶電荷的符號(hào)分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)。這些信號(hào)分別被光電倍增管和光電二極管接收，經(jīng)過計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存、計(jì)算、分析這些數(shù)字化信息，就可得細(xì)胞的大小和核酸含量等指標(biāo)。血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮其功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，靜止期和活化期的血小板膜糖蛋白受體的種類、含量、結(jié)構(gòu)和功能顯著不同。利用流式細(xì)胞儀，采用多色熒光標(biāo)記的單克隆抗體，分析黏附性T細(xì)胞表面CD3＋CD4＋或CD8＋CD19－CD16－CD45RO＋CD62＋CD27＋CD57抗原，從而對LFA-1-adhesiveT細(xì)胞快速準(zhǔn)確地測定。另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記細(xì)胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號(hào)，通過對這類熒光信號(hào)的檢測和定量分析能了解所研究細(xì)胞的性質(zhì)和數(shù)量。當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時(shí)，流式細(xì)胞儀就會(huì)在這類細(xì)胞形成液滴時(shí)給含有這類細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時(shí)，依所帶電荷的符號(hào)分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)。3．絕對計(jì)數(shù)的校準(zhǔn)三、流式細(xì)胞儀操作技術(shù)的質(zhì)量控制分析速度以每秒分析的細(xì)胞數(shù)來表示。流式細(xì)胞儀在使用過程中，光電倍增管隨時(shí)間的增加，其放大功率會(huì)有所改變，對樣品檢測的靈敏度會(huì)產(chǎn)生影響。前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測量到0.短通濾光片特定波長以下的光通過。帶通濾光片帶通濾光片允許一定波長范圍內(nèi)的光通過為保證樣品檢測時(shí)儀器處于最佳工作狀態(tài)，采用質(zhì)控品進(jìn)行PMT校準(zhǔn)，必要時(shí)進(jìn)行電壓補(bǔ)償。帶通濾光片帶通濾光片允許一定波長范圍內(nèi)的光通過（1）熒光信號(hào)線性測量和對數(shù)測量線性放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系，細(xì)胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測量一般選用線性放大測量。選擇主菜單上的重建項(xiàng)選擇的參數(shù)應(yīng)小于8個(gè)碘化丙啶（PI，620nm）與FITC雙染可測知單個(gè)細(xì)胞內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)量的變化；FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片和小孔組成。當(dāng)細(xì)胞攜帶兩種熒光受激光激發(fā)而發(fā)射兩種不同波長的熒光時(shí)，理論上可選擇濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測器檢測，但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間發(fā)射峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊。第四節(jié)流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求噴嘴的振動(dòng)頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的數(shù)目。前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測量到0.散射光信號(hào)是激光照在細(xì)胞上所產(chǎn)生的前向光和側(cè)向光信號(hào)。冷卻水須用過濾器，并保證壓力和流量。（四）信號(hào)檢測與分析當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物，通過激光照射區(qū)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)產(chǎn)生不同波長的熒光信號(hào)。這些信號(hào)以細(xì)胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。1.散射光信號(hào)

射光分為前向角散射和側(cè)向角散射，散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，稱為細(xì)胞的物理參數(shù)（或稱固有參數(shù)）。（1）前向角散射前向角散射與被測細(xì)胞的大小有關(guān)（2）側(cè)向角散射側(cè)向散射光可提供細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。2.熒光信號(hào)當(dāng)激光光束與細(xì)胞正交時(shí)，一般會(huì)產(chǎn)生兩種熒光信號(hào)。一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號(hào)，稱為細(xì)胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記細(xì)胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號(hào)，通過對這類熒光信號(hào)的檢測和定量分析能了解所研究細(xì)胞的性質(zhì)和數(shù)量。2.熒光信號(hào)

（1）熒光信號(hào)線性測量和對數(shù)測量線性放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系，細(xì)胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測量一般選用線性放大測量。在細(xì)胞膜表面抗原等的熒光檢測時(shí)通常使用對數(shù)放大器。（2）熒光信號(hào)的面積和寬度熒光信號(hào)的面積是采用對熒光光通量進(jìn)行積分測量，一般對DNA倍體測量時(shí)采用面積，這是因?yàn)闊晒饷}沖的面積比熒光脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映DNA的含量。熒光信號(hào)的寬度常用來區(qū)分雙連體細(xì)胞。（3）光譜重疊的校正當(dāng)細(xì)胞攜帶兩種熒光受激光激發(fā)而發(fā)射兩種不同波長的熒光時(shí)，理論上可選擇濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測器檢測，但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間發(fā)射峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊。

