食品檢測-5食品微生物檢驗(yàn)的基本程序課件

第五章食品微生物檢驗(yàn)的基本程序本章的主要內(nèi)容食品微生物檢驗(yàn)的一般步驟檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備樣品的采集樣品的送檢樣品的處理方法致病菌檢驗(yàn)參考菌群的選擇樣品的檢驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告一.食品微生物檢驗(yàn)的一般步驟樣品采集樣品處理樣品保存選擇參考菌群檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備菌落總數(shù)大腸菌群致病菌分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)增菌純化染色鏡檢生化試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告二.檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備準(zhǔn)備好所需的各種儀器。按技術(shù)要求將各種玻璃儀器進(jìn)行清洗、烘干、包扎、滅菌，冷卻后送無菌室備用。準(zhǔn)備好所用的各種試劑，做好普通營養(yǎng)瓊脂或其他選擇必培養(yǎng)基。做好無菌室或超凈工作臺(tái)的滅菌工作，提前1h滅菌30~60min.工作衣、鞋、帽、等滅菌后備用。工作人員進(jìn)入無菌室后，實(shí)驗(yàn)沒有完成之前不得隨便出入無菌室。三.樣品的采集（一）采樣的目的和意義便于食品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督管理鑒別食品中是否存在有毒有害物質(zhì)。為新產(chǎn)品、新資源利用、新食品化工產(chǎn)品、新工藝投產(chǎn)前進(jìn)行衛(wèi)生鑒定。（二）樣品的種類大樣，就是一整批；中樣，是從樣品中各部分取得的混合樣品，一般為200g；小樣，也稱檢樣，做分析用的，一般為25g。（三）采樣的步驟采樣前調(diào)查→現(xiàn)場觀察→確定采樣方案→采樣→樣品封存→開具采樣證明（四）采樣的要求1、嚴(yán)格遵守樣品采集的操作規(guī)程。2、所采樣品必須具有代表性。3、采樣操作要防止污染，防止變質(zhì)、損壞、丟失。4、不得加入防腐劑、固定劑等。5、樣品采集和現(xiàn)場測定必須有二人以上參加。（五）食品微生物檢驗(yàn)的采樣方案1、食品衛(wèi)生學(xué)微生物檢驗(yàn)的取樣方案檢驗(yàn)?zāi)康模簷z驗(yàn)食品的微生物衛(wèi)生指標(biāo)是否合格。取樣方案有：ICMSF取樣方案；美國FDA的取樣方案；世界糧農(nóng)組織（FAO）取樣方案；我國的食品取樣方案。一般說來，進(jìn)出口貿(mào)易合同對食品抽樣量有明確規(guī)定的，按合同規(guī)定抽樣；進(jìn)出口貿(mào)易合同沒有具體抽樣規(guī)定的，可根據(jù)檢驗(yàn)的目的，產(chǎn)品及被抽樣品批的性質(zhì)和分析方法的性質(zhì)確定抽樣方案。目前最為流行的抽樣方案為ICMSF推薦的抽樣方案和隨機(jī)抽樣方案，有時(shí)也可參照同一產(chǎn)品的品質(zhì)檢驗(yàn)抽樣數(shù)量抽樣，或按單位包裝件數(shù)N的開平方值抽樣。無論采取何種方法抽樣，每批貨物的抽樣數(shù)量不得少于5件。對于需要檢驗(yàn)沙門氏菌的食品，抽樣數(shù)量應(yīng)適當(dāng)增加，最低不少于8件。ICMSF推薦的抽樣方案ICMSF的采樣設(shè)想及其基本方法用于分析所抽樣品的數(shù)量、大小和性質(zhì)對結(jié)果會(huì)產(chǎn)生很大影響。在某些情況下用于分析的樣品可能代表所抽“一批”（lot）樣品的真實(shí)情況，這適合于可充分混合的液體，如牛奶和水。在“多批”（Lots或“batchers”）食品的情況下就不能如此抽樣，因?yàn)椤耙慌比菀装谖⑸锏馁|(zhì)量上差異很大的多個(gè)單元。因此在選擇抽樣方案之前，必須考慮諸多因素（ICMSF，1986），包括：——檢驗(yàn)?zāi)康摹a(chǎn)品及被抽樣品的性質(zhì)——分析方法

ICMSF提出的采樣基本原則，是根據(jù)（1）各種微生物本身對人的危害程度各有不同。（2）食品經(jīng)不同條件處理后，其危害度變化情況：①降低危害度；②危害度未變；③增加危害度，來設(shè)定抽樣方案并規(guī)定其不同采樣數(shù)。目前，加拿大、以色列等很多國家已采用此法作為國家標(biāo)準(zhǔn)。在進(jìn)行詳細(xì)敘述之前，先解釋四個(gè)代號(hào)：n：系指一批產(chǎn)品采樣個(gè)數(shù)。c：系指該批產(chǎn)品的檢樣菌數(shù)中，超過限量的檢樣數(shù)，即結(jié)果超過合格菌數(shù)限量的最大允許數(shù)。m：系指合格菌數(shù)限量，將可接受與不可接受的數(shù)量區(qū)別開。

