細(xì)胞培訓(xùn)課件

2014.7.10研究生實驗技能培訓(xùn)

－細(xì)胞培養(yǎng)基本知識1基本概念2體外細(xì)胞培養(yǎng)類型細(xì)胞獲取渠道3細(xì)胞培養(yǎng)的條件細(xì)胞培養(yǎng)方法細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)cellculture選用各種細(xì)胞的最佳生存條件對活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)，是廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要技術(shù)細(xì)胞系cellline培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞有限細(xì)胞系（FiniteCellLine）連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系（InfiniteCellLine）細(xì)胞株用單細(xì)胞分離培養(yǎng)增殖形成的具特定生長特性的細(xì)胞群再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株原代培養(yǎng)直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞進(jìn)行的第一次培養(yǎng)物組織細(xì)胞剛脫離機(jī)體，生物性狀尚未發(fā)生較大變化，在一定程度上能夠反映體內(nèi)的狀態(tài)將細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞在生長、繁殖一定時間后，由于空間不足或細(xì)胞密度過大導(dǎo)致營養(yǎng)枯竭，會影響細(xì)胞的生長，因此需要進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，即傳代或稱為傳代培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)的條件無菌條件生長條件檢測條件凍存條件無菌室、超凈臺、常用培養(yǎng)器皿簡介、常用培養(yǎng)器皿清洗消毒細(xì)胞的營養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)顯微鏡凍存管無菌條件1.無菌室無菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。每天晚上紫外照射過夜，第二天早晨關(guān)閉紫外燈，打開排風(fēng)機(jī)排除臭氧，半小時后關(guān)閉排風(fēng)機(jī)，打開送風(fēng)機(jī)，方可使用。每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒使用前開啟柜內(nèi)紫外燈照射10－30分，預(yù)工作10－15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)。使用完畢后，要用75%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈。還要定期用福爾馬林熏蒸。2.生物安全柜（超凈工作臺）3.常用細(xì)胞培養(yǎng)器皿細(xì)胞培養(yǎng)板

6孔，12孔，24孔，48孔96孔

細(xì)胞培養(yǎng)皿35mm60mm

100mm150mm

離心管

15ml

50ml細(xì)胞刮

濾器大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。玻璃器皿的清洗一般經(jīng)過浸泡、刷洗、泡酸、清洗四個步驟新的橡膠制品洗滌方法

0.5MNaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5MHCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用消毒前包裝

常用的包裝材料：牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、鋁箔在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)。4.常用培養(yǎng)器皿清洗消毒細(xì)胞的營養(yǎng)碳水化合物、氨基酸和脂類三大類也需要一定量的無機(jī)鹽、維生素和微量元素細(xì)胞培養(yǎng)液水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液主要由無機(jī)鹽和葡萄糖配制而成，作用為維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度常用的緩沖液：生理鹽水，PBS，Hanks液（常用于配制胰酶溶液）pH調(diào)節(jié)液碳酸氫鈉液Hepes緩沖液：是一種可以保持細(xì)胞培養(yǎng)過程中pH值較長時間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑，通常使用濃度為10～15mM消化液抗生素溶液培養(yǎng)基血清細(xì)胞生長條件(1)蛋白酶溶液

主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落

并使細(xì)胞游離分散開來，常用濃度為0.25%或5%胰蛋白酶。(2)EDTA溶液

作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。

對于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，可用EDTA和胰酶的混合液

EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時應(yīng)加堿助溶(3)膠原酶溶液

膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時經(jīng)常使用，膠原酶作用的

對象是膠原組織，因此不容易對細(xì)胞產(chǎn)生損傷。消化液抗生素溶液通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。天然培養(yǎng)基：血清血漿組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）合成培養(yǎng)基：根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。包括四大類物質(zhì)：無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物目前常用培養(yǎng)基：RPMI-1640、DMEM、TC199、MEM、另有無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)基最初是由G，E，Moore為培養(yǎng)小鼠白血病細(xì)胞而設(shè)計的。開始的配方特別適合于懸浮細(xì)胞生長，主要是針對淋巴細(xì)胞，后經(jīng)過改良，從RPMI1630、RPMI1634、直至RPMI1640。其組分較為簡單，適合許多種細(xì)胞生長，如腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。尤其適合人白細(xì)胞，如H9、T-15、HL-60、IM-9、Jurkat、K-562及KATO—III等細(xì)胞系的培養(yǎng)。RPMI1640種類RPMI—1640（A）（不含谷氨酰胺、可高壓滅菌）RPMI—1640（A）無酚紅（不含谷氨酰胺、可高壓滅菌）RPMI—1640（含谷氨酰胺、除菌過濾滅菌）

