中華蟾蜍大型基因組揭示其“成功”的秘訣

中華蟾蜍大型基因組揭示其“成功”的秘訣中華蟾蜍（Bufogargarizans）隸屬蟾蜍科蟾蜍屬，俗名“癩蛤蟆”，是我國常見且為人熟知的兩棲動(dòng)物。蟾蜍在我國的傳統(tǒng)文化中占有重要地位，其也是象征招財(cái)進(jìn)寶的吉祥物。此外，蟾蜍還具有較高的醫(yī)藥研究價(jià)值，其耳后腺和背部皮膚的分泌物有較強(qiáng)毒性、成分復(fù)雜，主要是強(qiáng)心甾類化合物和生物堿，統(tǒng)稱為蟾蜍毒素（Bufotoxin），有麻醉止痛的功效。蟾蜍科（Bufonidae）物種分布廣泛，在除澳大利亞、馬達(dá)加斯加及南極洲之外的各大洲均有分布。甘蔗蟾蜍（Rhinellamarina）在被人為引入澳洲后，迅速入侵土著物種的生境，泛濫成災(zāi)，破壞了生態(tài)系統(tǒng)。中華蟾蜍在我國分布廣泛，從島嶼到高原均有其足跡，其食性廣泛，可適應(yīng)不同的生境，強(qiáng)烈的毒性讓一些潛在的捕食者（蛇類等）望而卻步。目前，學(xué)界尚不清楚蟾蜍廣布適應(yīng)性的遺傳機(jī)制，通過基因組測序和組裝可幫助學(xué)界更好地了解該物種。與其他動(dòng)物相比，兩棲動(dòng)物的基因組破譯較困難，這主要是由于其基因組普遍較大，無尾兩棲類（anurans）基因組的大小多數(shù)范圍在2到8Gb之間、蚓螈（caecilians）多數(shù)達(dá)~5-10Gb、蠑螈（salamanders）多數(shù)達(dá)~20-60Gb、基因組最大的是一種洞螈（Necturuslewisi），為137Gb；重復(fù)序列占比較高也是造成測序和組裝困難的主要原因之一。因此，目前兩棲動(dòng)物的基因組數(shù)量較少，且多數(shù)組裝呈高度片段化、質(zhì)量不佳。近幾年發(fā)展成熟的長片段測序技術(shù)能夠跨過較長的重復(fù)區(qū)域，結(jié)合基因組輔助組裝技術(shù)，學(xué)界有望得到較高質(zhì)量的兩棲類基因組。為了揭秘中華蟾蜍的適應(yīng)性遺傳機(jī)制，中國科學(xué)院成都生物研究所呂彬、江建平和傅金鐘聯(lián)合華中師大吳華、河南師大陳曉紅、信陽師大宋曉威和西華師大廖文波等高校的科研人員，共同發(fā)起了中華蟾蜍基因組測序項(xiàng)目，破譯了中華蟾蜍基因組，獲得了首個(gè)組裝到染色體是水平的蟾蜍基因組參考圖譜。該研究利用了4種最新的測序組裝技術(shù)來構(gòu)建參考基因組，包括PacBio長讀長測序（103X）、BioNano光學(xué)圖譜（137X）、10xgenomeics（130X）和Hi-C染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)（176X），總計(jì)產(chǎn)生了近3Tb的測序數(shù)據(jù)量。最終，基因組組裝大小約4.55Gb，僅由747條scaffolds構(gòu)成（6,822條for熱帶爪蟾Xenopustropicalis），ScaffoldN50達(dá)539.8Mb，gap占比僅為1.79%，96%的序列可定位到11條染色體上（圖1A和圖2A）。比較發(fā)現(xiàn)，中華蟾蜍與熱帶爪蟾的基因組染色體之間具有良好的共線性，研究人員推測至少經(jīng)歷過1次染色體融合和3次分裂事件（圖3A）。中華蟾蜍基因組是目前兩棲動(dòng)物中連續(xù)性最好的參考基因組（圖1B-D），為兩棲動(dòng)物的基因進(jìn)化和功能以及遺傳學(xué)研究提供了理論支撐。蟾蜍基因組中重復(fù)序列占比為65.5%，大部分為長末端重復(fù)（LTR）序列，這與墨西哥鈍口螈（Ambystomamexicanum）中的發(fā)現(xiàn)較近似，其基因組大小約為32Gb。研究人員推測，LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座復(fù)制產(chǎn)生的大量拷貝可能是兩棲類基因組巨大的重要原因?；蚪Y(jié)構(gòu)注釋和比較發(fā)現(xiàn)，越大的基因組擁有較長的基因間區(qū)和內(nèi)含子，外顯子長度在不同物種間較保守（圖2B）。研究發(fā)現(xiàn)，中華蟾蜍中具有較多的多拷貝基因，在斑馬魚、甘蔗蟾蜍和墨西哥鈍口螈中也存在類似的狀況。斑馬魚經(jīng)歷了硬骨魚全基因組加倍事件，基因復(fù)制數(shù)目在該研究物種中是最多的；而墨西哥鈍口螈基因組是迄今完成測序的最大的動(dòng)物基因組，也發(fā)生了較多的基因復(fù)制事件；甘蔗蟾蜍和中華蟾蜍隸屬蟾蜍科，均是“真蟾蜍”，大多數(shù)復(fù)制是局部發(fā)生的。中華蟾蜍中的基因復(fù)制方式以串聯(lián)（TD）和近端復(fù)制（PD）為主，并且TD和PD受到的正選擇壓力顯著高于其他復(fù)制方式（圖3B和C），研究人員推測這兩種復(fù)制方式可能與其環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)。根據(jù)上述推斷，研究人員分析了中華蟾蜍基因組中基因家族的擴(kuò)張狀況，發(fā)現(xiàn)有122個(gè)基因家族發(fā)生了顯著擴(kuò)張（圖4），化學(xué)感受基因家族顯著富集，包括嗅覺和苦味受體基因。