高中生物第3章基因工程第2節(jié)基因工程的基本操作程序課件選擇性必修3

第3章基因工程第2節(jié)基因工程的基本操作程序課標要求核心素養(yǎng)1．掌握目的基因的篩選與獲取方法。(科學思維、生命觀念)2．學會基因表達載體構建的方法和要求。(科學探究)3．理解目的基因導入受體細胞的具體過程。(科學探究)4．掌握目的基因檢測與鑒定的方法。(科學探究、社會責任)5．掌握DNA片段的擴增及電泳鑒定的方法。(科學探究)1．概述基因工程的基本操作程序。2．說明利用PCR技術擴增目的基因的基本過程。3．理解基因表達載體的結構和各部分的作用及基因表達載體的構建。4．舉例說明獲取目的基因的途徑，目的基因導入受體細胞的方法、檢測與鑒定目的基因的方法。知識導圖學霸記憶?素養(yǎng)積累訓練鞏固?課堂達標新知預習?雙基夯實課內探究?名師點睛指點迷津?撥云見日新知預習?雙基夯實一、目的基因的篩選與獲取1．目的基因(1)概念：用于改變______________或獲得______________等的基因。(2)實例：培養(yǎng)轉基因抗蟲棉用到的目的基因是________________。受體細胞性狀

預期表達產物

Bt抗蟲蛋白基因

2．篩選合適的目的基因(1)較為有效的方法：從相關的__________和__________的基因中進行篩選。(2)實例：在培育轉基因抗蟲棉之前，科學家不僅掌握了Bt基因的__________，也對Bt基因的表達產物____________有了較為深入的了解。(3)認識基因結構和功能的技術方法：_________技術、__________數(shù)據庫、__________工具。已知結構

功能清晰

序列信息

Bt抗蟲蛋白

DNA測序

遺傳序列

序列比對

3．利用PCR獲取和擴增目的基因(1)PCR的含義：PCR是________________的縮寫，它是一項根據_______________的原理，在體外提供_____________的各種組分與反應條件，對______________________進行大量復制的技術。(2)條件：DNA模板、分別與兩條模板鏈結合的2種______、四種____________、___________________。聚合酶鏈式反應

DNA半保留復制

參與DNA復制

目的基因的核苷酸序列

引物

脫氧核苷酸

耐高溫的DNA聚合酶

(3)過程：①變性：溫度上升到90℃以上，目的基因DNA____________________。②復性：溫度下降到50℃左右時，__________通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。③延伸：溫度上升到72℃左右時，溶液中________________在耐高溫的___________的作用下加到引物的______端合成子鏈。④重復循環(huán)多次。(4)結果：每次循環(huán)后目的基因的量增加一倍，即成______形式擴增(約為2n)。受熱變性后解為單鏈

兩種引物

四種脫氧核苷酸

DNA聚合酶

3′

指數(shù)

二、基因表達載體的構建1．構建基因表達載體的目的(1)使目的基因在受體細胞中__________，并且可以______給下一代。(2)使目的基因能夠______和發(fā)揮作用。穩(wěn)定存在

遺傳

表達

2．基因表達載體的組成[填圖]3．基因表達載體的構建首先用一定的________切割載體，使它出現(xiàn)一個切口，然后用______限制酶或________________的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用___________將目的基因片段拼接到載體的切口處。限制酶

同種

能產生相同末端

DNA連接酶

三、將目的基因導入受體細胞1．轉化：目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內__________和______的過程。2．目的基因導入受體細胞的方法(1)目的基因導入植物細胞①花粉管通道法Ⅰ.用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入______中。Ⅱ.在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借____________進入______。維持穩(wěn)定

表達

子房

花粉管通道

胚囊

②農桿菌轉化法Ⅰ.農桿菌的特點：農桿菌自然條件下侵染________植物和______植物；農桿菌的Ti質粒上的________能夠整合到所侵染細胞的___________上。Ⅱ.轉化方法：將目的基因插入農桿菌________________中，讓農桿菌侵染植物細胞。雙子葉

裸子

T－DNA

染色體DNA

Ti質粒的T－DNA

(2)目的基因導入動物細胞①常用方法：__________法。②常用受體細胞：________。(3)目的基因導入微生物細胞①方法：用________處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后將重組表達載體導入其中。②常用受體細胞：原核細胞(使用最廣泛的是大腸桿菌)。顯微注射

