高效液相基礎(chǔ)知識HPLC培訓(xùn)課件

高效液相基礎(chǔ)知識HPLC色譜法原理與分類HPLC的組成HPLC的應(yīng)用HPLC色譜圖名詞術(shù)語HPLC定量分析原理

高效液相色譜基礎(chǔ)知識2高效液相基礎(chǔ)知識HPLC什么是色譜法色譜法溯源Tswett（茨維特)的實驗色譜法原理色譜法的分類

色譜法原理及分類

3高效液相基礎(chǔ)知識HPLC色譜法是一種現(xiàn)代的分離分析方法1906年正式命名(見諸文獻)20世紀30年代開始廣泛研究和應(yīng)用高效液相色譜法的廣泛應(yīng)用始于20世紀70年代

什么是色譜法

4高效液相基礎(chǔ)知識HPLC100多年前俄國植物學(xué)家Tswett(茨維特)分離植物色素時采用的實驗方法他將植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,結(jié)果色素中各組份互相分離形成各種不同顏色的譜帶Tswett用希臘語chroma(色)和graphos(譜)描述他的實驗方法，即現(xiàn)在的Chromatography(色譜法)

色譜法(Chromatography)溯源5高效液相基礎(chǔ)知識HPLC一根長玻璃管填充碳酸鈣的顆粒將碾碎之植物葉片的提取液灌入柱中隨著石油醚提取液向下流過柱子，現(xiàn)出展寬的色帶分離出不同的化合物

Chromato--顏色

Graphy--圖象

Tswett（茨維特)的實驗

6高效液相基礎(chǔ)知識HPLC是利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解,分配,吸附等化學(xué)作用性能的差異,當(dāng)兩相作相對運動時,使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達到相互分離兩相中有一相是固定的,叫作固定相(StationaryPhase)有一相是流動的,稱為流動相(MobilePhase),流動相又叫洗脫劑,溶劑

色譜法原理

7高效液相基礎(chǔ)知識HPLC相(Phase):

物理化學(xué)術(shù)語,特指在某一系統(tǒng)中,具有相同成分及相同物理、化學(xué)性質(zhì)的均勻物質(zhì)部分。各相之間有明顯可分的界面

8高效液相基礎(chǔ)知識HPLC色譜分離原理

9高效液相基礎(chǔ)知識HPLC按流動相的物態(tài)分:氣相色譜(GasChromatography,GC)

用氣體作為流動相(又叫載氣)液相色譜(LiquidChromatography,LC)

用液體作為流動相(又叫洗脫劑)

色譜法的分類

10高效液相基礎(chǔ)知識HPLC按固定相的形態(tài)分:

平面色譜

o紙色譜

o薄層色譜

柱色譜

色譜法的分類11高效液相基礎(chǔ)知識HPLC色譜法的分類示意圖12高效液相基礎(chǔ)知識HPLC高效液相色譜法

–HPLC(HighPerformanceLiquidChromatography)

–是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜,基于儀器方法的高效能分離手段:oHigh高oPerformance性能oLiquid液體的oPerformance色譜

什么是HPLC？13高效液相基礎(chǔ)知識HPLC特點：高壓、高效、高速、高靈敏度1.高效分離：n=105/米2.高速：使用高壓泵，出峰時間幾分鐘到幾十分鐘3.高靈敏度：檢測下限：10-9-10-13g（最小檢測量）4.自動化程度高：儀器分析、電腦控制、色譜工作站5.應(yīng)用范圍廣：可測有機物75%-80%適用：高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離HPLC特點14高效液相基礎(chǔ)知識HPLC按流動相和固定相的相對極性分:正相色譜(NormalPhaseChromatography)

o固定相的極性大于流動相

反相色譜(ReversedPhaseChromatography)

o固定相的極性小于流動相有機化合物的極性

分子間作用力(靜電引力,偶分子間作用力(靜電引力,偶極力,色散力,氫鍵力)綜合表現(xiàn)的一種表述液相色譜法的分類

15高效液相基礎(chǔ)知識HPLC有機化合物極性示例

16高效液相基礎(chǔ)知識HPLC按分離過程的機理分:1吸附色譜(AbsorptionChromatography)