相比而言，中華蟾蜍的中性替換速率不高，處于中間水平，但其祖先經(jīng)歷了快速的進(jìn)化過程（圖4）。和其他脊椎動(dòng)物類似，兩棲動(dòng)物同樣擁有數(shù)目龐大的嗅覺基因（800~1400ORsthisstudy），有功能的嗅覺基因占比為60%~70%，眾多的基因數(shù)目說明嗅覺對兩棲動(dòng)物的生存具有重要意義。中華蟾蜍中共鑒定出1013個(gè)嗅覺基因（圖5A和B），765個(gè)是完整可能有功能的，占比較高（~76%）。就功能和變化趨勢而言，蟾蜍感受空氣中化學(xué)分子的嗅覺基因增多且功能基因比例升高，水中則相反。信息素受體在種內(nèi)和種間通訊中扮演重要角色，研究人員在蟾蜍中鑒定到5個(gè)完整的信息素受體1（V1Rs），但未發(fā)現(xiàn)假基因；4個(gè)完整的信息素受體2（V2Rs）和33個(gè)假基因（圖5C）。V1Rs負(fù)責(zé)檢測空氣中揮發(fā)的小分子，V2Rs則檢測水中的。多物種比較傾向支持從水到陸驅(qū)動(dòng)的動(dòng)態(tài)進(jìn)化假說?？辔妒荏w能夠幫助動(dòng)物感知食物是否有毒?？辔妒荏w（TAS2Rs）在“真蟾蜍”中發(fā)生過3次急劇的擴(kuò)張（圖5D），形成了130多個(gè)功能基因，分布在1,4,6,8和11號染色體上。與其他無尾目物種相比，其家族成員數(shù)目是最多的，完整基因的比例也是最高的（~80%）。蟾蜍分布廣且食性雜，大量的苦味受體有助于提高其毒素檢測的能力。此前關(guān)于美國白蛾入侵機(jī)制的研究（Wuet.al2019）也發(fā)現(xiàn)了苦味受體的顯著擴(kuò)張。蟾蜍利用毒素進(jìn)行防御，但其如何避免自中毒是個(gè)有意思的話題。研究人員發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450基因家族中起代謝解毒作用的CYP2C亞家族在“真蟾蜍”中發(fā)生了顯著擴(kuò)張（圖6A），中華蟾蜍中產(chǎn)生了39個(gè)基因，甘蔗蟾蜍中有35個(gè)，而其他無尾類只有約一半的成員數(shù)。聚類分析發(fā)現(xiàn)蟾蜍枝系特異性的CYP2C擴(kuò)張（圖6A），分布在中華蟾蜍5號染色體上一段約3Mb的區(qū)域內(nèi)（圖6B），通過PD（近端）和TD（串聯(lián)復(fù)制）方式形成。這些擴(kuò)張的家族成員應(yīng)該在祖先物種中就已形成。離子通道基因在防止自中毒過程中發(fā)揮重要的作用，其中的一個(gè)經(jīng)典案例是：箭毒蛙的煙堿乙酰膽堿受體只發(fā)生了1到2個(gè)位置的氨基酸替代就進(jìn)化出毒素耐受性（2017Tarvinet.al）。研究人員發(fā)現(xiàn)，一種煙堿乙酰膽堿受體CHRNE在中華蟾蜍、甘蔗蟾蜍和草莓箭毒蛙基因組中均產(chǎn)生了2個(gè)拷貝（圖7B），通過串聯(lián)復(fù)制產(chǎn)生，可能和抗生物堿毒性有關(guān)；在“真蟾蜍”的鈉鉀離子泵基因的關(guān)鍵毒素結(jié)合區(qū)存在一些獨(dú)有的氨基酸突變（圖7A），先前實(shí)驗(yàn)證明有的位點(diǎn)突變能夠顯著鑒定毒素結(jié)合敏感性，降低程度甚至能夠達(dá)到1000倍以上。這些關(guān)鍵區(qū)域的氨基酸位點(diǎn)在中華蟾蜍和甘蔗蟾蜍中完全一致，說明受到較強(qiáng)的功能限制。進(jìn)化分析表明，與其他物種相比，“真蟾蜍”鈉鉀離子泵基因的經(jīng)歷了快速的進(jìn)化并受到正選擇壓力。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，6個(gè)與牙齒（牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)）形成相關(guān)的基因在“真蟾蜍”祖先中就已丟失（圖8），這和無齒的龜、鳥類、須鯨一致，但均是獨(dú)立丟失的，說明四足動(dòng)物牙齒形成機(jī)制較保守。相關(guān)研究成果以Alargegenomewithchromosome-scaleassemblyshedslightontheevolutionarysuccessofatruetoad(Bufogargarizans)為題，發(fā)表在MolecularEcologyResources上。研究工作得到國家自然基金、四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)項(xiàng)目、生態(tài)環(huán)境部生物多樣性調(diào)查監(jiān)測與評價(jià)項(xiàng)目等的支持。圖1.（A）Hi-C熱圖；（B-D）兩棲無尾類基因組組裝連續(xù)性比較圖2.（A）中華蟾蜍基因組全景；（B）不同動(dòng)物類群基因組的基因區(qū)及基因間區(qū)長度示意圖3.（A）染色體共線性；（B）5種復(fù)制模式統(tǒng)計(jì)；（C）中華蟾蜍不同復(fù)制模式的選擇壓力比較圖4.基因家族進(jìn)化分析。枝顏色代表進(jìn)化速率，黑框內(nèi)數(shù)字為分化時(shí)間，+擴(kuò)張