受精卵

Ca2＋

四、目的基因的檢測與鑒定1．分子水平檢測(1)通過_____等技術檢測受體細胞染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測目的基因是否轉錄出mRNA。(2)從轉基因生物中提取蛋白質用相應的抗體進行____________雜交，檢測目的基因是否翻譯成了蛋白質。2．個體水平鑒定包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性及抗性程度?；蚬こ坍a品需要與天然產品活性進行比較等。PCR

抗原—抗體

1．從已知結構和功能清晰的基因中篩選目的基因是獲取目的基因的一種有效方法。

(

)2．Taq酶是用PCR儀對DNA分子擴增過程中常用的一種耐高溫的DNA連接酶。

(

)3．基因表達載體中啟動子是DNA聚合酶識別和結合的部位。

(

)4．將重組表達載體導入動物受精卵常用顯微注射法。

(

)活學巧練√

×

×

√

5．轉基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定必須通過分子檢測才能達到目的。

(

)6．可通過PCR等技術檢測棉花的染色體上是否插入了Bt基因。

(

)×

√

思考：1．PCR擴增目的基因時，復性溫度的設定是成敗的關鍵。復性溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對，復性溫度過低又會造成引物不能與DNA模板鏈的特定部位結合。復性溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，假設引物的長度相同，在GC含量高時，對復性溫度的設定有什么要求？說明理由。提示：在引物的GC含量高時，設定的復性溫度要高一些。因為DNA分子中G—C之間有三個氫鍵，A—T之間有兩個氫鍵。2．在利用PCR獲取和擴增目的基因時，從第幾輪循環(huán)才會產生完整的目的基因？提示：第3輪3．農桿菌轉化法是將目的基因導入雙子葉植物和裸子植物的一種方法，原因是雙子葉植物和裸子植物能夠產生一種吸引農桿菌的化學物質，而單子葉植物不能產生這種物質，能不能利用農桿菌轉化法將目的基因導入單子葉植物？說明原因。提示：能，可從雙子葉植物中提取該化合物，再用該化合物處理單子葉植物細胞，然后就可用農桿菌轉化法將目的基因導入單子葉植物細胞。4．將目的基因導入動物細胞的受體細胞除了受精卵外，還可以選擇什么細胞？提示：還可以將目的基因導入胚胎干細胞，因為胚胎干細胞也能發(fā)育成動物體。學霸記憶?素養(yǎng)積累1．基因工程的基本操作程序有：(1)目的基因的篩選與獲取；(2)基因表達載體的構建；(3)將目的基因導入受體細胞；(4)目的基因的檢測與鑒定。2．PCR反應液中需要提供DNA模板、分別與兩條模板鏈結合的2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。3．PCR反應中每次循環(huán)一般可分為變性、復性、延伸三步。4．基因表達載體的構建是基因工程的核心，基因表達載體是載體的一種，除了目的基因外，它還必須有啟動子、終止子以及標記基因等。5．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法和花粉管通道法。6．將目的基因導入動物細胞常用顯微注射技術，導入微生物細胞常用感受態(tài)細胞法(Ca2＋處理法)。7．分子水平的檢測：檢測目的基因是否插入受體細胞的DNA中；檢測目的基因是否轉錄出了mRNA；檢測目的基因是否翻譯出相應蛋白質。8．目的基因的檢測與鑒定也可以在個體生物學水平進行鑒定。課內探究?名師點睛知識點1．目的基因用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因，主要是指編碼蛋白質的基因。2．獲取方法(1)從基因文庫中獲取。(2)利用PCR技術擴增。(3)通過化學方法人工合成。目的基因的獲取3．PCR反應(1)條件①模板：DNA母鏈(目的基因所在的DNA片段)。②酶：耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。③兩種引物：分別與兩條模板鏈相結合。④原料：四種脫氧核苷酸。(2)過程過程說明圖解變性溫度上升到90℃左右，雙鏈DNA解聚為單鏈復性溫度下降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合過程說明圖解延伸溫度上升到72℃左右，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下從引物起始合成互補鏈，可使新鏈由5′端向3′端延伸(3)結果上述三步反應完成后，一個DNA分子就變成了兩個DNA分子，隨著重復次數(shù)的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反應過程都是在PCR擴增儀中完成的。知識貼士關于引物①概念：引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物長度一般為20～30個核苷酸。②作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，見下圖：