根據(jù)樣品組分對活性固定相表面吸附親和力的不同實現(xiàn)分離

2分配色譜(PartitionChromatography)

分離基于樣品組分在固定相和流動相中的溶解度(分配系數(shù))不同

3離子交換色譜(IonExchangeChromatography)

根據(jù)樣品組份離子交換親和力的差異分離,簡稱離子色譜(IC)

4體積排除色譜(SizeExclusionChromatography)

GPC(GelPermeationChromatography)

?固定相是疏水性凝膠,流動相是有機溶劑

GFC(GelFiltrationChromatography)

?固定相是親水性凝膠,流動相是水溶液

液相色譜法的分類17高效液相基礎(chǔ)知識HPLC由五大部分組成：：

溶劑輸送系統(tǒng)（貯液器，高壓泵）

進樣系統(tǒng)（進樣閥等）

分離系統(tǒng)（色譜柱等）檢測系統(tǒng)（檢測器等）記錄及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)HPLC的組成

18高效液相基礎(chǔ)知識HPLC19高效液相基礎(chǔ)知識HPLC1.高壓輸液泵為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性20高效液相基礎(chǔ)知識HPLC高壓輸液泵：恒壓泵（流量隨阻力變化重現(xiàn)性差）恒流泵（多用）：往復(fù)式注射式

作用：將流動相在高壓下連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)。性能：①有足夠的壓力②輸出流量恒定，可調(diào)③輸出壓力平穩(wěn)④泵室體積?、荼皿w抗腐蝕、耐酸21高效液相基礎(chǔ)知識HPLC梯度洗脫裝置作用：將兩種或兩種以上溶劑按一定程序連續(xù)改變配比，以改變流動相極性、離子強度、PH值、提高分離效率。低壓梯度洗脫（常壓混合，高壓進柱，1個泵。）高壓梯度洗脫（高壓混合，高壓進柱，2個泵。）22高效液相基礎(chǔ)知識HPLC安捷倫泵：小視頻色譜學(xué)堂：泵23高效液相基礎(chǔ)知識HPLC高效液相色譜儀流動相脫氣的目的1、使色譜泵輸液均勻準確，減小脈動。2、提高保留時間和色譜峰面積的重現(xiàn)性。3、防止氣泡引起尖峰。4、使基線穩(wěn)定，提高信噪比。5、降低溶劑的紫外吸收本底。6、減少死體積。7、防止填料氧化。視頻：脫氣目的

在線脫氣機在線脫氣機24高效液相基礎(chǔ)知識HPLC2.進樣裝置進樣視頻：安捷倫進樣視頻：島津25高效液相基礎(chǔ)知識HPLC3.分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成。其內(nèi)徑為2~6mm，柱長為10~50cm，柱形多為直形，內(nèi)部充滿3～10mm高效微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫

勻漿法填充柱：將填料制成懸浮液，在高壓泵的作用下壓入裝有洗脫液的色譜柱。理論塔板數(shù)可達8萬/米26高效液相基礎(chǔ)知識HPLC27高效液相基礎(chǔ)知識HPLC4.檢測器

要求:靈敏度高，噪音低，線形范圍寬，響應(yīng)快,對溫度和流速的變化不敏感

檢測器類型1.紫外可見吸收檢測器(UVD)2.熒光檢測器(FD)3.蒸發(fā)光檢測器（ELSD）3.示差折光檢測器(RID)4.電化學(xué)檢測器(ED)5.化學(xué)發(fā)光檢測器(CD)

28高效液相基礎(chǔ)知識HPLC1.

