中藥制劑的含量測定

中藥制劑的含量測定第1頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月含量測定的目的和意義反映其制劑中有效成分或者毒性成分的含量衡量其制劑工藝的穩(wěn)定性和中藥材的質(zhì)量優(yōu)劣第2頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容

含量測定樣品的處理

常用含量測定方法

含量測定方法選定原則及驗(yàn)證含量測定第3頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理

樣品基質(zhì)和成分組成復(fù)雜被測成分含量低主要作用：釋放被測組分，制成穩(wěn)定試樣除去雜質(zhì)，純化濃縮試樣形式符合測定的要求第4頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理

樣品的粉碎13

樣品的提取2

樣品的分離凈化萃取法、浸漬法、回流提取法、連續(xù)回流提取法、超聲提取法、水蒸氣蒸餾法、微波萃取法沉淀法、蒸餾法、液液萃取法、色譜法、固相微萃取技術(shù)、消化法第5頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理一、樣品的粉碎目的：取樣均勻，提取完全粉碎設(shè)備：粉碎機(jī)、研缽、銅沖、勻漿機(jī)避免過細(xì)避免樣品受污染避免粉塵飛散及揮發(fā)性成分的損失避免丟棄不易通過篩孔的部分顆粒第6頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理二、樣品的提取對于中藥材和固體制劑樣品，在粉碎后，取粉末適量精密稱定，首先用溶劑進(jìn)行提取，使被測組分和某些共存組分從中溶解出來（前者必須完全溶出），與濾渣分離后，再對被測組分進(jìn)行含量測定。關(guān)鍵——提取完全萃取法、浸漬法、回流提取法、連續(xù)回流提取法、超聲提取法、水蒸氣蒸餾法、微波萃取法第7頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月2.1萃取法

利用溶質(zhì)在兩種互不相溶溶劑中的分配系數(shù)不同，使物質(zhì)從一種溶劑轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中，經(jīng)過多次萃取，將待測組分萃取出來的方法。相似相溶原理水相的pH影響弱酸弱堿性物質(zhì)在兩相的分配主要用于液體樣品中待測組分的萃取分離，多用有機(jī)溶劑將水相中的有機(jī)成分萃取出來注意防止和消除乳化酒劑和酊劑要先揮發(fā)除去乙醇第一節(jié)樣品的處理長時(shí)間靜置用濾紙過濾離心分離加乙醚第8頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理2.2浸漬法

將樣品置于溶媒中浸泡一段時(shí)間分離出浸漬液。分為冷浸法（室溫）和溫浸法（40℃-60℃）常用溶劑有甲醇、適當(dāng)濃度的乙醇和三氯甲烷測定方法：全部測定法：過濾→濾液→蒸干→定容→測定（低濃）部分測定法：過濾→濾液→取若干體積進(jìn)行測定（高濃）優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍：操作簡便，適用于熱不穩(wěn)定的樣品，提取雜質(zhì)較少，但是費(fèi)時(shí)（12-24h），費(fèi)溶劑（10-50倍）第9頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理2.3回流提取法

將冷浸法中的帶塞容器換成回流裝置，用單一溶劑或混合溶劑于水浴上加熱回流提取，其余操作方法同冷浸法。

主要用于固體樣品的提取優(yōu)點(diǎn)：1、提取效率高于冷浸法；

2、縮短提取時(shí)間，每次提取時(shí)間為0.5-2小時(shí)，直至提取完全為止。缺點(diǎn)：1、提取雜質(zhì)較多；

2、該法對熱不穩(wěn)定或具有揮發(fā)性的成分不宜使用。第10頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理2.4連續(xù)回流提取法

樣品置索氏提取器中，利用遇熱可以揮發(fā)的溶劑進(jìn)行反復(fù)提?。ㄏ喈?dāng)于總是在使用新鮮溶劑提?。话闾崛?shù)小時(shí)方可完全。優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍：操作簡便，提取效率高，提取雜質(zhì)較少，所需溶劑少，受熱易分解的成分不宜使用。第11頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理2.5超聲提取法

樣品置適當(dāng)?shù)娜萜髦校尤胩崛∪軇?，放入超聲振蕩器（超聲波清洗器）中進(jìn)行提取。一般僅需數(shù)十分鐘。

優(yōu)點(diǎn)：超聲提取能使樣品粉末更好地分散于溶劑中提高提取效率和提取速度。缺點(diǎn)：促使化學(xué)反應(yīng)發(fā)生（如氧化還原反應(yīng)、大分子化合物的降解和解聚合作用等）。

第12頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理2.6水蒸氣蒸餾法

將含有揮發(fā)性成分的樣品與水共蒸餾，使揮發(fā)性成分隨水蒸氣一并餾出，經(jīng)冷凝分取揮發(fā)性成分的提取方法。

適用范圍：

具有揮發(fā)性、能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞、在水中穩(wěn)定且難溶或不溶于水的藥材成分的提取。第13頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理2.7微波輔助萃取法

在樣品的提取過程中加入微波場，利用微波場的特點(diǎn)來強(qiáng)化有效成分浸出的新型提取技術(shù)。

優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍：設(shè)備簡單、適用范圍廣、萃取效率高、重現(xiàn)性好適用于熱穩(wěn)定性物質(zhì)關(guān)鍵——溶劑的選擇第14頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理三、樣品的分離凈化

中藥液體制劑：萃取→回收溶劑→定容→測定中藥固體制劑：提純后純化分離進(jìn)行測定所選測定方法的專屬性、分離能力、檢測系統(tǒng)對不純樣品污染的耐受程度等原則：從提取液中除去對測定有干擾的雜質(zhì)，而又不損失被測定成分。依據(jù)：被測定成分和雜質(zhì)在理化性質(zhì)上的差異，結(jié)合測定方法的要求。關(guān)鍵——保留有效成分第15頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理