PCR是一種體外擴增DNA的技術，模擬了體內的DNA復制過程。下圖為PCR技術原理示意圖，對于圖中物質和過程的說明，錯誤的是

(

)A．物質a：游離的脫氧核苷酸B．過程①：氫鍵斷裂C．過程②：邊解旋邊復制D．過程③：遵循堿基互補配對原則典例1典例剖析C

解析：PCR模擬了體內的DNA復制，所以a是DNA復制的原料——脫氧核苷酸，A項正確；在94℃高溫條件下，DNA分子雙螺旋解開，形成單鏈，此時氫鍵斷裂，B項正確；體外模擬DNA的復制依據了DNA的熱變性原理，該過程DNA分子不是邊解旋邊復制，C項錯誤；DNA復制需要遵循堿基互補配對原則，D項正確。1．PCR一般要經過三十次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產物也作為模板參與反應，由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時將

(

)A．仍與引物Ⅰ結合進行DNA子鏈的延伸B．與引物Ⅱ結合進行DNA子鏈的延伸C．同時與引物Ⅰ和引物Ⅱ結合進行子鏈的延伸D．無須與引物結合，在酶的作用下從頭合成子鏈變式訓練B

解析：當由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時，此單鏈引物固定端為5′端，與它互補的子鏈從另一端開始合成，即與引物Ⅱ結合進行DNA子鏈的延伸。知識點1．目的(1)使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。(2)使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2．地位：基因工程的核心步驟。基因表達載體的構建3．基因表達載體的組成4．過程知識貼士啟動子≠起始密碼子，終止子≠終止密碼子(1)啟動子位于基因的上游，是RNA聚合酶識別和結合的部位，與終止子一樣都位于DNA片段上，分別控制轉錄過程的啟動和終止。(2)起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯過程的啟動和終止。

下圖為基因表達載體的模式圖，下列有關基因工程中載體的說法，錯誤的是 (

)A．基因工程的核心步驟是基因表達載體的構建B．基因表達載體的構建并不一定相同C．圖中啟動子位于目的基因的首端，是核糖體識別和結合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作為標記基因，用于鑒別受體細胞中是否導入了目的基因典例2典例剖析C

解析：由于受體細胞有植物、動物、微生物之分，以及目的基因導入受體細胞的方法不同，因此基因表達載體的構建也會有所差別，不可能是千篇一律的；啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段，位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA。2．(不定項)如圖是利用基因工程技術培育轉基因植物，生產可食用疫苗的部分過程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性內切核酸酶。下列說法正確的是 (

)變式訓練A．卡那霉素抗性基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來B．基因表達載體構建時需要用到限制酶SmaⅠC．切割目的基因需要PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶D．除圖示組成外，基因表達載體中還應該含有啟動子和終止子等結構ACD

解析：卡那霉素抗性基因是標記基因，便于鑒定和篩選含有目的基因的細胞，A正確；構建過程中需要將目的基因完整切割下來，需要在目的基因的兩側有酶切位點，而不能選擇酶切位點在目的基因內部的限制酶，SmaⅠ的識別序列位于目的基因上，因此要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅡ，B錯誤、C正確；基因表達載體包括啟動子、目的基因、終止子和標記基因等，D正確。知識點1．導入的方法目的基因導入受體細胞受體細胞類型方法說明特點植物細胞農桿菌轉化法將目的基因插入Ti質粒的T－DNA上→轉入農桿菌→導入植物細胞→插入植物細胞中的染色體DNA上→目的基因表達經濟、有效，適合于雙子葉植物和裸子植物花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞→目的基因表達簡便、經濟，我國科學家獨創(chuàng)受體細胞類型方法說明特點動物細胞顯微注射法目的基因片段受精卵的核內→將受精卵移植到雌性動物的輸卵管或子宮內→使受精卵發(fā)育成轉基因動物將目的基因導入動物細胞的最有效的方法微生物細胞Ca2＋處理法(感受態(tài)細胞法)Ca2＋處理微生物細胞→感受態(tài)細胞→將基因表達載體與感受態(tài)細胞混合在緩沖液中→在一定溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子，完成轉化過程簡便、經濟、有效2．目的基因在受體細胞中的位置不同會引起遺傳上的差別(1)圖中a細胞減數(shù)分裂時，細胞質是不均分的，子細胞不一定含有目的基因。(2)圖中b在進行細胞減數(shù)分裂時，細胞核中的DNA經復制后平均分配到兩個子細胞中，保證了親子代遺傳性狀的穩(wěn)定性，細胞中目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達。知識貼士在將目的基因導入受體細胞之前，都必須進行基因表達載體的構建，也就是說導入受體細胞的必須是重組DNA分子，而不是直接導入目的基因。