紫外—可見光度檢測器：

①固定波長：254nm，低壓汞燈。

②可調(diào)波長：190～800mm，鎢燈，氘燈。

③光電二極管矩陣檢測器：190～700nm。石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液29高效液相基礎(chǔ)知識HPLC

光電二極管矩陣檢測器特點：靈敏度高、分辨率好、方便、快速、準確，可掃描得三維流出曲線紫外檢測器的應(yīng)用：

對紫外有吸收的組分，且吸光度與濃度成正比。

紫外檢測器的特點：靈敏度高最小檢測濃度10-9g/ml

線性范圍寬對溫度和流速不敏感，可進行梯度洗脫應(yīng)用范圍廣30高效液相基礎(chǔ)知識HPLC折光計由測量池和參比池組成（示差折光計）因n～f（T），故需精密恒溫（±0.001℃）靈敏度低于UV檢測器，且不適合于梯度洗脫用于無紫外吸收的化合物，如糖類

31高效液相基礎(chǔ)知識HPLC2.熒光檢測器：多波長熒光檢測器（濾光片）熒光分光檢測器（光柵分光）氘燈作激發(fā)光源，波長范圍250～600nm

應(yīng)用：組分吸收一定波長紫外光后發(fā)射熒光的物質(zhì)，且熒光強度與濃度成正比。特點：靈敏度更高檢測限10-12～10-13g/ml（靈敏度比UV檢測器高2~3個數(shù)量級）選擇性好對溫度和流速不敏感，可進行梯度洗脫所需試樣量少，適于痕量分析應(yīng)用范圍廣

3、電化學(xué)檢測器電導(dǎo)、庫侖、極譜、安培、電位等檢測器。32高效液相基礎(chǔ)知識HPLC

伏安計、安培計、庫侖計和電導(dǎo)計等,首選安培計可用于在工作電極的工作電壓范圍能還原或氧化的物質(zhì)電極表面易中毒

33高效液相基礎(chǔ)知識HPLC溫度：10～30℃；

相對濕度：<80％；

最好是恒溫、恒濕

遠離高電磁干擾、高振動設(shè)備，有良好的通風(fēng)設(shè)施HPLC的日常維護與保養(yǎng)HPLC的日常操作條件：34高效液相基礎(chǔ)知識HPLC1Alliance液相色譜系統(tǒng)日常維護：開機程序2Alliance液相色譜系統(tǒng)日常維護：開機程序HPLC的日常操作35高效液相基礎(chǔ)知識HPLC選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化硅固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。36高效液相基礎(chǔ)知識HPLC手柄位在Load位置時，用微量進樣針將樣品從進樣孔注射進入定量環(huán)中(定量環(huán)充滿后，多余樣品從放空孔排出)手柄轉(zhuǎn)動至Inject位置時，閥與液相流路接通，由泵輸送的流動相沖洗定量環(huán)，將樣品進入色譜柱中進行分析

工作原理：1.六通閥進樣器的使用及保養(yǎng)37高效液相基礎(chǔ)知識HPLC手柄轉(zhuǎn)動要快速：手柄處于Load和Inject之間時，由于暫時堵住了流路，流路中壓力驟增，再轉(zhuǎn)到進樣位，過高的壓力在柱頭上引起損壞，應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動閥，不能在中途停留部分裝液法：進樣量最多為定量環(huán)體積的75％要求每次進樣體積準確、相同完全裝液法：進樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍將定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液完全置換樣品，達到所要求的精密度及重現(xiàn)性兩種裝液方法:38高效液相基礎(chǔ)知識HPLC樣品必須過濾：用0.45(0.22)μm的濾膜過濾防止微粒阻塞進樣閥減少對進樣閥的磨損進樣結(jié)束沖洗進樣器：用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動相沖洗，在進樣閥的Load和Inject位置反復(fù)沖洗再用無纖維紙擦凈注射器針頭的外側(cè)39高效液相基礎(chǔ)知識HPLC使用流動相盡量要清潔進液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗流動相交換時要防止沉淀避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進樣口，防止樣品的交叉污染2.泵的保養(yǎng)40高效液相基礎(chǔ)知識HPLC在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動色譜柱當(dāng)色譜柱和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈要注意流動相的脫氣避免使用高粘度的溶劑作為流動相進樣樣品要提純；嚴格控制進樣量2.色譜柱的保養(yǎng)每天分析工作結(jié)束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗舴治鲋L期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機溶劑保存并封閉41高效液相基礎(chǔ)知識HPLC在分析前應(yīng)先平衡色譜柱，差不多后，再開檢測器；在分析完成后馬上關(guān)閉檢測器3.紫外燈的保養(yǎng)42高效液相基礎(chǔ)知識HPLC“分析型液相色譜”

