大鼠感覺神經(jīng)元-背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元原代培養(yǎng)純化,神經(jīng)生物學論文

大鼠感覺神經(jīng)元-背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元原代培養(yǎng)純化,神經(jīng)生物學論文周圍神經(jīng)損傷與變性疾病在臨床上是較為常見的疾病，經(jīng)常會累及感覺神經(jīng)元-背根神經(jīng)節(jié)〔dorsalrootganglion,DRG〕神經(jīng)元，為探究其損傷與修復機制，體外培養(yǎng)DRG神經(jīng)元是重要的實驗技術。當前，在DRG神經(jīng)元的原代培養(yǎng)經(jīng)過上，常使用阿糖胞苷〔cytarabine,Ara-C〕抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的生長以純化DRG神經(jīng)元[1-4],這種方式方法仍然存在一些問題：由于需要多輪純化，獲得純度較高的DRG神經(jīng)元需要的周期較長，同時Ara-C對神經(jīng)元的細胞活力也有一定的影響；除此之外，Ara-C試劑生產(chǎn)廠家不同、批號不一，會造成純化次數(shù)不定、純度不能保證、不同批次培養(yǎng)的細胞差異性較大等問題。因而，本研究對大鼠DRG神經(jīng)元原代培養(yǎng)中的純化方式方法進行了改進，以克制傳統(tǒng)方式方法的缺乏。1材料與方式方法1.1動物出生1d〔P1〕的SD大鼠，由南通大學實驗動物中心提供。動物實驗已通過倫理委員會審查同意。1.2試劑DMEM培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、胎牛血清〔febtalbovineserum,FBS〕、羊血清、0.25%胰酶和0.01mol/L磷酸鹽緩沖液〔phosphatebufferedsaline,PBS購自Gibco公司；B27和多聚賴氨酸〔poly-L-lysine,PLL〕購自Invitrogen公司；牛血清白蛋白〔bovineserumalbumin,BSA〕、L-谷氨酰胺、Ara-C和Ⅰ型膠原蛋白酶購自Sigma公司；CCK8購自Dojindo公司；其他試劑為均分析純。1.3細胞培養(yǎng)方式方法1.3.1大鼠DRG的取材準備5只P1大鼠逐個取材，用75%乙醇全身消毒大鼠后，無菌超凈臺內(nèi)處死，剪開背部皮膚，打開脊髓腔，用顯微鑷小心取出雙側(cè)的DRG,置于冰上的DMEM培養(yǎng)基中。1.3.2未改進的培養(yǎng)與純化方式方法所有培養(yǎng)板均預先用PLL包被待用。〔1〕酶解消化：DRG加2mLⅠ型膠原酶〔3mg/mL〕37℃消化30min,小心吸去膠原酶，然后再參加2mL0.25%胰酶37℃消化20min,用含DMEM完全培養(yǎng)基〔DMEM培養(yǎng)基添加10%FBS〕終止消化，1000r/min離心5min后棄上清?！?〕接種細胞：細胞沉淀重懸于DMEM完全培養(yǎng)基，過400目篩網(wǎng)。細胞計數(shù)，以〔2~4〕104/孔密度接種到24孔培養(yǎng)板，置于5%CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后更換為神經(jīng)元培養(yǎng)液〔Neurobasal培養(yǎng)基添加2%B27、2mmol/LL-谷氨酰胺〕培養(yǎng)2d.〔3〕純化細胞：為去除神經(jīng)膠質(zhì)細胞，更換為神經(jīng)元純化培養(yǎng)液〔神經(jīng)元培養(yǎng)液添加10mol/LAra-C〕培養(yǎng)2d,再用神經(jīng)元培養(yǎng)液恢復2d,按此方式至少純化2輪后用于實驗。按此方案1個周期至少需要10d[1-4].1.3.3培養(yǎng)與純化步驟的改進改進方式方法主要是在接種細胞這一步驟的前后分別增加不同的純化步驟，并減少Ara-C純化神經(jīng)元的次數(shù)。〔1〕DRG的酶解消化步驟同1.3.2.〔2〕接種細胞前應用密度梯度離心法分離細胞：將5只P1大鼠的DRG消化后獲得的細胞沉淀重懸于5mL15%的BSA溶液〔含15%BSA的0.01mol/LPBS溶液〕中[5],1000r/min離心5min后棄上清。〔3〕接種細胞：用DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞，過400目篩網(wǎng)。細胞計數(shù)后以〔1~1.5〕105/孔密度接種到6孔培養(yǎng)板。〔4〕接種細胞后應用差速黏附特性分離細胞：細胞接種6~8h后，觀察到所有細胞已完全貼壁，用移液器輕輕均勻吹打細胞，當顯微鏡下觀察到大部分神經(jīng)元細胞已被吹起而重新懸浮后，立即將含懸浮細胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min,棄上清后重懸。〔5〕Ara-C純化神經(jīng)元1次：細胞重新計數(shù)后以〔2~3〕104/孔密度用含10%FBS的神經(jīng)元培養(yǎng)液接種到24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)12~16h,用神經(jīng)元純化培養(yǎng)液純化2d后更換為神經(jīng)元培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后觀察并用于實驗。