酵母基因工程

酵母基因工程第1頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容第一節(jié)

酵母基因工程表達(dá)體系酵母基因表達(dá)宿主系統(tǒng)酵母菌表達(dá)載體酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)第二節(jié)

常見的酵母基因表達(dá)系統(tǒng)第三節(jié)

影響外源基因表達(dá)的因素第四節(jié)

酵母基因工程應(yīng)用舉例第2頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)酵母基因表達(dá)體系——宿主系統(tǒng)酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物，分屬于子囊菌綱、擔(dān)子菌綱、半知菌類，共由56個屬和500多個種組成。酵母菌是比較成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。第3頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月作為宿主細(xì)胞的酵母需滿足的基本要求①安全無毒，沒有致病性。②遺傳背景清楚，容易進(jìn)行遺傳操作。③外源DNA容易導(dǎo)入宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率高。④培養(yǎng)條件簡單，容易進(jìn)行高密度發(fā)酵。⑤有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力。⑥有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾加工能力。第4頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢①全基因組測序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡便②能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中③具有原核細(xì)菌無法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)④大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡單、成本低廉⑤不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素，美國FDA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)⑥酵母菌是最簡單的真核模式生物第5頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的酵母宿主菌目前已廣泛用于外源基因表達(dá)和研究的酵母菌包括：釀酒酵母屬如釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克魯維酵亞母屬如乳酸克魯維酵母（Kluyveromyceslactis）假絲酵母屬如產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)畢赤酵母屬如巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母屬如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe），解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。第6頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌表達(dá)宿主系統(tǒng)（1）釀酒酵母優(yōu)點：釀酒酵母長期廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)，不產(chǎn)生毒素，安全性好，已被FDA認(rèn)定為安全性生物，其表達(dá)產(chǎn)物不需經(jīng)過大量宿主安全性實驗生長迅速，工藝簡單，成本低是真核生物，可以對蛋白進(jìn)行翻譯后加工表達(dá)產(chǎn)物可分泌表達(dá)，易于純化遺傳背景清楚，易進(jìn)行操作第7頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌表達(dá)宿主系統(tǒng)釀酒酵母的缺點：發(fā)酵時會產(chǎn)生乙醇，難以進(jìn)行高密度發(fā)酵，直接導(dǎo)致外源基因很難達(dá)到很高的水平缺乏強(qiáng)有力的受嚴(yán)格調(diào)控的啟動子，分泌的蛋白質(zhì)能力較差釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問題在于其超糖基化能力，往往使得有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能大量分泌表達(dá)菌株傳代不穩(wěn)定，表達(dá)質(zhì)粒易丟失分泌效率低，大于30KD的蛋白質(zhì)幾乎不分泌第8頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌表達(dá)宿主系統(tǒng)（2）乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)可以高密度發(fā)酵，不需要甲醇防爆裝置，工業(yè)化生產(chǎn)時不降低生產(chǎn)率及酵母菌的再繁殖能力。乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒pKD1已被廣泛用作重組異源蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體，即便在無選擇壓力的條件下，也能穩(wěn)定遺傳40代以上。乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白，性能均優(yōu)于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。第9頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌表達(dá)宿主系統(tǒng)（3）產(chǎn)朊假絲酵母食品及藥品工業(yè)的安全生物不具有酵解抑制有氧氧化效應(yīng)，因而在嚴(yán)格好氣的條件下不會產(chǎn)生乙醇發(fā)酵密度高，在高密度發(fā)酵中細(xì)胞干重可以達(dá)到92g/L在廉價的糖蜜中就能生產(chǎn)，成本低第10頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌表達(dá)宿主系統(tǒng)（4）栗酒裂殖酵母裂殖酵母是子囊菌真核單細(xì)胞生物，是一類不能出芽生殖而只能以分裂和產(chǎn)孢子的方式繁殖的一類酵母。與其他酵母相比，它具有更多的與高等真核生物相似的特性：線粒體結(jié)構(gòu)，啟動子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄機(jī)制，對蛋白N-端乙?；δ芫咏诓溉閯游锛?xì)胞。已有多種蛋白利用此系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)，如人蛋白凝血因子VIIIa，人白細(xì)胞介素IL-6等。第11頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌表達(dá)宿主系統(tǒng)（5）巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)巴斯德畢赤酵母是一種甲基營養(yǎng)菌，能在甲醇培養(yǎng)基中生長，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)。表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢：生長迅速、強(qiáng)啟動子（乙醇氧化酶基因AOX1）、可誘導(dǎo)表達(dá)。由于巴斯德畢赤酵母沒有合適的自主復(fù)制型載體，所以外源基因序列一般整合入受體的染色體DNA上。其外源基因的高效表達(dá)在很大程度上取決于整合拷貝數(shù)的多寡。目前已有20余種具有經(jīng)濟(jì)價值的重組蛋白在該系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。第12頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母表達(dá)載體酵母質(zhì)粒載體既可以在大腸桿菌復(fù)制與擴(kuò)增、又可以在酵母系統(tǒng)中復(fù)制與擴(kuò)增，故此類載體又稱為穿梭載體（shuttlevector）。酵母菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體是由來自酵母的部分核酸序列和細(xì)菌的部分核酸序列所組成，其原核部分主要包括可以在大腸桿菌中復(fù)制的起點序列(Ori)和特定的抗生素抗性基因序列，這兩個部分主要是作為在大腸桿菌宿主時增殖和篩選組分。酵母部分包括酵母轉(zhuǎn)化子的篩選組分，主要是與宿主互補(bǔ)的營養(yǎng)缺陷型基因序列(如：HIS4基因序列)或特定的抗生素抗性基因序列(如：抗Zeoein的基因序列)，以及編碼特定蛋白的基因啟動子和終止子序列。第13頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母表達(dá)載體1．酵母載體的基本結(jié)構(gòu)DNA復(fù)制起始區(qū)：通常來自于2μ質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)及酵母基因組的自主復(fù)制序列篩選標(biāo)記：營養(yǎng)缺陷型篩選或者抗性篩選整合介導(dǎo)區(qū):能有效介導(dǎo)載體與宿主之間發(fā)生同源重組有絲分裂穩(wěn)定區(qū)表達(dá)盒：啟動子，分泌信號序列，終止子第14頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母表達(dá)載體釀酒酵母中的2μ環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀質(zhì)粒，拷貝數(shù)達(dá)50至100個。IRs反向重復(fù)序列，600bpFLP編碼產(chǎn)物驅(qū)動IRs的同源重組REP編碼產(chǎn)物控制質(zhì)粒的穩(wěn)定性STBREP的結(jié)合位點接合酵母屬中的pSR1和pSB1，以及克魯維酵母屬中的pKD1等均與2μ質(zhì)粒類似。第15頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母表達(dá)載體2．酵母載體的種類酵母載體按照用途不同可分為克隆載體和表達(dá)載體兩類酵母克隆表達(dá)載體根據(jù)其在酵母中復(fù)制形式來分類。分為下列五類：酵母整合型質(zhì)粒YIp酵母附加體質(zhì)粒YEp酵母復(fù)制型質(zhì)粒YRp酵母著絲粒質(zhì)粒YCp酵母人工染色體YAC第16頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母表達(dá)載體（1）酵母整合型質(zhì)粒YIp：缺乏酵母的復(fù)制起始位點，不能在酵母中自主復(fù)制，含有酵母的篩選標(biāo)記ura3基因。具有整合介導(dǎo)區(qū)，所以，它只有整合到酵母染色體中才能穩(wěn)定。