目的:得到數(shù)據(jù)-定性及定量分析

–靈敏度的要求

–樣品的復(fù)雜性

–樣品量的要求

–精度及準確度的要求

–容易使用

HPLC的應(yīng)用

43高效液相基礎(chǔ)知識HPLC“制備型液相色譜”

目的:得到純品-分離及純化

–化合物的穩(wěn)定性

–樣品的復(fù)雜性

–制備量的要求

–純度的要求，及純度的鑒定

–方法的安全性

44高效液相基礎(chǔ)知識HPLC色譜圖(Chromatogram):

色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖,其縱坐標(biāo)為信號強度,橫坐標(biāo)為時間

HPLC色譜圖名詞術(shù)語

45高效液相基礎(chǔ)知識HPLC

色譜峰(Peak):):色譜柱流出組分通過檢測器時產(chǎn)生的響應(yīng)信號

峰底(PeakBase):):峰的起點與終點之間連接的直線

峰高(PeakHeight):):峰最大值到峰底的距離

峰面積(PeakArea):):峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值

色譜圖名詞術(shù)語:46高效液相基礎(chǔ)知識HPLC基線(Baseline):在正常操作條件下,僅由流動相所產(chǎn)生

的響應(yīng)信號

基線飄移(BaselineDrift):基線隨時間定向的緩慢變化

基線噪聲(N)N)(BaselineNoise):由各種因素所引起的基線波動

譜帶擴展(BandBroadening):由于縱向擴散,傳質(zhì)阻力

等因素的影響,使組分在色譜柱內(nèi)移動過程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象

色譜圖名詞術(shù)語:

47高效液相基礎(chǔ)知識HPLC保留時間(tR)(Retentiontime):組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間

死時間(t0)(Deadtime):不被固定相滯留的組分,從進

樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間

保留體積(VR)(Retentionvolume):組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積

死體積(V0)(Deadvolume):不被固定相滯留的組分,從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積

色譜圖名詞術(shù)語:

48高效液相基礎(chǔ)知識HPLC等度

在整個運行過程中溶劑組成保持不變

如(60:40甲醇/水)

HPLC實驗的基本類型-等度

49高效液相基礎(chǔ)知識HPLC梯度

在運行過程中溶劑組成變化

漸變或臺階式變化

如100%H20/0%MeOH到0%H2O/100%MeOH

HPLC實驗的基本類型-梯度

50高效液相基礎(chǔ)知識HPLC這些是導(dǎo)出理論和定義所必需的基本測量

洗脫體積和峰寬

51高效液相基礎(chǔ)知識HPLC簡單說來,分離度即是兩峰相對于其峰寬分開得有多遠

分離度(R)的定義式

52高效液相基礎(chǔ)知識HPLC計算分離度的實例:

分離程度的量度

53高效液相基礎(chǔ)知識HPLCk′是樣品與填料作用強度的直接量度

保留因子(k′):保留能力的量度

54高效液相基礎(chǔ)知識HPLCα是兩個化合物在同一套色譜系統(tǒng)上保留差異的數(shù)值表述

分離因子(α):峰分離程度的量度

55高效液相基礎(chǔ)知識HPLC理論塔板數(shù)或柱效是一個數(shù)值,它表示作為保留時間函數(shù)的峰展寬的量度用于評價色譜柱的性能(中國2015版藥典)