沉淀法21

蒸餾法

液-液萃取法34

色譜法5

消化法6

固相微萃取技術(shù)第16頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理3.1沉淀法

基于某些試劑與被測成分或雜質(zhì)生成沉淀，分離沉淀或保留溶液以得到精制的方法

除去試劑的干擾被測成分不能產(chǎn)生沉淀被測成分沉淀后，沉淀經(jīng)分離后可重新溶解或直接用重量法測定樣品+沉淀劑→沉淀→過濾→濾液→測定→沉淀→重量法或溶解后測定復(fù)方益母草口服液中水蘇堿的含量測定利用雷氏鹽（硫氰酸鉻銨）作沉淀劑，在酸性介質(zhì)中可與大部分有機(jī)堿生成難溶于水的配合物與其它雜質(zhì)分離。第17頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理3.2蒸餾法利用某些被測成分具有揮發(fā)性，可采用蒸餾法，收集餾出液進(jìn)行含量測定，或某些成分經(jīng)蒸餾分解生成揮發(fā)性成分，利用分解產(chǎn)物（要求結(jié)構(gòu)明確）進(jìn)行測定。適用于具揮發(fā)性的待測組分，如揮發(fā)油、小分子的生物堿、丹皮酚等最常用水蒸氣蒸餾法共水蒸餾法通水蒸氣蒸餾法水上蒸餾法利用鹽析作用，提高蒸餾效果第18頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理3.3液-液萃取法直接萃取法萃取劑的選擇

親脂性有機(jī)溶劑，如苯、氯仿或乙醚

弱親脂性的溶劑，如乙酸乙酯、正丁醇等多次萃取（3-4次）調(diào)整水相酸度，提取有機(jī)酸、有機(jī)堿利用鹽析作用，提高提取率第19頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理離子對萃取法原理：在適當(dāng)pH中，某些有機(jī)酸（堿）性物質(zhì)形成的離子與帶相反電荷的離子定量地結(jié)合成為弱極性的離子對，易溶于有機(jī)溶劑，使之萃取分離。適合于高度電離的有機(jī)酸、堿化合物的萃取水相酸度的控制離子對試劑的選擇有機(jī)溶劑的選擇第20頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月起源：1903年俄國植物化學(xué)家茨維特植物色素石油醚溶液3.4色譜法第21頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理分離原理：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜操作方式：柱色譜、薄層色譜、紙色譜裝柱方法：濕法裝柱、干法裝柱操作程序：①柱的活化；②上樣；③清洗；④洗脫。微柱色譜（固相萃取）設(shè)備簡單、使用方便、快速、凈化效率高柱填料：硅膠、氧化鋁、鍵合相硅膠、大孔樹脂、聚酰胺、硅藻土、纖維素、離子交換樹脂等第22頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月固相萃取操作一般有四步：活化--除去柱子內(nèi)的雜質(zhì)并創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境。上樣--將樣品用一定的溶劑溶解，轉(zhuǎn)移入柱并使組分保留在柱上。淋洗----除去不需要的組分。洗脫---用小體積的溶劑將組分淋洗下來并收集。第23頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理硅膠、氧化鋁

硅膠：作用機(jī)制：溶質(zhì)在吸附劑表面的極性吸附作用。非極性或極性低的雜質(zhì)先被洗出色譜柱，再用適當(dāng)極性的溶劑洗脫被測成分，而強(qiáng)極性的雜質(zhì)仍保留在柱上。特點(diǎn)：通常適于酸性和中性物質(zhì)的分離；如分離堿性物質(zhì)，可在展開劑中加入少量稀堿。？氧化鋁分離機(jī)制：溶質(zhì)在吸附劑表面的極性吸附作用堿性氧化鋁適于堿性和中性物質(zhì)的分離酸性氧化鋁適于分析酸性和中性物質(zhì)中性氧化鋁能將黃酮類成份吸附在柱上，可用于生物堿、苷的分離。酸性氧化鋁對于富電子化合物具有更好的保留性。是使用酸性溶劑預(yù)處理過的，具有微弱陽離子特性，表面更易保留中性和帶負(fù)電荷的物質(zhì)，不能很好地保留帶正電荷的物質(zhì)。堿性氧化鋁表面偏向于保留帶正電荷或是含氫鍵類物質(zhì)。是用堿性溶液預(yù)處理過的氧化鋁，具有陰離子特性并有陽離子交換功能，能保留給電子體樣品如：中性胺類化合物，相對于中性與酸性氧化鋁來說，這種能力要弱得多。堿性氧化鋁會有強(qiáng)氫鍵作用，所以對極性陽離子樣品的作用也很明顯。第24頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理鍵合相硅膠（C18或ODS）作用機(jī)制：借助化學(xué)反應(yīng)方法將固定液的官能團(tuán)鍵合在硅膠的表面而構(gòu)成鍵合相硅膠。有機(jī)硅烷與硅膠表面化學(xué)鍵合反應(yīng)，形成的-Si-O-Si-C-鍵是對溶劑、熱和化學(xué)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。分開脂溶性和水溶性成分（苷元和苷的分離）純化水基質(zhì)體液中憎水性藥物洗脫順序：極性大→小第25頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理大孔樹脂極性大孔樹脂：為丙稀酰胺聚合物，對極性化合物有相對強(qiáng)的吸附力非極性大孔樹脂：為苯乙烯和二乙烯苯的共聚物，對非極性水溶性成分有吸附力特點(diǎn)：表面積大，傳質(zhì)速率較高，具有不同的極性及適于吸附較大分子使用前需要用有機(jī)溶劑除去雜質(zhì)，有時(shí)還需用酸、堿清洗測定復(fù)方歸芪劑中的黃芪甲苷用大孔樹脂除去水溶性的多糖雜質(zhì)，再用30%乙醇洗脫黃芪甲苷。第26頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理聚酰胺機(jī)制：主要通過與溶質(zhì)形成氫鍵而產(chǎn)生吸附作用用于含酚、酸、醌類藥物樣品液的凈化分離。測定黃酮時(shí)，用樣品的乙醇提取液上聚酰胺柱，水洗去部分雜質(zhì)，以95%乙醇洗脫總黃酮后測定。