M：系指附加條件，判定為合格的菌數(shù)限量，表示邊緣的可接受數(shù)與邊緣的不可接受數(shù)之間的界限。

1．ICMSF的采樣方法有些實(shí)驗(yàn)室在每批產(chǎn)品中，僅采一個(gè)檢樣進(jìn)行檢驗(yàn)，該批產(chǎn)品是否合格，全憑這個(gè)檢樣來決定。ICMSF方法與此不同，它是從統(tǒng)計(jì)學(xué)原理來考慮，對一批產(chǎn)品，檢查多少檢樣，才能夠有代表性，才能客觀地反映出該產(chǎn)品的質(zhì)量而設(shè)定的。ICMSF方法中包括二級(jí)法及三級(jí)法兩種。二級(jí)法只設(shè)有n、с及m值，三級(jí)法則有n、c、m及M值。M即附加條件后判定合格的菌數(shù)限量。（1）二級(jí)抽樣方案。自然界中材料的分布曲線一般是正態(tài)分布，以其一點(diǎn)作為食品微生物的限量值，只設(shè)合格判定標(biāo)準(zhǔn)m值，超過m值的，則為不合格品。檢查在檢樣是否有超過m值的，來判定該批是否合格。以生食海產(chǎn)品魚為例n=5，c=0，m=102，n=5即抽樣5個(gè)，c=0即意味著在該批檢樣中，未見到有超過m值的檢樣，此批貨物為合格品。（2）三級(jí)抽樣方案。設(shè)有微生物標(biāo)準(zhǔn)m及M值兩個(gè)限量如同二級(jí)法，超過m值的檢樣，即算為不合格品。其中以m值到M值的范圍內(nèi)的檢樣數(shù)，作為c值，如果在此范圍內(nèi)，即為附加條件合格，超過M值者，則為不合格。例如：冷凍生蝦的細(xì)菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)n=5，c=3，m=101，M=102，其意義是從一批產(chǎn)品中，取5個(gè)檢樣，經(jīng)檢樣結(jié)果，允許≤3個(gè)檢樣的菌數(shù)是在m;M值之間，如果有3個(gè)以上檢樣的菌數(shù)是在m;M值之間或一個(gè)檢樣菌數(shù)超過M值者，則判定該批產(chǎn)品為不合格品。（3）．ICMSF對食品中微生物的危害度分類與抽樣方案說明為了強(qiáng)調(diào)抽樣與檢樣之間的關(guān)系，ICMSF已經(jīng)闡述了把嚴(yán)格的抽樣計(jì)劃與食品危害程度相聯(lián)系的概念（ICMSF，1986）。在中等或嚴(yán)重危害的情況下使用二級(jí)抽樣方案，對健康危害低的則建議使用三級(jí)抽樣方案。

ICMSF是將微生物的危害度、食品的特性及處理?xiàng)l件三者綜合在一起進(jìn)行食品中微生物危害度分類的。這個(gè)設(shè)想是很科學(xué)的，符合實(shí)際情況的，對生產(chǎn)廠及消費(fèi)者來說都是比較合理的。

級(jí)別

危害程度

對象微生物

食品經(jīng)不同處理后的危害度減少（加熱））無變化（冷凍品立刻進(jìn)食增加危害度（未加熱吃到吃前還有一段時(shí)間）三級(jí)方案1.食品的保藏2.輕度間接指標(biāo)菌

3.中度程度局部傳播

細(xì)菌數(shù)大腸菌群大腸桿菌金黃色葡萄球菌（指標(biāo)菌）金黃色葡萄球菌蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)氣莢膜梭菌

n=5c=3n=5c=2n=5c=1二級(jí)方案1.中度程度廣泛傳播2.嚴(yán)重程度

沙門氏菌副溶血性弧菌致病性大腸桿菌肉毒梭菌霍亂弧菌傷寒沙門氏菌n=15c=0n=30c=0n=60c=0注：表中“減少”系指食品經(jīng)加熱殺死污染的細(xì)菌?！盁o變化”系指微生物數(shù)不增減例如冷凍食品或干燥食品。“增加”系指將食品保存在不良環(huán)境中使微生物易于繁殖和產(chǎn)毒。