下列有關將目的基因導入受體細胞的敘述，正確的是

(

)A．將目的基因導入植物細胞采用最多的方法是農桿菌轉化法B．原核生物有繁殖快、遺傳物質少等特點，可用于生產各種有生物活性的蛋白質C．基因槍法是將目的基因導入動物細胞中最為有效的方法D．可將含有目的基因的植物病毒作為載體導入Ca2＋處理后的大腸桿菌細胞典例3典例剖析A

解析：原核生物的細胞中沒有內質網和高爾基體，不能對蛋白質進行加工，故生產的蛋白質可能沒有生物活性；將目的基因導入動物細胞最常用的方法是顯微注射技術；植物病毒只侵染植物細胞。3．下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關敘述，正確的是

(

)A．⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異B．③侵染植物細胞后，重組Ti質粒整合到④的染色體上C．④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲性狀D．②的構建需要限制性內切核酸酶和DNA聚合酶參與變式訓練A

解析：⑤為轉基因植物，只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就說明轉入的目的基因成功表達了，基因工程的原理是基因重組，屬于可遺傳變異，A項正確；③侵染植物細胞后，重組Ti質粒上的T－DNA整合到棉花細胞的染色體上，B項錯誤；受體細胞的染色體上可能含抗蟲基因，但不代表該基因就一定成功表達，因此不能確定⑤是否表現(xiàn)出抗蟲性狀，C項錯誤；基因表達載體的構建需要限制性內切核酸酶和DNA連接酶參與，D項錯誤。知識點1．目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定2．不同分子檢測原理的異同(1)檢測目的基因是否插入受體DNA中、目的基因是否轉錄時，用的探針都是放射性同位素等標記的含有目的基因的DNA片段。檢測原理都是堿基互補配對原則，只是被檢測的物質不同，一個是轉基因生物的基因組DNA，一個是轉基因生物細胞內的mRNA。(2)進行翻譯水平的檢測，通常以目的基因表達產物(蛋白質)作抗原，制備相應抗體，檢測轉基因生物的蛋白質，利用抗原與抗體特異性結合的原理。(3)不論是復制水平、轉錄水平還是翻譯水平的檢測，都是在體外進行的。知識貼士基因工程操作過程中堿基互補配對現(xiàn)象基因工程操作過程中只有第三步“將目的基因導入受體細胞”沒有堿基互補配對現(xiàn)象；第一步篩選與獲取目的基因，用人工合成、PCR獲取或基因文庫獲取，三種常用方法都涉及堿基互補配對；第二步基因表達載體的構建中DNA連接酶連接目的基因與質粒載體，第四步利用分子雜交的方法檢測(DNA、mRNA)，也都存在堿基互補配對現(xiàn)象。

目的基因導入受體細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過鑒定與檢測才能知道。下列屬于目的基因檢測和鑒定的是

(

)①檢測受體細胞中是否有目的基因②檢測受體細胞中是否有致病基因③檢測目的基因是否轉錄出了mRNA

④檢測目的基因是否翻譯成蛋白質A．①②③

B．②③④C．①③④ D．①②④典例4C

典例剖析解析：對轉基因中目的基因的分子水平的檢測包括三個方面：①檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了相應的mRNA，方法也是使用基因探針與之雜交；③檢測目的基因是否翻譯成了相應的蛋白質，常用的方法是抗原—抗體雜交。4．綠葉海天牛(簡稱甲)吸食濱海無隔藻(簡稱乙)后，身體就逐漸變綠，這些“奪來”的葉綠體能夠在甲體內長期穩(wěn)定存在，有科學家推測其原因是在甲的染色體DNA上可能存在乙編碼葉綠體部分蛋白的核基因。為證實上述推測，以這種變綠的甲為材料進行實驗，方法和結果最能支持上述推測的是 (