第27頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理硅藻土、纖維素親水性填料機(jī)制：分配作用應(yīng)用：多以水基質(zhì)液為固定相，與水不混溶的有機(jī)溶劑為流動相，較親脂的成分從固定相轉(zhuǎn)移到流動相，而被洗脫。萃取率較高（一般大于80%），無濃集作用，但洗脫劑用量較大（一般大于5ml）第28頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理離子交換樹脂特點(diǎn)：可除去樣品中的離子，防止組分分解，用于萃取樣品液中可解離化合物弱酸性藥物：中性和堿性條件下用陰離子交換樹脂柱，水及有機(jī)溶劑洗脫后，酸性溶液洗目標(biāo)成分離子交換樹脂中含有一種(或幾種)化學(xué)活性基團(tuán)，即交換官能團(tuán)，在水溶液中能離解出某些陽離子(如H+或Na+)或陰離子(如OH－或Cl－)，同時(shí)吸附溶液中原來存有的其他陽離子或陰離子。即樹脂中的離子與溶液中的離子互相交換，從而將溶液中的離子分離出來。第29頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)樣品的處理3.5固相微萃取技術(shù)（SPME）SPME是在固相萃取技術(shù)上發(fā)展起來的一種微萃取分離技術(shù)，是一種集采樣，萃取，濃縮和進(jìn)樣于一體的無溶劑樣品微萃取新技術(shù)。與固相萃取技術(shù)相比，固相微萃取操作更簡單，攜帶更方便，操作費(fèi)用也更加低廉；另外克服了固相萃取回收率低、吸附劑孔道易堵塞的缺點(diǎn)。主要用于分析揮發(fā)性、半揮發(fā)性物質(zhì)。第30頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月3.6消化法——測定中藥制劑中的無機(jī)元素對樣品進(jìn)行有機(jī)破壞，常用于中藥制劑中重金屬的檢查。常用的破壞方法有濕法消化和干法消化法。濕法消化（強(qiáng)酸腐蝕）硝酸—高氯酸法：適用于血，尿、組織等生物樣品和含動植物藥制劑的破壞（對含氮雜環(huán)類有機(jī)物破壞不夠完全）。硝酸—硫酸法：與硫酸形成不溶性硫酸鹽的金屬離子的測定，不宜采有此法。硫酸—硫酸鹽法：常用于含砷或銻的有機(jī)樣品的破壞，破壞后得到三價(jià)砷或銻。

濕法消化所用的儀器，一般為硅玻璃或硼玻璃制成的凱氏瓶（直火加熱）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加熱）。所用試劑應(yīng)為優(yōu)級純，水應(yīng)為去離子水或高純水，同時(shí)必須按相同條件進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)校正。操作時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。第一節(jié)樣品的處理第31頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月

干法消化——高溫?zé)胱茖⒂袡C(jī)物灼燒灰化以達(dá)分解的目的，本法不適用于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等）有機(jī)樣品的破壞。常加無水Na2CO3或輕質(zhì)MgO等以助灰化。加熱灼燒時(shí)，控制溫度在420℃以下，以免某些被測金屬化合物的揮發(fā)。經(jīng)本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但此時(shí)切勿棄去。

第一節(jié)樣品的處理第32頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)常用含量測定方法化學(xué)分析法可見-紫外分光光度法薄層掃描法氣相色譜法高效液相色譜法毛細(xì)管電泳法原子吸收分光光度法第33頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)常用含量測定方法一、化學(xué)分析法以物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)的經(jīng)典分析方法?；瘜W(xué)分析法所用儀器簡單，結(jié)果準(zhǔn)確。主要用于測定制劑中含量較高的一些成分及含礦物藥制劑中的無機(jī)成分，如總生物堿類、總酸類、總皂苷及礦物藥制劑等?；瘜W(xué)分析法有一定的局限性，其靈敏度低，操作繁瑣、耗時(shí)長，專屬性不高，對于微量成分準(zhǔn)確性不理想。包括重量分析和滴定分析。第34頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)常用含量測定方法（一）重量分析法

重量法可分為揮發(fā)法、萃取法和沉淀法。1、揮發(fā)法又叫汽化或干燥法，可測定具有揮發(fā)性或能定量轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性物質(zhì)的組分含量。如：①供試品的干燥失重測定；②水分測定均屬揮發(fā)法；③中藥制劑分析中灰分及熾灼殘?jiān)臏y定等。

第35頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)常用含量測定方法2、萃取法

根據(jù)被測組分在互不相溶的兩相中溶解度的不同，達(dá)到分離的目的。如①冰硼散中冰片的含量測定；②地奧心血康膠囊中甾體總皂苷含量測定；③昆明山海棠片中總生物堿的含量測定；④甘草浸膏中甘草酸的含量測定即采用萃取法。

第36頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)常用含量測定方法3、沉淀法

將被測組分定量轉(zhuǎn)化為難溶化合物，以沉淀的形式從溶液中分離出來，經(jīng)濾過、洗滌、干燥、稱重，以稱量形式轉(zhuǎn)換測定其含量的方法，適用于制劑中純度較高的成分。如①西瓜霜潤喉片中西瓜霜的含量測定；②苦參片中苦參總堿的含量測定；③復(fù)方元胡注射液總堿的測定。

第37頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)常用含量測定方法（二）滴定分析法酸堿滴定法：測定生物堿、有機(jī)酸、內(nèi)酯類