從右圖中可以看出，陰影為探測器檢測光譜的范圍，F(xiàn)ITC探測器會(huì)探測到少量的PE光譜，而PE探測器則檢測到較多的FITC光譜。圖中點(diǎn)A通過透鏡f成像在A’處，而點(diǎn)B通過透鏡f成像在B’處。在光電倍增管前放上一小孔，作為空間濾波器，排除其它雜散光信號(hào)，從而確保了A點(diǎn)光源進(jìn)不了B’點(diǎn)處，B點(diǎn)光源也進(jìn)不了A’點(diǎn)處。（五）細(xì)胞分選器1．小水滴的形成壓電晶體帶動(dòng)流動(dòng)室振動(dòng)，液流形成水滴。噴嘴的振動(dòng)頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的數(shù)目。當(dāng)噴嘴直徑為50μm時(shí)，信號(hào)頻率為40kHz，則每秒鐘產(chǎn)生4萬個(gè)水滴。若每秒鐘流出的細(xì)胞是1000個(gè)，則平均每40個(gè)水滴中只有一個(gè)水滴是有細(xì)胞的，其他皆為空白。2．邏輯電路

為了分選細(xì)胞，需要細(xì)胞在經(jīng)過測量區(qū)時(shí)判斷出哪個(gè)細(xì)胞滿足了分選的條件，并產(chǎn)生一個(gè)邏輯信號(hào)，此信號(hào)驅(qū)動(dòng)充電脈沖發(fā)生器，使之產(chǎn)生充電脈沖。3．水滴的充電與偏轉(zhuǎn)