含有酵母菌染色體DNA同源序列的YIp質(zhì)粒的構(gòu)建在大腸桿菌質(zhì)粒上組裝酵母菌染色體DNA特定序列和標(biāo)記基因，構(gòu)建出來的質(zhì)粒稱為YIp。目的基因表達(dá)盒通常插在染色體DNA特定序列中，這樣目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色體DNA區(qū)域。第17頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母表達(dá)載體（2）酵母附加體質(zhì)粒YEp：含有釀酒酵母2μ質(zhì)粒DNA復(fù)制有關(guān)的序列，該載體在酵母細(xì)胞中穩(wěn)定，拷貝數(shù)可達(dá)60-100。轉(zhuǎn)化效率高。（3）酵母復(fù)制型質(zhì)粒YRp：含有來源于酵母的DNA復(fù)制起始區(qū)(ARS)，能在酵母染色體外自主復(fù)制的一種自主復(fù)制型載體，雖然其轉(zhuǎn)化效率高，在宿主的拷貝數(shù)可以達(dá)上百個。ARS為酵母菌中的自主復(fù)制序列，0.8-1.5kb，染色體上每30-40kb就有一個ARS元件。以ARS為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YRp，以2μ質(zhì)粒上的復(fù)制元件為復(fù)制子的質(zhì)粒稱為YEp上述兩類質(zhì)粒在釀酒酵母中的拷貝數(shù)最高可達(dá)200個，但培養(yǎng)幾代后，質(zhì)粒的丟失率高達(dá)50%-70%，主要是由于分配不均勻所致。第18頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母表達(dá)載體（4）酵母著絲粒質(zhì)粒YCp：含有酵母染色體著絲粒的DNA片段，這種載體在細(xì)胞分裂過程中，在母細(xì)胞和子細(xì)胞之間平均分配，表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性(d)。CEN為酵母菌染色體DNA上與染色體均勻分配有關(guān)的序列,將CENDNA插入含ARS的質(zhì)粒中，獲得的新載體稱為YCp.YCp質(zhì)粒具有較高的有絲分裂穩(wěn)定性，但拷貝數(shù)只有1-5個。第19頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母表達(dá)載體（5）酵母人工染色體YAC：酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。YAC具有自主復(fù)制序列（ARS）、著絲粒序列（CEN）和端粒序列（TEL），克隆位點以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。YAC載體在宿主細(xì)胞中以線性雙鏈DNA存在，具有高度的遺傳穩(wěn)定性。YAC還具有酵母菌染色體的一些特點?？山邮?00-1000kb的外源DNA片段。第20頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母表達(dá)載體YAC主要結(jié)構(gòu)：①兩個可在酵母菌中利用的選擇基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；②酵母菌著絲粒序列(centromere4,CEN4)；③一個自主復(fù)制序列(ARS1)；④兩個來自嗜熱四膜蟲(Tetrahymennathermophilp)的末端重復(fù)序列(TEL)，以保持重組YAC為線狀結(jié)構(gòu)；⑤在兩個末端序列中間，有一段填充序列(stuff,HIS3)，以便pYAC4在細(xì)菌細(xì)胞中穩(wěn)定擴(kuò)增；⑥Ampr抗性及細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制原點；⑦一個EcoRⅠ克隆位點，該位點位于酵母菌Sup4tRNA基因內(nèi)。第21頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌轉(zhuǎn)化方法原生質(zhì)球法：酶解酵母細(xì)胞壁，產(chǎn)生原生質(zhì)球，原生質(zhì)體在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允許DNA進(jìn)入，然后使原生質(zhì)球再生新的細(xì)胞壁?？梢詫崿F(xiàn)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%。