沉淀滴定法：銀量法：生物堿的氫鹵酸鹽及有機(jī)鹵化物四苯硼鈉法：+生物堿→白色沉淀亞鐵氰化鉀法配位滴定法（EDTA法和硫氰酸銨法）：測定鞣質(zhì)、生物堿及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等礦物類制劑的含量氧化還原滴定法：酚類、糖類及礦物藥中Fe、As等第38頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)常用含量測定方法1、酸堿滴定法適用于測定中藥制劑中所含有的生物堿、有機(jī)酸、內(nèi)酯類等酸、堿組分的含量。直接滴定：對于K·C≥10-8的酸、堿組分，可在水溶液中直接滴定。如：止喘靈注射液中總生物堿的含量測定、顛茄酊中生物堿的含量測定。間接滴定或非水滴定法：弱有機(jī)酸、生物堿或水中溶解度很小的酸、堿。如大山楂丸中總酸性物質(zhì)的含量測定、草烏注射液中生物堿的含量測定等。第39頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)常用含量測定方法2、沉淀滴定法——以沉淀反應(yīng)為基礎(chǔ)沉淀滴定法必須滿足的條件：1.S小，且能定量完成；2.反應(yīng)速度大；3.有適當(dāng)指示劑指示終點(diǎn)；4.吸附現(xiàn)象不影響終點(diǎn)觀察。銀量法適用于測定中藥中無機(jī)鹵化物、有機(jī)氫鹵酸鹽及有機(jī)鹵化物四苯硼鈉法適用于測定生物堿的含量亞鐵氰化鉀法第40頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月3、氧化還原滴定法用于測定氧化還原性物質(zhì)，酚類、糖類、含F(xiàn)e、As的中藥制劑。包括碘量法、高錳酸鉀法和亞硝酸銀法4、配位滴定法用以測定鞣質(zhì)、生物堿及含Ca+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等礦物類制劑的含量。包括EDTA法和硫氰酸銨法。第41頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用實(shí)例：1、昆明山海棠片的含量測定——重量法2、復(fù)方陳香胃片的含量測定——滴定分析法3、柏子養(yǎng)心片的含量測定——滴定分析法第42頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月滴定度每1ml規(guī)定濃度的滴定液所相當(dāng)?shù)谋粶y藥物質(zhì)量。《中國藥典》用毫克（mg）表示。用碘量法測定維生素C的含量時(shí)，《中國藥典》規(guī)定：每1ml碘滴定液（0.05mol/L）相當(dāng)于8.806mg的維生素C（C2H8O6）第43頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月被測藥物滴定液滴定度計(jì)算用B來滴定A滴定液反應(yīng)的質(zhì)量被測藥物反應(yīng)的質(zhì)量被測藥物的摩爾質(zhì)量滴定液的摩爾質(zhì)量第44頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月滴定度計(jì)算用B來滴定A滴定液待測液等于1ml濃度乘體積=nB濃度mB第45頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月滴定度：單位體積（VB=1mL）的滴定液相當(dāng)于被測藥物的量，以T表示，量綱為mg/mL。m:滴定液的摩爾濃度（mol/L）a：被測藥物的摩爾數(shù)b：滴定劑的摩爾數(shù)M：被測物摩爾質(zhì)量（mg）第46頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月二、紫外-可見分光光度法根據(jù)物質(zhì)分子對200-760nm波長范圍的電磁波的吸收特征建立起來的光譜分析方法。該法靈敏度高，精度好和操作簡便。要求被測成分本身或其顯色產(chǎn)物對可見－紫外光具有選擇性吸收。？定量依據(jù)是Lambert-Beer定律？按測定波長數(shù)目不同分為單波長光譜法和多波長光譜法。第47頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第48頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第49頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第50頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第51頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第52頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第53頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第54頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第55頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）單波長分光光度法吸收系數(shù)法

A=ECL（百分吸收系數(shù)，單位g/100ml）朗伯-比爾定律：物質(zhì)對單色光吸收特性與濃度、液層厚度關(guān)系定律對照品比較法對照品溶液濃度應(yīng)與供試品濃度接近（100±10％）標(biāo)準(zhǔn)曲線法第56頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月三、薄層色譜掃描法

樣品經(jīng)薄層分離后，用一定波長的光掃描吸收紫外可見光的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)，用薄層色譜掃描儀（光密度計(jì)）測量被斑點(diǎn)反射或斑點(diǎn)發(fā)射的光束強(qiáng)度的變化而定量，可用于藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定。根據(jù)薄層掃描的測定方式分為薄層吸收掃描法和薄層熒光掃描法二種方法。第57頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月3.1、薄層吸收掃描法適用于在可見光區(qū)、紫外光區(qū)有吸收的物質(zhì)及通過色譜前或色譜后衍生成上述化合物的樣品組分。以鎢燈和氘燈為光源。在200-800nm波長范圍內(nèi)選擇合適波長測定。定量分析的理論依據(jù)

Kubelka-Munk曲線薄層是由許多細(xì)小顆粒組成的半透明物體，光照射到薄層表面，除透射光、反射光外，還有相當(dāng)多的散射光，因此與光照透明溶液不同，樣品量與測得值之間呈非線性關(guān)系，特別在高濃度區(qū)，這樣就給定量工作帶來困難，為此有以下三種途徑來解決薄層上的定量問題。一、基本原理第58頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月a

．選取曲線中的直線部分用于定量分析在低濃度范圍內(nèi)，樣品量與測得值間可存在線性關(guān)系，此法最簡便，也是在沒有線性化功能的薄層色譜儀上最常用的方法，但由于線性濃度范圍有限，故應(yīng)用上有一定限制b

.