RPMI1640是在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的與MEM比較增加了各種成分用量，同時又分為高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個位置生長，適于生長較快、附著較困難腫瘤細(xì)胞等。

DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高壓滅菌】

DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌過濾滅菌】

DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌過濾滅菌】。

DMEM認(rèn)真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實驗需要決定。配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于4度。干粉培養(yǎng)基的配制血清的使用血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵常用血清胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，胎牛血清是品質(zhì)最高的。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）

56℃，30分鐘。血清的消毒過濾除菌。FBS(fetalbovineserum)胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛CS(calfserum)小牛血清取自出生10－30天的小牛使用濃度：一般為5－20％，最常用是10％HS(horseserum)指馬血清纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成谷氨酰胺具有特殊的作用，補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。氨基酸無機(jī)鹽CaCl2

、KCl、MgSO4、

NaCl、NaHCO3

、NaH2PO4對調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的

細(xì)胞培養(yǎng)方法細(xì)胞傳代方法1細(xì)胞計數(shù)方法2細(xì)胞活力檢測方法354細(xì)胞凍存與復(fù)蘇方法細(xì)胞污染檢測每代貼壁細(xì)胞的生長過程游離期懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形。吸附期貼附底物，一般24小時內(nèi)貼壁。潛伏期此時細(xì)胞有生長活動，基本無增殖。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時。對數(shù)生長期細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實驗研究。停止期（平臺期）細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性1.細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種：1．懸浮生長細(xì)胞傳代

離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。2．半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）

此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。3．貼壁生長細(xì)胞傳代

采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.02％EDTA的胰蛋白酶液。首次傳代注意事項細(xì)胞生長密度不高時，不能急于傳代原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時間吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷首次傳代時細(xì)胞接種數(shù)量要多一些首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些小牛血清濃度可加大至15%～20%左右

傳代注意事項接種數(shù)量為5×104～8×105個/ml

傳代密度太低，細(xì)胞容易死亡，表現(xiàn)出細(xì)胞在達(dá)到增長前有較長的滯留期。培養(yǎng)液由于pH下降而呈現(xiàn)黃色，表明細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到最大密度需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)。如果是單層貼壁的細(xì)胞，等長滿培養(yǎng)瓶表面，即可進(jìn)行傳代。計數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞計數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計數(shù)相同血細(xì)胞計數(shù)器：手工計數(shù)細(xì)胞Coulter計數(shù)儀：人工計數(shù)2.細(xì)胞計數(shù)方法細(xì)胞計數(shù)步驟1、將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。3、靜置3分鐘。4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×104

注意：壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。鏡下偶見由兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。細(xì)胞活力：總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。3.培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

細(xì)胞活力測定方法臺盼藍(lán)法活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。流式細(xì)胞儀細(xì)胞活性指標(biāo)通常包括細(xì)胞膜對核酸染料的通透性，代謝活性，膜電位等。四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)；MTT比色法的原理：活細(xì)胞中琥珀脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臢（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。甲臢染料在A570nm處產(chǎn)生吸收值，用酶標(biāo)儀測定OD值。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵：在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。4.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融慢凍程序

4℃10分鐘－20℃30分鐘－80℃16-18小時(或隔夜)—液氮罐長期儲存。

細(xì)胞復(fù)蘇方法（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～

38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）；（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上；（3）低速離心10分鐘；（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。細(xì)胞欲冷凍保存時，細(xì)胞濃度應(yīng)該多少？冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106cells/ml融合瘤細(xì)胞則以5x106cells/ml為宜。細(xì)胞污染的種類細(xì)菌、真菌、支原體和病毒污染源無菌操作技術(shù)不當(dāng)操作室環(huán)境不佳污染之血清污染之細(xì)胞5.細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測

洋蔥佰克霍爾德菌污染洋蔥佰克霍爾德菌（Burkholderiacepacia）原屬假單胞菌屬，是植物病原菌。白色葡萄球菌污染

細(xì)菌：最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會渾濁變黃，對細(xì)胞生長影響明顯。白色念珠菌感染其他真菌感染

真菌：最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，慢慢的會長出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。支原體污染電鏡照片