三、抽樣方法確定了抽樣方案以后，抽樣方法對抽樣方案的有效執(zhí)行和保證樣品的有效性代表性至關(guān)重要。抽樣必須遵循無菌操作程序，抽樣工具如整套不銹鋼勺子、鑷子、剪刀等應(yīng)當(dāng)高壓滅菌，防止一切可能的外來污染。容器必需清潔、干燥、防漏、廣口、滅菌，大小適合盛放檢樣。抽樣全過程中，應(yīng)采取必要的措施防止食品中固有微生物的數(shù)量和生長能力發(fā)生變化。確定檢驗(yàn)批，應(yīng)注意產(chǎn)品的均質(zhì)性和來源，確保檢樣的代表性。常見的抽樣方法有：1、常見的抽樣方法有：1）、重量法采取一定重量的食品作為一個(gè)樣品。采取屠宰后兩腿內(nèi)側(cè)肌或背最長肌100g/只；蛋、蛋制品樣品，每份不少于200g；見（書后）。2）、拭子法拭子法采樣不損害肉的完整性，操作簡便。但是檢出的活菌總數(shù)不高。2、按照采集對象特點(diǎn)不同，常見的抽樣方法有：1）．直接食用的小包裝食品：盡可能取原包裝，直到檢驗(yàn)前不要開封，以防污染。2）．桶裝或大容器包裝的液體食品：（1）．抽樣前搖動(dòng)或用滅菌棒攪拌液體，盡量使其達(dá)到均質(zhì)；（2）．抽樣時(shí)應(yīng)先將抽樣用具浸入液體內(nèi)略加漂洗，然后再取所需量的樣品，裝人滅菌盛樣容器的量，不應(yīng)超過其容量的四分之三，以便于檢驗(yàn)前將樣品搖勻；（3）．取完樣品后，應(yīng)用消毒的溫度計(jì)插入液體內(nèi)測量食品的溫度，并作記錄。盡可能不用水銀溫度計(jì)測量，以防溫度計(jì)破碎后水銀污染食品；（4）．如為非冷藏易腐食品，應(yīng)迅速將所抽樣品冷卻至0-4℃。2、食物中毒微生物檢驗(yàn)的取樣檢驗(yàn)?zāi)康模翰檎沂澄镏杏泻尾≡?、人畜共患病病原菌檢驗(yàn)的取樣檢驗(yàn)?zāi)康模鸿b定畜禽及其產(chǎn)品是否帶有人獸共患的病原菌。（六）食品微生物檢驗(yàn)采樣方法采樣原則：能采取完整包裝的樣品就不拆開取樣，必須拆開包裝取樣的應(yīng)按無菌操作進(jìn)行取樣.1、液體樣品采樣方法充分混勻后，無菌操作打開包裝，用100mL無菌注射器抽取,注入無菌盛樣容器.2、半固體樣品采樣方法無菌操作打開包裝，用無菌勺子從幾個(gè)部位挖取樣品，放入無菌容器。

3、固體樣品采樣方法大塊整體食品用無菌刀具和鑷子從不同的部位割取，并注意其代表性；小塊大包裝食品應(yīng)從不同部位的小塊上切取樣品，放入無菌容器。若為檢驗(yàn)食品的污染情況，可取表層樣品；若為檢驗(yàn)食品品質(zhì)的情況，應(yīng)從深部取樣。

4、冷凍食品采樣方法大包裝小塊冷凍食品按小塊個(gè)體采取；大塊冷凍食品可用無菌刀從不同部位削取或用無菌手鋸從凍塊上鋸取樣品，放入無菌容器。若為檢驗(yàn)食品污染情況，可取表層樣品；若為檢驗(yàn)食品品質(zhì)情況，應(yīng)從深部取樣。5、生產(chǎn)工序監(jiān)測采樣車間用水：從車間各龍頭采樣；車間臺(tái)面、用具、及加工售貨員手的衛(wèi)生監(jiān)測：用5cm2孔無菌采樣板和5支無菌棉簽擦拭25cm2面積，擦拭后立即用無菌剪刀將棉簽頭剪入無菌容器中。車間空氣采樣：將5個(gè)直徑90mm的普通瓊脂平板分別置于車間的四角和中部，打開平皿蓋5min，然后蓋蓋送檢。平皿（七）采樣標(biāo)簽的填寫標(biāo)簽內(nèi)容主要：