Kubelka-Munk

方程

光照到散射物質(zhì)表面，光的行為比較復(fù)雜，Kubelka

及Munk

從理論上推導(dǎo)出簡化的方程式，現(xiàn)應(yīng)用于薄層掃描。散射參數(shù)（SX）SX=0（即薄層固定相無散射作用）時(shí)，A與KX呈線性關(guān)系，服從Beer定律。SX>0時(shí)，透射法的A值隨著SX增大而增大，而反射法的A值隨SX的增大而減小。第59頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月c．利用非線性方程定量利用計(jì)算機(jī)先求出非線性方程，然后在測定樣品時(shí)將測定值輸入計(jì)算機(jī)，由此方程求出樣品濃度。瑞士Camag公司的薄層掃描儀即根據(jù)此原理進(jìn)行測定，并認(rèn)為這種方法更為合理，測定值更準(zhǔn)確可靠。第60頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月3.2、薄層熒光掃描法基本原理：F=KC光源：氙燈或汞燈。靈敏度：最低可測到10-50pg。適用范圍：適合于本身具有熒光或經(jīng)過適當(dāng)處理后可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的測定。Kubelka-Munk理論不適用于薄層熒光掃描，無需進(jìn)行曲線校直。用薄層熒光掃描進(jìn)行定量分析時(shí)，用斑點(diǎn)熒光強(qiáng)度的積分值（色譜峰峰面積）與斑點(diǎn)中組分的含量代替上式中F與C進(jìn)行運(yùn)算。第61頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月薄層色譜的規(guī)范化操作1、儀器與材料①薄層板；②涂布器；③點(diǎn)樣器材；④展開箱（層析缸）⑤顯色與檢測儀器2、操作方法①薄層板的制備；②點(diǎn)樣；③展開；④檢測；第62頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第63頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第64頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第65頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第66頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第67頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第68頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第69頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第70頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第71頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月二、定量分析方法1、方法學(xué)考察新建薄層掃描定量方法必須進(jìn)行方法考察，以說明新建方法的可靠性，考察的內(nèi)容有工作曲線、定量結(jié)果的精密度及準(zhǔn)確度、統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)等內(nèi)容。工作曲線精密度考察準(zhǔn)確度考察分離度考察第72頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月適于用Kubelka-Munk曲線校直法進(jìn)行定量校準(zhǔn)的儀器①檢查所選擇的散射參數(shù)SX值是否適宜。SX值適宜則工作曲線被校為直線，否則，調(diào)整SX值再校正，直至工作曲線成直線為止。②考察工作曲線是否過原點(diǎn)，以確定采用一點(diǎn)法或二點(diǎn)法定量。③確定點(diǎn)樣量的線性范圍。即使采用曲線校直，也只是在一定點(diǎn)樣量范圍內(nèi)工作曲線為直線，因此需確定點(diǎn)樣量的上、下限。第73頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月精密度考察取同一供試品溶液，在同一塊薄層板上以相同點(diǎn)樣量平行點(diǎn)6點(diǎn)以上，展開后測定其峰面積，求算相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD），作為衡量定量分析結(jié)果精密度的指標(biāo)。RSD應(yīng)小于3.0%；需顯色后測定的RSD應(yīng)小于5.0%。

式中：為n次測量的平均值，S為標(biāo)準(zhǔn)差。第74頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月準(zhǔn)確度考察回收率是衡量定量方法準(zhǔn)確度的指標(biāo)，常用加樣回收率（R）來衡量，其值應(yīng)在95-105%之間，測量數(shù)據(jù)一般為5-6個(gè)。將加入純品的試樣溶液、供試品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)于同一塊薄層板上，展開后進(jìn)行薄層掃描，測定各斑點(diǎn)的峰面積，計(jì)算各溶液中組分的量，計(jì)算回收率（R）。第75頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月分離度考察分離度又稱分辨率,為了判斷物質(zhì)的分離情況,常用分離度作為分離效能指標(biāo).用R表示.R等于相鄰峰保留時(shí)間之差與兩峰峰寬均值之比。除規(guī)定外，R應(yīng)大于1.0。第76頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月2、定量方法

外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法、追加法及回歸曲線定量法外標(biāo)法：

方法簡便，但點(diǎn)樣必須準(zhǔn)確。①外標(biāo)一點(diǎn)法工作曲線通過原點(diǎn)（截距為零）時(shí)可用外標(biāo)一點(diǎn)法定量。只需點(diǎn)一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，與供試液同板展開，對比，測定組分含量，其計(jì)算公式為：C=F1·A式中：C為組分的重量或濃度，A為測得該組分的峰面積，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)。第77頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月②外標(biāo)二點(diǎn)法工作曲線不通過原點(diǎn)時(shí)，只能用外標(biāo)二點(diǎn)法定量，至少需點(diǎn)二種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（或一種濃度兩種點(diǎn)樣量），才能決定一直線,其計(jì)算公式為：C=F1A+F2式中：C、A同前，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)，F(xiàn)2為縱坐標(biāo)的截距，F(xiàn)1和F2值由儀器自動算出。第78頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月注意事項(xiàng)：點(diǎn)樣量必須準(zhǔn)確，宜用自動點(diǎn)樣儀或定量毛細(xì)管點(diǎn)樣。采用隨行標(biāo)準(zhǔn)法，即供試品與標(biāo)準(zhǔn)品交叉點(diǎn)在同一板上；為減小誤差，同一薄板上供試品點(diǎn)樣不得少于4個(gè)，對照品每一濃度不得少于2個(gè)；調(diào)整供試品與標(biāo)準(zhǔn)溶液的點(diǎn)樣量，使其峰面積相接近；第79頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)法：