)變式訓練A．提取甲的全部DNA，通過PCR技術能克隆出乙的編碼葉綠體蛋白的核基因B．通過核酸分子雜交技術，在甲體內檢測到乙的編碼葉綠體蛋白的核基因轉錄出的RNAC．給甲提供14CO2，一段時間后檢測到其體內的部分有機物出現(xiàn)放射性D．用乙編碼葉綠體蛋白的核基因做探針與甲的染色體DNA雜交，結果顯示出雜交帶答案：D

解析：通過PCR技術從甲體內的DNA中克隆出屬于乙的編碼葉綠體蛋白的核基因，這只能說明甲體內含有乙的編碼葉綠體蛋白的核基因，但不能說明甲的染色體DNA上存在乙編碼葉綠體部分蛋白的核基因，A項錯誤；通過核酸分子雜交技術，在甲體內檢測到乙的編碼葉綠體蛋白的核基因轉錄出的RNA，這只能說明甲體內含有乙的編碼葉綠體蛋白的核基因且發(fā)生了轉錄，但不能說明甲的染色體DNA上存在乙編碼葉綠體部分蛋白的核基因，B項錯誤；給甲提供14CO2，一段時間后檢測到其體內的部分有機物出現(xiàn)放射性，這只能說明甲進行了光合作用，其中含有葉綠體，但不能說明甲的染色體DNA上存在乙編碼葉綠體部分蛋白的核基因，C項錯誤；用乙編碼葉綠體蛋白的核基因做探針與甲的染色體DNA雜交，結果顯示出雜交帶，這說明甲的染色體DNA上存在乙編碼葉綠體部分蛋白的核基因，D項正確。知識點1．原理(1)PCR利用DNA的熱變性原理，通過調整溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器。(2)DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團帶上正電荷和負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子向著與它所帶電荷相反的電極移動。PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。DNA片段的擴增及電泳鑒定2．材料與用具(1)PCR儀一臺能夠自動調控溫度的儀器。(2)微量離心管進行PCR反應的場所，一種薄壁塑料管，總容積為0.2mL或0.5mL。(3)微量移液器、一次性吸液槍頭用于定量轉移PCR反應體系的配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。(4)電泳裝置(包括電泳儀、電泳槽)用于鑒定PCR的產物。(5)材料試劑4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等。3．方法步驟(1)PCR擴增①準備：按照PCR反應體系的配方或PCR試劑盒的說明書，將所需的試劑擺放在實驗桌上。②移液：用微量移液器按照PCR反應體系的配方往微量離心管里面加入各種試劑。③混合：蓋嚴微量離心管的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。注意：離心管的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢。手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應液混合均勻。④離心a．過程：將微量離心管放入離心機里，離心約10s。b．目的：使掛在管壁上的液體全部甩下。⑤反應循環(huán)程序變性復性延伸預變性94℃，5min——30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min注意：預變性的目的是增加大分子模板DNA徹底變性的概率。(2)鑒定PCR產物——瓊脂糖凝膠電泳法①配制瓊脂糖溶液：用電泳緩沖液配制質量體積比為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。②制備瓊脂糖凝膠：將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入適合大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。見下圖：③將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。④加樣：將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液(內含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。⑤電泳：接通電源，進行電泳，待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。⑥取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。

用PCR方法檢測轉基因植株是否成功導入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標準樣液(Marker)，10號為蒸餾水。PCR時加入的模板DNA如下圖所示。據此作出的分析，不合理的是 (

)A．PCR產物的分子大小為250～500bpB．3號樣品為不含目的基因的載體DNAC．9號樣品對應植株不是所需的轉基因植株D．10號的電泳結果能確定反應體系等對實驗結果沒有干擾典例5B

典例剖析解析：PCR過程中，可以通過設計特定的引物來擴增特定的DNA片段。4～9號是轉基因植株，理論上應包含目的基因，結合2號野生型和10號蒸餾水組的結果，推測包含目的基因的片段大小應為250～500bp，A項正確。3號PCR結果包含250～500bp片段，應包含目的基因，B項錯誤。9號PCR結果不包含250～500bp片段，所以不是所需轉基因植株，C項正確。10號放入蒸餾水，可排除反應體系等對結果的干擾，D項正確。5．對禽流感的確診，先用PCR技術將標本基因大量擴增，然后利用基因探針，測知待測標本與探針核酸的堿基異同。下圖P表示禽流感病毒探針基因在凝膠的電泳標記位置，甲、乙、丙、丁是四份送檢樣品在測定后的電泳標記位置，哪份標本最有可能被確診為禽流感？