理論塔板數(shù)(N):分離效率的量度

56高效液相基礎(chǔ)知識HPLC色譜峰對稱性的測量方法

57高效液相基礎(chǔ)知識HPLC中國藥典要求對儀器進行適用性試驗,即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適應(yīng)性溶液對色譜系統(tǒng)進行試驗和調(diào)整,要達到規(guī)定的要求

色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性實驗通常包括理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子四個指標(biāo)

要求:

?理論塔板數(shù)N:大于規(guī)定值(按半峰寬法計算)

?分離度R:應(yīng)大于1.5

?重復(fù)性:連續(xù)進樣5次,峰面積的相對標(biāo)準偏差不大于2.0%

?拖尾因子T:應(yīng)在0.95-1.05之間

中國藥典對系統(tǒng)適用性的規(guī)定

58高效液相基礎(chǔ)知識HPLC在定性的基礎(chǔ)上定量,需有純物質(zhì)作為標(biāo)準物

液相色譜定量是相對定量的方法:

即由已知量的純標(biāo)樣推算混合物中被測物的量

液相色譜法定量的依據(jù)是:

被測組分的量與響應(yīng)值(峰高或峰面積)成正比

液相色譜定量分析原理

59高效液相基礎(chǔ)知識HPLC用“標(biāo)樣”的保留時間(Rt)確認被測組份

鑒別需定量的色譜峰(定性)

60高效液相基礎(chǔ)知識HPLC定性鑒別每個要定量的色譜峰

–首先用標(biāo)樣確定欲定量之色譜峰的保留時間(Rt)

–通過比較保留時間,找到未知樣中各色譜峰所對應(yīng)的組份色譜定性是用與標(biāo)樣比較保留時間的方法

因此要明確：

–保留時間相同，可能是同樣的組份

–保留時間不同，肯定不是同樣的組份

鑒別需定量的色譜峰(定性)

61高效液相基礎(chǔ)知識HPLC標(biāo)準加入法同時用其它方法

1其它色譜方法(改變機理,如:用不同的色譜柱)

2其它檢測器

oPDA,光譜圖比較、譜庫檢索

oMS，質(zhì)譜圖解析、譜庫檢索

3其它儀器方法

進一步的確認(定性)

62高效液相基礎(chǔ)知識HPLC確認定量峰的一致性

63高效液相基礎(chǔ)知識HPLCPDA純度角原理

64高效液相基礎(chǔ)知識HPLCPDA純度角測定結(jié)果

65高效液相基礎(chǔ)知識HPLC標(biāo)準曲線法,分為外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法:

-外標(biāo)法:液相色譜中用得最多

-內(nèi)標(biāo)法

–準確，但是麻煩

–在標(biāo)準方法中用得最多

常用的定量方法

66高效液相基礎(chǔ)知識HPLC液相色譜定量分析的步驟

67高效液相基礎(chǔ)知識HPLC外標(biāo)法定量(1)

68高效液相基礎(chǔ)知識HPLC外標(biāo)法定量(2)

69高效液相基礎(chǔ)知識HPLC外標(biāo)法按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，進樣，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測物質(zhì)的峰面積(或峰高），按下式計算含量：

外標(biāo)法

中國藥典201571高效液相基礎(chǔ)知識HPLC內(nèi)標(biāo)法定量(1)

72高效液相基礎(chǔ)知識HPLC內(nèi)標(biāo)法定量(2)

73高效液相基礎(chǔ)知識HPLC內(nèi)標(biāo)法定量(3)

74高效液相基礎(chǔ)知識HPLC內(nèi)標(biāo)法定量(4)

75高效液相基礎(chǔ)知識HPLC測定雜質(zhì)含量時，

可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量)取待測物對照品和參比物質(zhì)對照品各適量，配制待測物校正因子的溶