內(nèi)標(biāo)法是選一個(gè)純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，并準(zhǔn)確稱取一定量內(nèi)標(biāo)物加至供試液及標(biāo)準(zhǔn)液中，計(jì)算供試品溶液中某組分含量的定量方法。內(nèi)標(biāo)物的選擇要求是：純度合乎要求，展開后不得有雜質(zhì)斑點(diǎn)，否則內(nèi)標(biāo)斑點(diǎn)的峰面積將不能代表內(nèi)標(biāo)物的量。內(nèi)標(biāo)物須為樣品中所不含有的成分。內(nèi)標(biāo)物不與其它斑點(diǎn)相重疊，分離度合乎要求。為簡化計(jì)算，內(nèi)標(biāo)物在標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試品溶液中的濃度應(yīng)相等。第80頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法：當(dāng)工作曲線通過原點(diǎn)時(shí)采用內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法。內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法公式：

工作曲線不通過原點(diǎn)時(shí)必須采用內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法公式：

式中：C、Cis分別為組分及內(nèi)標(biāo)物的濃度或重量，A、Ais分別為測得組分及內(nèi)標(biāo)物的峰面積，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)，F(xiàn)2為截距，F(xiàn)1和F2由儀器自動計(jì)算并內(nèi)存，可直接給出樣品的濃度或重量。特點(diǎn)：1.在一定點(diǎn)樣量范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)法定量準(zhǔn)確度與點(diǎn)樣量無關(guān)。2.不易找到適宜Rf值的純品內(nèi)標(biāo)物，且溶液配制等操作較麻煩。第81頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月回歸曲線定量法將不同濃度（或不同量）的標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試液點(diǎn)在同一塊薄層板上，展開、掃描;由計(jì)算機(jī)對所測得的峰面積及相應(yīng)點(diǎn)樣量進(jìn)行線性或非線性回歸;直接由回歸方程或回歸曲線計(jì)算供試液含量的方法;追加法（疊加法）影響薄層色譜分析的主要因素樣品的預(yù)處理及供試液的制備薄層色譜的點(diǎn)樣技術(shù)吸附劑的活性與相對濕度的影響溶劑蒸氣在薄層色譜中的作用溫度的影響第82頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第83頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第84頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月第85頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月氣相色譜法是以氣體為流動相的柱色譜分離分析方法。原理：氣相色譜是根據(jù)汽化后的試樣被載氣帶入色譜柱，由于各組分在兩相間作用不同，在色譜柱中移動有快慢，經(jīng)一定柱長后得到分離，依次被載氣帶入檢測器，將各組分濃度或質(zhì)量變化轉(zhuǎn)換成電信號變化記錄成色譜圖，利用色譜峰保留值進(jìn)行定性分析，利用峰面積或峰高進(jìn)行定量分析的方法。特點(diǎn)：分離效能高、選擇性好、靈敏度高，樣品用量少及分析速度快等特點(diǎn)，兼具分離、分析的功能。適用范圍：適用于熱穩(wěn)定性好的易揮發(fā)性或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)性組分的分析。四、氣相色譜第86頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月1、塔板理論將色譜柱的柱效用理論塔板數(shù)n或理論塔板高度H衡量，取決于區(qū)域?qū)挾龋é?、W1/2、W），其計(jì)算公式為n=

=5.54

=16

H=L/n

適中：tR為組分的保留時(shí)間，σ、W1/2、W分別為組分的標(biāo)準(zhǔn)差、半峰寬和基線寬度。四、氣相色譜第87頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月

若以調(diào)整保留時(shí)間tR’代替tR，則得到反映色譜柱實(shí)際柱效的有效理論塔板數(shù)neff。neff=

=5.54

=16

Heff=L/neff

可見，當(dāng)tR一定時(shí)，峰越窄，則H越小，n越大，柱效越高，分離性能越好。四、氣相色譜第88頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月2、速率理論速率理論研究了色譜過程中各種動力學(xué)因素對柱效（峰展寬）的影響，提出了VanDeemeter方程式：H=A+B/u+CuA、B/u、Cu分別為渦流擴(kuò)散項(xiàng)、分子擴(kuò)散（縱向擴(kuò)散）項(xiàng)、傳質(zhì)阻抗項(xiàng)，從而解釋了板高隨載氣流速而改變，且有最佳流速（Hmin）的現(xiàn)象。速率方程式對于色譜分離條件的選擇具有指導(dǎo)意義，它可以說明色譜柱的填充均勻程度、載體粒度、載氣種類、柱溫和固定液膜厚度對柱效、峰擴(kuò)張的影響。

四、氣相色譜第89頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月一、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)（1）色譜柱的理論板數(shù)n在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間tR和半峰寬Wh/2，按計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。若測得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、柱填充等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。

四、氣相色譜第90頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）分離度的計(jì)算分離度是衡量分離效果的指標(biāo)，以相鄰兩色譜峰峰尖距對峰寬均值的倍數(shù)表示，其定義式為：

兩峰基本分離，R≥1.5兩峰完全分離。

分離度的影響因素很多，可用基本分離方程式概括如下：a、b、c分別為柱效項(xiàng)，柱選擇性項(xiàng)和柱容量項(xiàng)。R==R=

abc四、氣相色譜第91頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月（3）重復(fù)性取各品種項(xiàng)下的對照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%，也可按各品種校正因子測定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣3次，計(jì)算平均校正因子，其相對平均偏差也應(yīng)不大于2.0%。

四、氣相色譜第92頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月式中，W0.05h為0.05峰高處的峰寬，d1為峰極大至峰前沿之間的距離，除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95-1.05之間。（4）拖尾因子T為保證測量精度，特別當(dāng)采用峰高法測量時(shí)，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子T是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定，或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計(jì)算公式為：T=四、氣相色譜第93頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實(shí)驗(yàn)條件的選擇1、固定相的選擇