(

)A．甲

B．乙C．丙

D．丁變式訓練C

解析：據圖分析，圖中P表示禽流感病毒探針基因在凝膠的電泳標記位置，甲、乙、丙、丁是四份送檢樣品在測定后的電泳標記位置，其中丙的電泳位置與P最接近，因此最有可能被確診為禽流感。指點迷津?撥云見日一、PCR技術1．通過PCR技術獲得目的基因的過程1．一般情況下，DNA模板鏈較長，需要PCR擴增的基因只是DNA模板鏈的一段。2．第一輪循環(huán)，兩引物與模板鏈互補，DNA分子模板鏈最長，新合成的DNA單鏈(含有引物的鏈)較短。3．第二輪循環(huán)，以含有引物的母鏈為模板合成的DNA分子，會出現(xiàn)含有兩個引物的DNA，其中新合成的單鏈b會比母鏈a更短，其實b就是我們所需擴增的目的基因的長度，只是b為單鏈。4．第三輪循環(huán)，以b為模板合成的DNA片段就是目的基因片段的長度。5．結果分析(1)兩條單鏈等長DNA(目的基因)從第三輪循環(huán)開始出現(xiàn)(甲、乙)。隨循環(huán)次數(shù)的增加，目的基因含量會不斷增加。(2)通過以上分析我們可知，PCR反應的產物不都是所需的目的基因片段，除目的基因外，還會存在四種類型的DNA分子(這四種類型同第二輪循環(huán)產生的4個DNA分子)。(3)DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，等長DNA(目的基因)從第三輪循環(huán)開始出現(xiàn)，隨著循環(huán)次數(shù)的增多，呈指數(shù)擴增。

請回答以下基因工程方面的有關問題：(1)利用PCR技術擴增目的基因，其原理與細胞內DNA復制類似(如下圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎。典例6典例剖析①從理論上推測，第四輪循環(huán)產物中含有引物A的DNA片段所占的比例為____________。②在第____輪循環(huán)產物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。15/16

三

(2)設計引物是PCR技術的關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請分別說明理由。①第1組：__________________________________________；②第2組：________________________________________________。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效

引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效

(3)PCR反應體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因為____________________________________________________________________。DNA聚合酶只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結合到雙鏈DNA片段的引物鏈上

解析：(1)①由圖可知，以原來的每條母鏈為模板合成的兩個新DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子鏈為模板合成新DNA分子時，兩種引物都含有，故第四輪循環(huán)共產生16個DNA分子，其中含有引物A的分子是15個，占15/16。②第一、二循環(huán)合成的子鏈長度均不同，根據半保留復制特點，前兩輪循環(huán)產生的4個DNA分子的兩條鏈均不等長，第三輪循環(huán)產生的DNA分子存在等長的兩條核苷酸鏈。(2)引物是單鏈DNA時才能與DNA結合，而單鏈DNA的堿基互補配對部分容易形成雙鏈結構而失去其功能。從圖示可以看出，第1組引物Ⅰ和引物Ⅱ局部堿基互補配對，易形成雙鏈結構而失效。第2組引物相互間不能發(fā)生堿基互補配對，但引物Ⅱ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效。(3)DNA聚合酶的作用是將單個脫氧核苷酸連續(xù)結合到雙鏈DNA片段的引物鏈上，而不能直接將兩個脫氧核苷酸連在一起。二、啟動子和起始密碼子、終止子和終止密碼子的區(qū)別項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子化學成分DNA片段DNA片段mRNA上三個相鄰堿基mRNA上三個相鄰堿基位置目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA決定轉錄的結束翻譯的起始信號決定翻譯過程的結束

下列有關人胰島素基因表達載體的敘述，正確的是(

)A．表達載體中的胰島素基因可通過人肝細胞mRNA反轉錄獲得B．表達載體的復制和胰島素基因的表達均啟動于復制原點C．借助抗生素抗性基因可將含胰島素基因的受體細胞篩選出來D．啟動子和終止密碼子均在胰島素基因的轉錄中起作用典例6典例剖析C