Li+鹽轉(zhuǎn)化方法：釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子（如Li+等）處理后，在PEG存在下和熱休克之后可高效吸收質(zhì)粒DNA。醋酸鋰對釀酒酵母有效，對畢赤酵母無效，畢赤酵母轉(zhuǎn)化一般用氯化鋰有效優(yōu)點：吸收線型DNA的能力明顯大于環(huán)狀DNA（相差80倍）第22頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌轉(zhuǎn)化方法電擊轉(zhuǎn)化法：原理是通過利用高壓電脈沖作用，造成細(xì)胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，形成可逆的瞬間通道，不僅有利于離子和水進(jìn)入細(xì)胞，也有利于外源DNA等大分子進(jìn)入優(yōu)點：不依賴于受體細(xì)胞的遺傳特征及培養(yǎng)條件；適用范圍廣；轉(zhuǎn)化率高（達(dá)105/μgDNA）。PEG轉(zhuǎn)化法：PEG1000聚乙二醇英文名polyethyleneglycol化學(xué)結(jié)構(gòu)：第23頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌轉(zhuǎn)化方法用于轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因(1)營養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)基因營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA等但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難(2)顯性標(biāo)記基因——其編碼產(chǎn)物主要是毒性物質(zhì)的抗性蛋白第24頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母菌轉(zhuǎn)化方法:顯性標(biāo)記基因標(biāo)記基因編碼產(chǎn)物遺傳表型aph氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶抗G418cat氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗氯霉素dhfr二氫葉酸還原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1銅離子螯合物耐受銅離子suc2蔗糖轉(zhuǎn)化酶耐受高濃度蔗糖ilv2乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草劑第25頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)常見的酵母基因表達(dá)系統(tǒng)一、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)1．啟動子組成型表達(dá)的啟動子：磷酸甘油酸激酶（PGKl）啟動子、甘油醛磷酸脫氫酶（GAPDH或GAPl）啟動子可控性啟動子：半乳糖啟動子（GAL）、酸性磷酸酶啟動子（PHO）、乙醇脫氫酶（ADH2）啟動子、Cu2+螯合蛋白啟動子（CUPI）以及交配a型阻遏系統(tǒng)（MATa/a）第26頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第27頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月釀酒酵母表達(dá)載體目前已建立的釀酒酵母表達(dá)載體有（1）酵母附加體質(zhì)粒(YEp)（見右圖）；（2）酵母復(fù)制型質(zhì)粒(YRp)；（3）酵母著絲粒質(zhì)粒(YCp)；（4）酵母整合型質(zhì)粒(YIp)；（5）酵母人工染色體(YAC)。前三類統(tǒng)稱為游離自主復(fù)制型質(zhì)粒載體。含有來自酵母基因組的復(fù)制起始區(qū)ARS或者酵母天然質(zhì)粒2μ復(fù)制起點序列，能夠自主復(fù)制，通常為多拷貝數(shù)第28頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月釀酒酵母宿主——突變株有些蛋白酶缺陷有利于重組異源蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。如pep4-3突變株中蛋白酶的活性顯著降低，對外源基因表達(dá)產(chǎn)物的降解作用較小。為了減少目的蛋白的過度糖基化，目前已從野生型的釀酒酵母中分離出許多類型的糖基化途徑突變株，如甘露聚糖合成缺陷型的mnn突變株、天門冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷的alg突變株以及外側(cè)糖鏈缺陷型的och突變株等。在這些突變株中，具有重要實用價值的是mnn9、och1、och2、alg1和alg2，因為它們不能在異源蛋白的天門冬酰胺側(cè)鏈上延長甘露多聚糖長鏈。第29頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月提高重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的突變宿主菌突變類型生物效應(yīng)作用位點ssc1改善重組蛋白分泌鈣離子依賴型的ATP酶ssc11改善重組蛋白分泌羧肽酶Yssc2提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄后加工rgr1提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平ose1提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平rho-提高重組蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平第30頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月抑制超糖基化作用的突變宿主菌許多真核生物的蛋白質(zhì)在其天冬酰胺側(cè)鏈上接有寡糖基團(tuán)，它們常常影響蛋白質(zhì)的生物活性。整個糖單位由糖基核心和外側(cè)糖鏈兩部分組成。酵母菌普遍擁有蛋白質(zhì)的糖基化系統(tǒng)，但野生型釀酒酵母對異源蛋白的糖基化反應(yīng)很難控制，呈超糖基化傾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。能抑制超糖基化的突變類型突變類型生物效應(yīng)mnn甘露糖生物合成缺陷型alg天冬酰胺側(cè)鏈糖基化缺陷型och外側(cè)糖鏈添加缺陷型第31頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月二、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