（左圖：煎蛋狀；中間：單個快速運(yùn)動小蟲；右圖：長梭形）支原體：黑色的，多形，培養(yǎng)液一般會渾濁。國內(nèi)血清很多都沒有做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中最常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是慢慢死去。用泰樂菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細(xì)胞培養(yǎng)，無任何不良反應(yīng)。Sigma公司的使用時用50ug/mlTylosin培養(yǎng)液培養(yǎng)6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話,建議用8ug/ml的濃度。黑蛟蟲：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運(yùn)動物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對細(xì)胞生長狀態(tài)不會有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。建議如果細(xì)胞有可能是此種污染的話，可以增加細(xì)胞的種板密度，以提高細(xì)胞的生存率。原蟲：培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點狀物數(shù)量非常多，輕微活動，細(xì)胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會與細(xì)胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞站優(yōu)勢所以不會影響到細(xì)胞的正常生長，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時就會影響到細(xì)胞的生長，最終形成惡性循環(huán)。

肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法細(xì)菌和真菌的

污染和檢測支原體的

污染和檢測

Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNA熒光染色法PCR方法相差顯微鏡觀察法測出細(xì)胞株有支原體污染時，應(yīng)直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。細(xì)胞的直接觀察動物接種檢查電子顯微鏡觀察免疫學(xué)檢查PCR技術(shù)病毒的污染和檢測體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型

大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，大致分成以下四型：成纖維細(xì)胞上皮型細(xì)胞游走細(xì)胞型多型細(xì)胞型貼附型名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2—3個長短不等的突起，中有卵圓形核生長特點：排列成放射狀，漩渦狀

細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開而單獨行動，游離的單獨的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個伸長的細(xì)胞突起1、成纖維細(xì)胞型(LLCPK1)成纖維細(xì)胞HUVECs人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

1.細(xì)胞種類：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：4d；原代培養(yǎng)；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X20；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+15％胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：細(xì)胞呈梭形，扁平形或多角形，貼壁生長。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

1.細(xì)胞種類：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代；

2.培養(yǎng)天數(shù)：7天；

3.放大倍數(shù)：200倍，倒置顯微鏡；

4.培養(yǎng)基種類：DF12+10％FBS；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：使用percoll密度梯度離心法分離人骨髓細(xì)胞。首次換液48h，這是7天后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增情況。名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全相同來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞,如：

皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核生長特點：易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀

生長時呈膜狀移動，很少脫離細(xì)胞群而單個活動2.上皮型細(xì)胞(MDCK)上皮型細(xì)胞SKOv3（卵巢癌細(xì)胞）

1.細(xì)胞種類：SKOv3（卵巢癌細(xì)胞）2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后3d；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X10；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+5%胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：細(xì)胞貼壁生長，生長速度較快。

CCL-149

1.細(xì)胞種類：大鼠肺泡上皮細(xì)胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：1d（種在48孔板中）；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X20；

4.培養(yǎng)基種類：F12K+10%胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：細(xì)胞呈梭形，透亮貼壁生長，3－4天傳代一次，Giemsa染色。

呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。CNE1

1.細(xì)胞種類：高分化鼻咽癌細(xì)胞系；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：3d；

3.放大倍速：相差100；

4.培養(yǎng)基種類：PMI1640+10%CS；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：貼壁細(xì)胞，梭型成團(tuán)生長。3.游走細(xì)胞型：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。4.多型細(xì)胞型(PC12)

SD大鼠神經(jīng)元原代

1.細(xì)胞種類：腦皮質(zhì)細(xì)胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：4-5天；

3.放大倍速：電鏡20000；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清+10%馬血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：貼壁細(xì)胞，有多量軸突和樹突。

概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長來源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞特點：在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，

易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(尤以正常細(xì)胞)懸浮型HL-60分化細(xì)胞Giemsa染色1.細(xì)胞種類：HL-60；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：ATRA1微摩爾作用5天；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X10；

4.培養(yǎng)基種類：1640+8％胎牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：懸浮細(xì)胞，分化的細(xì)胞核漿比例減小，核仁減少或消失，胞核呈桿狀或分葉狀。KU812

1.細(xì)胞種類：人嗜堿細(xì)胞性白血病細(xì)胞系；2.培養(yǎng)的天數(shù)：5d；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X20；

4.培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%新生牛血清；

5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡述：細(xì)胞呈圓形，懸浮生長。

HeLa細(xì)胞

1.細(xì)胞種