本改進方案1個周期僅需要5d.1.4細胞形態(tài)學觀察采用相差顯微鏡觀察神經(jīng)元細胞及其他非神經(jīng)元細胞的形態(tài)。通過-tubulinⅢ的免疫細胞化學〔immunocytochemistry,ICC〕染色，采用熒光顯微鏡觀察DRG神經(jīng)元形態(tài)。1.5細胞純度鑒定DRG神經(jīng)元的-tubulinⅢICC染色：4%多聚甲醛常規(guī)室溫固定細胞15min,洗滌后室溫封閉1h,加一抗〔mouseanti-tubulinⅢantibody,1︰1000,Sigma公司〕4℃孵育過夜，洗滌后加二抗〔TRITCgoatanti-mouse,1︰200,SantaCruz公司〕室溫避光孵育2h,洗滌后加Hoechst33342〔5g/mL〕37℃復染細胞核8min.洗滌后滴加熒光封片液封片。熒光顯微鏡下隨機拍攝細胞圖片，隨機計數(shù)10個視野中的細胞總數(shù)和-tubulinⅢ的ICC染色陽性細胞數(shù)，計數(shù)百分比。1.6細胞活力檢測在PLL包被的96孔板中接種DRG神經(jīng)元，密度為1105/mL,每孔100L,未改進組和改進組每組10個復孔。培養(yǎng)24h后，每孔參加10L的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h后，用酶標儀測定450nm處的吸光度值。1.7統(tǒng)計學方式方法本實驗中定量數(shù)據(jù)以x軃s表示，應用GraphPadPrism5軟件分析數(shù)據(jù)，單因素兩組間采用T-Test配對資料分析，P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1改進步驟的效果根據(jù)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的體積與密度的差異，使用15%BSA溶液密度梯度離心法，明顯去除了很多細胞碎片和體積較小的神經(jīng)膠質(zhì)細胞；接種培養(yǎng)6~8h后，由于神經(jīng)元細胞貼壁能力弱，輕輕地吹打即可重新懸浮起來，利用差速黏附特性進一步去除了更多貼壁能力較強的神經(jīng)膠質(zhì)細胞；最后，應用Ara-C抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞在神經(jīng)元培養(yǎng)液中的生長，使神經(jīng)元得到進一步的純化。通常每5只P1大鼠取材，可獲得〔1~1.5〕105個高純度DRG神經(jīng)元用于實驗。2.2DRG神經(jīng)元形態(tài)學的比擬相差顯微鏡觀察。可見，未改進組神經(jīng)元〔圖1A,1C〕胞體有一定透亮度和折光性，突起分支特別茂密，可見不少神經(jīng)膠質(zhì)細胞及細胞碎片；改進組神經(jīng)元〔圖1B,1D〕胞體愈加透亮、呈圓形或橢圓形、折光性好，突起分支互相交織成網(wǎng)，神經(jīng)膠質(zhì)細胞明顯減少。熒光顯微鏡觀察可見神經(jīng)元胞體和突起均表示出-tubulinⅢ，未改進組神經(jīng)元〔圖2A,2C,見封二〕突起分支茂密，可見不少非神經(jīng)元細胞核；改進組神經(jīng)元〔圖2B,2D,見封二〕突起分支清楚明晰，非神經(jīng)元細胞核明顯減少。2.3DRG神經(jīng)元純度的比擬與未改進組比擬，改進組的-tubulinⅢ陽性細胞比例到達93%,未改進組純度僅到達68%,差異有統(tǒng)計學意義〔P0.05〕〔圖3A〕。2.4DRG神經(jīng)元細胞活力的比擬CCK-8檢測結果顯示改進組細胞活力高于未改進組，差異有統(tǒng)計學意義〔P0.05〕。3討論本實驗根據(jù)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的體積與密度的差異，使用15%BSA溶液密度梯度離心法，明顯去除了很多細胞碎片和體積較小的神經(jīng)膠質(zhì)細胞；利用差速黏附特性進一步去除貼壁能力較強的神經(jīng)膠質(zhì)細胞；再應用Ara-C抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞在神經(jīng)元培養(yǎng)條件下的生長到達進一步純化的目的。以上3種細胞純化方式方法的聯(lián)合應用，顯著縮短了DRG神經(jīng)元的培養(yǎng)周期，并明顯提高神經(jīng)元純度，且保證細胞的良好活力，為進一步開展實驗研究奠定了技術基礎。在體外實驗研究中，經(jīng)常需要大量高純度的DRG神經(jīng)元細胞，以排除神經(jīng)膠質(zhì)細胞給實驗數(shù)據(jù)帶來的影響，尤其是DRG中含量較多的施萬細胞。已有文獻[6-10]報道施萬細胞可分泌多種功能性營養(yǎng)有因子，包括神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、胰島素樣生長因子1和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3/4/5等；還能夠釋放促血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和血管