1.啟動子（1）AOX1和AOX2啟動子（2）三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldeyde3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）啟動子（3）甲醛脫氫酶（formaldehydedehydrogenase,FLD）啟動子第32頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月2.畢赤酵母表達(dá)載體類型

胞內(nèi)表達(dá)載體pPICZαA,B,C分泌型表達(dá)載體pPICZαA,B,C第33頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月3.載體的整合方式畢赤酵母表達(dá)載體上無酵母復(fù)制起點，它是靠AOX1或HIS4基因的位置同源重組整合入酵母染色體DNA中，并隨酵母的生長傳代穩(wěn)定地存在。整合的方式可以是單交換插入，亦可雙交換插入，一般來說前一種方式更容易發(fā)生。第34頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月4宿主常用的畢赤酵母受體菌株有：組氨酸缺陷型GSl15和SMD1168，腺嘌呤缺陷型PMAD11，PMAD16，其中SMD1168為蛋白酶缺陷型，以其作為宿主表達(dá)蛋白可以降低表達(dá)產(chǎn)物的降解。這些表達(dá)宿主都是由野生品系NRRL-Y11430衍生來的。最常用的受體菌是Cregg在1985年建立的GS115，它含有一個組氨醇脫氫酶缺陷型基因His4，可接受含His4的載體而具有His+表型來篩選轉(zhuǎn)化子。根據(jù)對甲醇利用的情況，畢赤酵母可劃分為三種表型。菌株含有AOX1和AOX2基因，在含甲醇的培養(yǎng)基中生長速率與野生型類似，稱為甲醇利用正表型（Mut+），如GS115；當(dāng)AOX1被其他基因取代，則需依賴AOX2，但其甲醛代謝速度慢，稱為甲醇利用慢表型（Muts），如KM71。當(dāng)AOX基因全部缺失，則不能利用甲醇，稱為甲醇利用負(fù)表型（Mut-），如MC100-3。后兩者胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白質(zhì)有時優(yōu)于野生株，且需甲醇較少。此外為增加分泌蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168(his4,prb1)。第35頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)影響外源基因表達(dá)的因素一、轉(zhuǎn)錄水平控制——外源基因穩(wěn)態(tài)mRNA的濃度二、表達(dá)載體的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性三、其他因素1.優(yōu)化翻譯起始區(qū)前后mRNA的二級結(jié)構(gòu)，提高外源基因mRNA的翻譯活性2.酵母菌對密碼子的偏愛性:在釀酒酵母中，高豐度的蛋白質(zhì)（如甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脫氫酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25個密碼子編碼3.避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的降解，選擇或改造宿主，如：采用二倍體宿主、采用釀酒酵母以外的酵母菌作為宿主4.優(yōu)化工程菌發(fā)酵工藝第36頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)酵母基因工程應(yīng)用實例利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗急慢性乙型肝炎誘因——乙型肝炎病毒（HBV）每年約有200萬病人死亡，并有3億人成為HBV攜帶者，其中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者。目前對乙型肝炎病毒還沒有一種有效的治療藥物第37頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)乙肝病毒是一種蛋白包裹型的雙鏈DNA病毒，病毒顆粒呈乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)球面狀，直徑為42nm，基因組僅為3.2kb。病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白是表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化兩種形式。顆粒內(nèi)的蛋白包括核心抗原（HBcAg）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。此外，被乙肝病毒感染的人肝臟還能合成并釋放大量的22nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是各種未裝配的包裝蛋白的1000倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白：S、M、L多肽。第38頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因第39頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞膜上提取出來的。這種來源的疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。20世紀(jì)80年代開始選擇釀酒酵母表達(dá)重組HBsAg，主要工作包括將S多肽的編碼置于ADH1啟動子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為22nm，其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。目前，由釀酒酵母生產(chǎn)的重組H