1）氣—液色譜

①固定液：按極性相似、化學(xué)官能團(tuán)相似的相似性原則和主要差別選擇。

②載體：一般為適宜粒度，經(jīng)酸洗并硅烷化處理的硅藻土。

2）氣—固色譜：固定相大多采用高分子多孔微球（GDX），用于分離水及含羥基（醇）化合物。四、氣相色譜第94頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月2、柱溫的選擇選擇的基本原則：在使最難分離的組分有符合要求的分離度的前提下，盡可能采用較低柱溫，但以保留時(shí)間適宜及不拖尾為度。高沸點(diǎn)的樣品（沸點(diǎn)300-400℃），采用1-5%低固定液配比，柱溫200-250℃。沸點(diǎn)為200-300℃的樣品，采用5-10%固定液配比，柱溫150-180℃。沸點(diǎn)為100-200℃的樣品，采用10-15%固定液配比，柱溫選各組分的平均沸點(diǎn)2/3左右。氣體等低沸點(diǎn)樣品，采用15-25%高固定液配比，柱溫選沸點(diǎn)左右，在室溫或50℃下進(jìn)行分析。對于寬沸程樣品，需采用程序升溫方法進(jìn)行分析。但需注意的是柱溫要低于固定液的最高使用溫度。四、氣相色譜第95頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月3、載氣的選擇

主要從對峰展寬（柱效）、柱壓降和檢測器靈敏度的影響三方面考慮。N2是最常用的載氣；載氣流速較低時(shí)，宜用N2；流速高時(shí)，宜用H2、He；較長色譜柱，宜用H2作載氣；熱導(dǎo)檢測器應(yīng)選用H2、He；氫焰檢測器、電子捕獲檢測器，一般用N2；一般控制載氣流速高于其最佳流速。常用的載氣流速為20-80ml/min。四、氣相色譜第96頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月4、其他條件的選擇氣化室（進(jìn)樣口）溫度：樣品的沸點(diǎn)或稍高于沸點(diǎn)，不超過沸點(diǎn)50℃檢測室溫度100-300℃進(jìn)樣量在檢測器靈敏度足夠的前提下，盡量減少進(jìn)樣量，通常以塔板數(shù)下降10%作為最大允許進(jìn)樣量。5、檢測器熱導(dǎo)檢測器（TCD），氫焰離子化檢測器（FID），氮-磷檢測器（NPD），電子捕獲檢測器（ECD）四、氣相色譜第97頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月三、定量分析方法

氣相色譜常用的定量方法有內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法、歸一化法等。1、內(nèi)標(biāo)法——為最常用的定量方法優(yōu)點(diǎn)：可抵消儀器穩(wěn)定性差、進(jìn)樣量不夠準(zhǔn)確等原因所帶來的定量分析誤差；缺點(diǎn)：樣品的配制較麻煩，有些內(nèi)標(biāo)物不易尋找。關(guān)鍵：選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。適用范圍：①適用于樣品的所有組分不能全部流出色譜柱；②檢測器不能對每個(gè)組分都產(chǎn)生信號；③只需測定樣品中某幾個(gè)組分含量時(shí)的情況。內(nèi)標(biāo)物的選擇原則：①應(yīng)是樣品中不存在的純物質(zhì)。②加入量應(yīng)接近于被測成分。③其色譜峰應(yīng)位于被測成分色譜峰附近且與之完全分離。

四、氣相色譜第98頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月原理：選擇一內(nèi)標(biāo)物，將一定量的內(nèi)標(biāo)物加入到樣品中，根據(jù)試樣重量W和內(nèi)標(biāo)物重量Ws及待測組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積Ai、As，求出待測組分的含量。待測組分百分含量為：Ci%=

式中fi、fs分別為被測組分和內(nèi)標(biāo)的重量校正因子。四、氣相色譜第99頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)標(biāo)法加校正因子內(nèi)標(biāo)對比法內(nèi)標(biāo)工作曲線法Ai/As對C作圖四、氣相色譜第100頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月2、外標(biāo)法關(guān)鍵：①進(jìn)樣量準(zhǔn)確；②實(shí)驗(yàn)條件恒定。分類：1）工作曲線法：用一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，在完全相同條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣等體積的樣品溶液，計(jì)算其含量；2）外標(biāo)一點(diǎn)法：當(dāng)工作曲線截距為零時(shí)，可采用外標(biāo)一點(diǎn)法定量四、氣相色譜第101頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月②面積歸一化法計(jì)算：3、歸一化法關(guān)鍵：要求所有組分均要產(chǎn)生色譜峰。適用范圍：通常只能用于粗略考察供試品的雜質(zhì)含量，一般宜用于微量雜質(zhì)的含量檢查。①校正面積歸一化法測定各組分的含量。四、氣相色譜第102頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜高效液相色譜法（HPLC）是以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜的理論和實(shí)驗(yàn)方法。高壓輸送流動相，采用高效固定相及在線檢測等手段發(fā)展而來的分離分析方法，具有分離效能高、分析速度快及應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。適用范圍：適用于極性、非極性化合物，離子型化合物和高分子化合物的分離分析。如蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿、甾體、類脂、核酸、維生素及無機(jī)鹽類特點(diǎn)：流動相為液體，黏度大，柱溫低，擴(kuò)散系數(shù)很小第103頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜（一）HPLC實(shí)驗(yàn)條件的選擇1、色譜柱的選擇根據(jù)被分離物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性和溶解度等因素進(jìn)行選擇。①大多數(shù)藥物可用C18反相（ODS）柱加以分離測定；②也可選用正相分配色譜柱（氨基柱、氰基柱）或硅膠吸附色譜柱等；③解離藥物可用離子對色譜、離子抑制色譜或離子交換色譜分離測定；④脂溶性藥物異構(gòu)體的分離測定可采用硅膠吸附色譜柱。第104頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜2、流動相的選擇a/反相鍵合相色譜流動相常用溶劑適用范圍部分含水溶劑甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)用于分離中等極性、弱極性藥物非水溶劑乙腈-二氯甲烷、甲醇-四氫呋喃等用于分離疏水性物質(zhì)緩沖溶液三乙胺磷酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液用于可溶于水并具可解離特性的化合物第105頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜b/正相鍵合相色譜①常采用飽和烷烴（如正已烷）中加入一種極性較大的溶劑作為極性調(diào)節(jié)劑（如異丙醚），通過調(diào)節(jié)極性調(diào)節(jié)劑的濃度改變?nèi)軇?qiáng)度；②常采用二元以上的混合溶劑系統(tǒng)。