當(dāng)水滴從流束上將要斷開時(shí)給整個(gè)流束充電，則水滴從流束上斷開后便帶有同極性的多余表面電荷。下落的水滴通過一對平行板電極形成的靜電場時(shí)，帶正電荷的水滴向帶負(fù)電的電極板偏轉(zhuǎn)，這樣就可用容器收集水滴。（六）FCM測量數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析目前FCM數(shù)據(jù)的存貯的方式均采用列表排隊(duì)(ListMode)方式。目前FCM所采用的都是多參數(shù)指標(biāo)，熒光標(biāo)記物參數(shù)數(shù)量在逐漸增多。采用ListMode方式可大量節(jié)約內(nèi)存和磁盤容量。第三節(jié)流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)一、熒光測量靈敏度靈敏度的高低是衡量儀器檢測微弱熒光信號(hào)的重要指標(biāo)。一般以能檢測到單個(gè)微球上最少標(biāo)有FITC或PE熒光分子數(shù)目來表示，現(xiàn)在的FCM均可達(dá)到檢測小于100個(gè)熒光分子的指標(biāo)。二、儀器的分辨率分辨率是衡量儀器測量精度的指標(biāo)，通常用變異系數(shù)CV(CoefficientofVariation)值表示：(δ是分布的標(biāo)準(zhǔn)誤差，μ是分布的平均值)或（2）熒光信號(hào)的面積和寬度若每秒鐘流出的細(xì)胞是1000個(gè)，則平均每40個(gè)水滴中只有一個(gè)水滴是有細(xì)胞的，其他皆為空白。臨床型只有分析功能，沒有分選功能，操作簡便，易學(xué)易掌握。流式細(xì)胞儀在使用過程中，光電倍增管隨時(shí)間的增加，其放大功率會(huì)有所改變，對樣品檢測的靈敏度會(huì)產(chǎn)生影響。對同一細(xì)胞的參數(shù)測定技術(shù)則導(dǎo)致了對細(xì)胞周期的一些新發(fā)現(xiàn)，典型的方法是吖啶橙雙染色技術(shù)。激光是一種相干光源，它能提供單波長、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照。前者的光斑直徑大于被檢細(xì)胞體積，只能提供細(xì)胞內(nèi)某種生物化學(xué)成分的參數(shù)。FCM在血液細(xì)胞的分類、分型，造血細(xì)胞分化的研究，血細(xì)胞中各種酶的定量分析，如過氧化物酶、非特異性酯酶等方面應(yīng)用廣泛。生物學(xué)顆粒包括大的免疫復(fù)合物、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、細(xì)菌、霉菌、染色體、真核細(xì)胞、雜交細(xì)胞、聚集細(xì)胞等，所檢測的生物顆粒的理化性質(zhì)包括細(xì)胞大小、細(xì)胞形態(tài)、胞漿顆?；潭?、DNA含量、總蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞膜完整性和酶活性等。Ts細(xì)胞增高，NK細(xì)胞減少或活力下降，B淋巴細(xì)胞群則在正常范圍；在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細(xì)胞懸液形成樣品流垂直進(jìn)入流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室，染色的細(xì)胞受激光照射后發(fā)出熒光，同時(shí)產(chǎn)生光散射。第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色激光是一種相干光源，它能提供單波長、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照。前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測量到0.流式細(xì)胞分析儀器是一項(xiàng)集多學(xué)科知識(shí)綜合應(yīng)用的復(fù)雜儀器，除了對儀器各方面性能指標(biāo)有嚴(yán)格的要求以外，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品處理方面也需要有豐富的基礎(chǔ)理論及操作經(jīng)驗(yàn)。熒光信號(hào)來自于細(xì)胞的自發(fā)熒光或被分析細(xì)胞經(jīng)特異性熒光標(biāo)記染色后通過激光束激發(fā)后所產(chǎn)生的。在流路校正物中，有標(biāo)準(zhǔn)大小的熒光微球，其物理性質(zhì)、生物學(xué)特性和化學(xué)特性均經(jīng)過標(biāo)定。依據(jù)增殖指數(shù)可了解群體細(xì)胞的增殖活力。細(xì)胞分選系統(tǒng)等五個(gè)部分。在樣本測定時(shí)，以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行絕對計(jì)數(shù)，從而獲得絕對計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)值。流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)可分為流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；三、前向角散射光檢測靈敏度前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測量到0.2～0.5μm左右。四、FCM分析速度分析速度以每秒分析的細(xì)胞數(shù)來表示。當(dāng)細(xì)胞流過光束的速度超過FCM儀器響應(yīng)速度時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生的熒光信號(hào)就會(huì)丟失，這段時(shí)間稱為儀器的死時(shí)間。死時(shí)間越短，儀器處理數(shù)據(jù)越快，一般可達(dá)到3000～6000個(gè)/秒左右。大型機(jī)已達(dá)到每秒幾萬個(gè)細(xì)胞。五、FCM分選指標(biāo)分選指標(biāo)主要包括分選速度、分選純度和分選收獲率。分選速度指每秒可提取所要細(xì)胞的個(gè)數(shù)。分選純度指要分選的目的細(xì)胞占分選出細(xì)胞的百分比。分選收獲率指被分出的細(xì)胞與原來溶液中該細(xì)胞的百分比。第四節(jié)流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求

流式細(xì)胞分析儀器是一項(xiàng)集多學(xué)科知識(shí)綜合應(yīng)用的復(fù)雜儀器，除了對儀器各方面性能指標(biāo)有嚴(yán)格的要求以外，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品處理方面也需要有豐富的基礎(chǔ)理論及操作經(jīng)驗(yàn)。一、檢測樣品制備的重要性因?yàn)榱魇郊?xì)胞儀測量的是每個(gè)細(xì)胞所產(chǎn)生的散射光和熒光信號(hào)，如果兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞間粘連重疊或細(xì)胞碎片過多，都會(huì)影響信號(hào)的收集及所收集信號(hào)的真實(shí)性，所以制備單細(xì)胞懸液是進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析最關(guān)鍵的第一步。二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色