解析：由于人肝細胞中胰島素基因不能表達，所以無法利用人肝細胞mRNA反轉錄獲得胰島素基因，A項錯誤；表達載體的復制啟動于復制原點，但胰島素基因的表達則開始于啟動子，B項錯誤；抗生素抗性基因是標記基因，作用是檢測受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有胰島素基因的受體細胞篩選出來，C項正確；啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，是轉錄的起點，而終止密碼子位于mRNA上，在翻譯中起作用，D項錯誤。解疑答惑從社會中來?P76提示：轉基因抗蟲棉抗蟲的機制是抗蟲基因(Bt基因)來源于蘇云金桿菌，Bt基因表達的蛋白質具有殺蟲活性。當害蟲食用轉基因抗蟲棉花的時候，同時攝入Bt基因產生的抗蟲蛋白，當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。培育轉基因抗蟲棉的步驟有目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建，將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定。旁欄思考1?P79提示：用PCR不能直接擴增mRNA，DNA聚合酶識別的是雙鏈DNA，mRNA為單鏈結構。應首先逆轉錄獲得cDNA才能進行PCR。旁欄思考2?P80提示：有人采用總DNA注射法進行遺傳轉化，即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導入受體植物，沒有進行表達載體的構建，這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定什么基因導入了受體植物。到社會中去?P831．提示：這是一個開放性的問題，需要查找資料來回答。隨著田間監(jiān)測數(shù)據的更新及新的科研論文發(fā)表，每年獲得的證據是不一樣的。要注意搜集科學、可靠的證據，如科研論文、權威的官方報道等。2．提示：科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。(1)基因策略。該策略是在分子水平上提高轉基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性，包括在棉花中轉入多個殺蟲基因、構建組織特異性表達的啟動子、提高殺蟲基因的表達量等。例如，最早種植的抗蟲棉中只轉入了一種Bt基因，抗性比較單一；現(xiàn)在經常將兩種或兩種以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同時轉入棉花細胞，這樣既可以提高殺蟲活性，又可以延緩害蟲抗性的產生和發(fā)展，還可以通過不同基因間的互補作用擴大抗蟲范圍。(2)田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護所、與其他作物輪作或套種等。(3)國家宏觀調控策略。該策略包括實施分區(qū)種植管理、加強抗性監(jiān)測、進行嚴格的安全性評價等。練習與應用?P83一、概念檢測1．(1)√(2)×

提示：構建質粒要用到限制酶(用來在特定位點進行切割)和DNA連接酶(用來連接目的基因和載體)，不需要核酸酶。(3)×

提示：目的基因成功導入受體細胞后不一定會表達，還需要進行檢測和鑒定。2．D

提示：延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種脫氧核苷酸。二、拓展應用1．提示：可能在自交繁殖過程中存在轉基因的沉默或丟失現(xiàn)象。2．提示：(1)psy和crlⅠ基因、pmi基因將目的基因送入受體細胞。(2)不能，限制酶會將目的基因切斷，破壞目的基因。(3)維生素A在人體內具有非常重要的生理功能，對視力、骨骼生長、免疫功能等都有調節(jié)作用。但是，人體不能合成維生素A，需要從食物中攝取。維生素A缺乏癥是南亞地區(qū)常見的由營養(yǎng)不良導致的疾病，該地區(qū)的居民一般以秈稻作為主食。β－胡蘿卜素是維生素A的前體，在人體內它可以轉化為維生素A。因此，科學家將兩個參與β－胡蘿卜素合成的酶的基因轉入了秈稻中，使其胚乳中富含β－胡蘿卜素，期望讓人們通過日常食用主食就能補充足夠量的維生素A，從而降低維生素A缺乏癥的患病率。關于“是否要推廣‘黃金大米’”的爭論主要圍繞其安全性、有效性等方面展開。探究·實踐?P84結果分析與評價1．提示：觀察DNA帶的分布及粗細程度來評價擴增的效果。2．提示：如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當?shù)?。如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質量不好等。訓練鞏固?課堂達標1．利用外源基因在受體細胞中表達，可生產人類所需的產品。下列選項中能說明目的基因在導入受體細胞后完成表達的是 (

)A．棉花細胞中檢測到載體上的標記基因B．山羊乳腺細胞中檢測到人生長激素基因C．大腸桿菌中檢測到人胰島素基因的mRNAD．酵母菌細胞中提取到人的干擾素解析：A、B兩項只說明目的基因已導入受體細胞中，C項說明目的基因在受體細胞中轉錄出了mRNA。D項含有人的干擾素基因的酵母菌合成了人的干擾素，說明目的基因