編號(hào)、樣品名稱、生產(chǎn)單位、生產(chǎn)日期、產(chǎn)品批號(hào)、產(chǎn)品數(shù)量、存放條件、采樣時(shí)間、采樣人姓名，現(xiàn)場情況?！痢痢痢痢敛蓸訂螛悠肪幪?hào)：━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━產(chǎn)品名稱（商品名）______規(guī)格型號(hào)__________注冊商標(biāo)_____________生產(chǎn)廠家_______________通訊地址__________郵政編碼□□□□□□受檢地點(diǎn)_______________通訊地址__________郵政編碼□□□□□□采樣地點(diǎn)_______________采樣日期__________采樣基數(shù)______________生產(chǎn)日期_______________批號(hào)__________產(chǎn)品依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)__________有效成分及含量____________________________________________________________檢驗(yàn)?zāi)康豞_______________檢測項(xiàng)目_____________________________采樣人仔細(xì)閱讀以下句子，然后簽字我認(rèn)真負(fù)責(zé)地填寫了該樣品采樣單，承認(rèn)以上填寫的合法性，被該采親單位所證實(shí)的樣品系按照采樣方法取得的，該樣品具有代表性、真實(shí)性和公正性。代表單位（章）代表單位（章）簽字簽字日期年月日日期年月日

備注

四.樣品的送檢要求1、要快速運(yùn)送：不要超過3小時(shí)；2、若路途遙遠(yuǎn)，可在1~5℃低溫下運(yùn)送；3、要注意防污染、防散漏、防變質(zhì)；4、要填寫檢驗(yàn)申請單。五.樣品的處理方法（一）液體樣品（二）固體樣品（三）冷凍樣品(一)液體樣品的處理瓶裝液體樣品的處理盒裝或軟塑料包裝樣品的處理1.瓶裝液體樣品的處理用點(diǎn)燃的酒精棉球灼燒瓶口滅菌，接著用石炭酸或來蘇爾消毒后的紗布蓋好，再用滅菌開瓶器將蓋啟開；含有二氧化碳的樣品可倒入500mL磨口瓶內(nèi)，口勿蓋緊，覆蓋一滅菌紗布，輕輕搖蕩，待氣體全部逸出后，取樣25mL檢驗(yàn)。2.盒裝或軟塑料包裝樣品的處理將其開口處用75%酒精棉擦拭消毒，用滅菌剪子剪開包裝，覆蓋上滅菌紗布或浸有消毒液的紗布在剪開部分，直接吸取樣品25mL，或傾入另一滅菌容器中再取樣25mL檢驗(yàn)。（二）固體樣品的處理搗碎均質(zhì)法剪碎振搖法研磨法整粒振搖法胃蠕動(dòng)均質(zhì)法1.搗碎均質(zhì)法將中樣(≥100g)剪碎或攪拌混勻，從中取25g放入帶225mL稀釋液的無菌均質(zhì)杯中，8000~10000r/min均質(zhì)1~2min即可。2.剪碎振搖法將中樣(≥100g)剪碎或攪拌混勻，從中取25g檢樣進(jìn)一步剪碎，放入帶225mL稀釋液和直徑5mm左右玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖50次，振幅要大于40cm。3.研磨法將中樣(≥100g)剪碎或攪拌混勻，從中取25g檢樣放入無菌乳缽中充分研磨后，再放入帶有225mL無菌稀釋液的稀釋瓶中，蓋緊蓋后充分搖勻。4.整粒振搖法直接稱取25g整粒樣品置于帶有225mL稀釋液和直徑5mm左右玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖50次，振幅要大于40cm。（三）冷凍樣品冷凍樣品，先將中樣在0~4℃下解凍，時(shí)間不能超過18h，或在45℃下解凍，時(shí)間不能超過15min。再取檢樣25g做稀釋處理。六.致病菌檢驗(yàn)參考菌群的選擇蛋及蛋制品：沙門氏菌、葡萄球菌、變形桿菌等水產(chǎn)品海產(chǎn)品：鏈球菌、副溶血性弧菌乳制品：沙門氏菌、志賀氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌畜禽肉類：腸道致病菌和致病性球菌米面類：蠟樣芽胞桿菌、變形桿菌、酵母霉菌等罐頭：耐熱性芽胞桿菌、嗜熱脂肪桿菌、大芽胞桿菌、七.樣品的檢驗(yàn)（一）、收樣：1、收到樣品后逐一核對驗(yàn)收，登記編號(hào)；如2004年收到的50號(hào)樣品，編號(hào)可寫成：200400502、立即將樣品放在冰箱或冰盒中，并積極做好準(zhǔn)備工作。（二）、檢驗(yàn)

1、選擇檢驗(yàn)方法：國內(nèi)：國家標(biāo)準(zhǔn)GB國外：國際標(biāo)準(zhǔn)：如FAO標(biāo)準(zhǔn)、WHO標(biāo)準(zhǔn)；每個(gè)進(jìn)口國的標(biāo)準(zhǔn)：如美國FDA標(biāo)準(zhǔn)、日本厚生省標(biāo)準(zhǔn)、歐共體標(biāo)準(zhǔn)等2、檢驗(yàn)要求（1）