散射光信號(hào)是激光照在細(xì)胞上所產(chǎn)生的前向光和側(cè)向光信號(hào)。熒光信號(hào)來自于細(xì)胞的自發(fā)熒光或被分析細(xì)胞經(jīng)特異性熒光標(biāo)記染色后通過激光束激發(fā)后所產(chǎn)生的。因此，被分析細(xì)胞在制備成單細(xì)胞懸液后，經(jīng)過與熒光染料染色后才能上機(jī)進(jìn)行檢測。焦寧Y與異硫氰酸熒光素（FITC，530nm）分別是RNA與蛋白質(zhì)的特異性染料；碘化丙啶（PI，620nm）與FITC雙染可測知單個(gè)細(xì)胞內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)量的變化；丫啶橙（AO，488nm）染色法不僅可測定單個(gè)細(xì)胞DNA與RNA含量，還可區(qū)分出G0與G1期細(xì)胞；若丹明123（rhodamin123）是線粒體特殊染料。三、流式細(xì)胞儀操作技術(shù)的質(zhì)量控制在臨床檢測中，應(yīng)對各個(gè)工作環(huán)節(jié)和儀器性能進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和規(guī)范化操作，以保證各項(xiàng)檢測數(shù)據(jù)和指標(biāo)的可靠性。1．光路與流路校正主要目的在于確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，使儀器檢測時(shí)的變異減少到最小，從而控制儀器的CV值。在流路校正物中，有標(biāo)準(zhǔn)大小的熒光微球，其物理性質(zhì)、生物學(xué)特性和化學(xué)特性均經(jīng)過標(biāo)定。2．PMT校準(zhǔn)

流式細(xì)胞儀在使用過程中，光電倍增管隨時(shí)間的增加，其放大功率會(huì)有所改變，對樣品檢測的靈敏度會(huì)產(chǎn)生影響。為保證樣品檢測時(shí)儀器處于最佳工作狀態(tài)，采用質(zhì)控品進(jìn)行PMT校準(zhǔn)，必要時(shí)進(jìn)行電壓補(bǔ)償。3．絕對計(jì)數(shù)的校準(zhǔn)

為保證儀器在計(jì)數(shù)時(shí)的準(zhǔn)確性，儀器應(yīng)采用絕對計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品建立絕對計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)標(biāo)定的，如以計(jì)算1000個(gè)細(xì)胞為1ml，作為設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。在樣本測定時(shí)，以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行絕對計(jì)數(shù)，從而獲得絕對計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)值。第五節(jié)FCM的維護(hù)及常見故障的排除一、儀器的維護(hù)1.激光電源的波動(dòng)范圍應(yīng)小于±10%。2.冷卻水須用過濾器，并保證壓力和流量。3.室溫在18℃～24℃，相對濕度小于85%。4.安裝單獨(dú)的可靠的地線。5.儀器操作必須有經(jīng)過培訓(xùn)的人員操作。6.樣品和鞘液管道每周應(yīng)用漂白粉液清洗。故障信息引起故障的原因解決方法清洗液高度錯(cuò)誤清洗液少了加清洗液清洗液高度警示清洗液傳感器失靈與公司聯(lián)系數(shù)據(jù)處理速率錯(cuò)誤數(shù)據(jù)太大，難以處理稀釋樣品文件名錯(cuò)誤輸入的文件名與系統(tǒng)沖突輸入另一個(gè)文件名二、常見故障及排除故障信息引起故障的原因解決方法存取數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤流式細(xì)胞儀不能存取數(shù)據(jù)關(guān)開計(jì)算機(jī)重試程序錯(cuò)誤軟件不能執(zhí)行該程序選擇主菜單上的重建項(xiàng)程序號(hào)太大程序號(hào)不能大于32取消一些程序，再輸入相應(yīng)號(hào)碼沒有激光束激光器關(guān)閉檢查電源，開激光器故障信息引起故障的原因解決方法激光器開啟錯(cuò)誤激光器門打開關(guān)激光器門參數(shù)太多選擇的參數(shù)應(yīng)小于8個(gè)取消某些參數(shù)，重新選擇參數(shù)不存在程序中無此參數(shù)重新建立程序故障信息引起故障的原因解決方法樣品壓力錯(cuò)誤因?yàn)闃悠饭軌牧?，樣品不能被壓入流?dòng)室換一個(gè)樣品管建立樣品壓力錯(cuò)誤流式細(xì)胞儀連接錯(cuò)誤檢查連接，開關(guān)機(jī)重試鞘液高度錯(cuò)誤鞘液太少補(bǔ)充鞘液第六節(jié)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用一、流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)廣泛地應(yīng)用于免疫理論研究及其臨床實(shí)踐，所以有人稱之為現(xiàn)代免疫技術(shù)基石之一。尤其同單克隆抗體的結(jié)合應(yīng)用，在淋巴細(xì)胞及其亞群分析、淋巴細(xì)胞功能分析、免疫分型、分選、腫瘤細(xì)胞的免疫檢測、研究細(xì)胞周期等方面都起著相當(dāng)重要的作用。淋巴細(xì)胞及其亞群分析如當(dāng)人類感染免疫缺陷病病毒(Humanimmuno-deficiencyvirus，HIV)后，HIV主要選擇地侵入人類具有重要免疫功能的T淋巴細(xì)胞亞群中的輔助性T細(xì)胞，即Th細(xì)胞(CD4＋)，使具有重要免疫功能的T細(xì)胞群被破壞，繼而累及全身免疫器官，使機(jī)體免疫功能下降。檢測的免疫指標(biāo)表現(xiàn)為：T淋巴細(xì)胞總數(shù)減少(正常值的65%～81%)；T細(xì)胞亞群比值倒置，即Th/Ts<1.0(正常1.3∶12～2.1∶1)；Th細(xì)胞(CD4＋)絕對計(jì)數(shù)<200個(gè)/μL(正常值400～1500細(xì)胞/μL)，CD8＋

T細(xì)胞在感染早期增多，后期則下降；Ts細(xì)胞增高，NK細(xì)胞減少或活力下降，B淋巴細(xì)胞群則在正常范圍；CD4＋/CD8＋明顯低于健康成人(P<0.01)。利用流式細(xì)胞儀，采用多色熒光標(biāo)記的單克隆抗體，分析黏附性T細(xì)胞表面CD3＋CD4＋或CD8＋CD19－CD16－CD45RO＋CD62＋CD27＋CD57抗原，從而對LFA-1-adhesiveT細(xì)胞快速準(zhǔn)確地測定。白血病免疫分型白血病是白細(xì)胞在分化到某個(gè)階段受阻后呈克隆性異常增殖的結(jié)果，它的發(fā)病是多階段的，不同病因引起的白血病的發(fā)病機(jī)制不同，在治療和預(yù)防上也不同，所以，利用白細(xì)胞分化不同階段出現(xiàn)的細(xì)胞表面標(biāo)志，可以對白血病進(jìn)行免疫分型，對其進(jìn)行導(dǎo)向治療。應(yīng)用流式細(xì)胞儀四色熒光標(biāo)記技術(shù)，CD45/SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)門方法，能清楚地區(qū)分各種免疫細(xì)胞，可準(zhǔn)確、客觀地進(jìn)行白血病免疫分型。血小板膜表面受體檢測血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮其功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，靜止期和活化期的血小板膜糖蛋白受體的種類、含量、結(jié)構(gòu)和功能顯著不同。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測血小板膜上受體，主要是對血小板特異性膜糖蛋白和活化標(biāo)志物進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，結(jié)合單克隆抗體和免疫熒光技術(shù)，用不同的抗血小板單克隆抗體，可以從分子水平上診斷血小板功能和數(shù)量的異常。細(xì)胞因子的檢測細(xì)胞因子(cytokine)是由免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞合成和分泌的小分子多肽，在調(diào)節(jié)機(jī)體多種細(xì)胞的生長、分化和功能，調(diào)節(jié)正常與病理狀態(tài)下的免疫應(yīng)答過程中起著十分重要的作用。應(yīng)用流式細(xì)胞儀結(jié)合間接免疫熒光法，可在單細(xì)胞水平上客觀、正確地檢測細(xì)胞內(nèi)多個(gè)細(xì)胞因子，并可區(qū)分表達(dá)特定細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群，進(jìn)行多參數(shù)相關(guān)分析，是一種有效地在單細(xì)胞水平研究細(xì)胞因子的方法。臨床型只有分析功能，沒有分選功能，操作簡便，易學(xué)易掌握。分選速度指每秒可提取所要細(xì)胞的個(gè)數(shù)。圖），中心處能量最高。（六）FCM測量數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析在樣本測定時(shí)，以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行絕對計(jì)數(shù)，從而獲得絕對計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)值。3．絕對計(jì)數(shù)的校準(zhǔn)（2）熒光信號(hào)的面積和寬度三、流式細(xì)胞儀操作技術(shù)的質(zhì)量控制當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時(shí)，流式細(xì)胞儀就會(huì)在這類細(xì)胞形成液滴時(shí)給含有這類細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時(shí)，依所帶電荷的符號(hào)分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)。熒光信號(hào)當(dāng)激光光束與細(xì)胞正交時(shí)，一般會(huì)產(chǎn)生兩種熒光信號(hào)。樣品和鞘液管道每周應(yīng)用漂白粉液清洗。激光是一種相干光源，它能提供單波長、