第106頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜3、洗脫方式等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動相的組成保持恒定，使所有組分的k值都處于這個(gè)范圍內(nèi)，適用于組分?jǐn)?shù)較少、性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動相的組成（如溶劑極性、離子強(qiáng)度和pH值等），適用于分析組分?jǐn)?shù)多、性質(zhì)相差較大的復(fù)雜混合物樣品，從而使所有組分都在適宜條件下獲得分離。

第107頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜電化學(xué)檢測器(ECD)用于能氧化、還原的有機(jī)物質(zhì)的檢測1×10-12g/ml適用生物胺、酚、羰基化合物、巰基化合物等示差折光檢測器(RID)①屬通用型檢測器,利用組分與流動相折射率之差進(jìn)行檢測.②穩(wěn)定性好,操作方便.③靈敏度低,受環(huán)境溫度、流動相組成等波動的影響大,不適合梯度洗脫10-8g/ml尤其適合于糖類的檢測化學(xué)發(fā)光檢測器(CLD)①高選擇性、高靈敏度的新型檢測器.②設(shè)備簡單,自身發(fā)光,無需光源,價(jià)格便宜Pg級(10-12)用于分析微量脂質(zhì)、核酸、生物胺等4、檢測器第108頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月檢測器特點(diǎn)最低檢測限適用范圍紫外檢測器（UV或UVD）分為:①可變波長型②二極管陣列檢測器①用于檢測有外吸收的物質(zhì);②靈敏度較高,噪音低,線性范圍寬,對流速和溫度波動不靈敏,可用于梯度洗脫.10-7-10-12g用于芳烴、稠環(huán)芳烴、芳香氨基酸、核酸、甾體激素、羰基和羧基化合物等熒光檢測器(FD)①用于能產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光的物質(zhì);②靈敏度高于紫外檢測器1×1010g/ml主要用于氨基酸、多環(huán)芳烴、維生素、甾體化合化物及酶等蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)①屬通用型檢測器,理論上可用于揮發(fā)性低于流動相的任何樣品組分;②檢測靈敏度較低,適用于流動相能揮發(fā)的色譜洗脫,不能用含緩沖鹽的流動相用于檢測糖、高分子子化合物、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等幾十類化合物第109頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月5、HPLC前處理（1）流動相的處理①溶劑的純化選擇專供色譜分析用的“色譜純”溶劑，分析純或優(yōu)級純?nèi)軇┰诤芏嗲闆r下也可滿足色譜分析的要求。由于不同的色譜柱和檢測方法對溶劑的要求不同，有時(shí)需進(jìn)行除去紫外雜質(zhì)、脫水、重蒸等純化操作。水一般采用石英系統(tǒng)二次蒸餾水。②流動相脫氣HPLC所用的流動相必須預(yù)先除去其中的空氣，習(xí)稱脫氣，一般在臨用前對流動相進(jìn)行脫氣五、高效液相色譜超聲波振蕩脫氣、惰性氣體（He）鼓泡吹掃抽真空加熱法第110頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜③過濾過濾是為了防止不溶物堵塞流路和色譜柱入口處的微孔墊片，因此應(yīng)預(yù)先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是過濾，采用0.45μm以下微孔濾膜過濾。濾膜分有機(jī)溶劑專用和水溶液專用兩種。第111頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜（2）樣品的處理

HPLC分析前需對樣品進(jìn)行預(yù)處理，以便將待測物質(zhì)有效地從樣品基質(zhì)中釋放出來，使樣品的形式及所用溶劑符合HPLC的要求。①待測組分的提取根據(jù)樣品成分及組分性質(zhì)選擇合適的提取方法和提取條件。②溶劑的揮發(fā)對于液體樣品或經(jīng)處理后得到的樣品溶液，若待測物的濃度在定量限以上，且溶劑對HPLC系統(tǒng)沒有干擾，可以直接進(jìn)樣分析。但很多情況下需除去溶劑，濃縮甚至干燥樣品，除去溶劑的方法有：自然揮散或在氮?dú)饬飨麓蹈?，適用于小體積樣品和揮發(fā)性溶劑；減壓蒸發(fā)，適用于熱不穩(wěn)定樣品；冷凍干燥，適用于受熱易分解破壞的樣品。③濾過樣品溶液進(jìn)樣前，需用濾膜抽濾或針頭濾器過濾，以有效除去樣品溶液中的懸浮物或部分大分子雜質(zhì)。第112頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜（3）緩沖液的處理——新鮮配置（二）HPLC系統(tǒng)適用性試驗(yàn)（三）HPLC法分類及方法其中液-液分配色譜是中藥制劑分析中應(yīng)用最廣泛的方法，根據(jù)固定相與流動相的極性差別，分為正相色譜和反相色譜兩類。正相色譜:流動相極性小于固定相極性的分配色譜法，主要用于極性物質(zhì)的分離測定；反相色譜:流動相極性大于固定相極性的分配色譜法，主要用于非極性、中等極性物質(zhì)的分離測定

第113頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜化學(xué)鍵合相是將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體上所形成的固定相。具有化學(xué)性能穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性好，一般在pH2-8范圍的溶液中不變質(zhì)，使用過程不流失，載樣量大，適于梯度洗脫等特點(diǎn)，已廣泛用于正相與反相色譜，離子抑制色譜，離子對色譜。

藥典中HPLC法所采用的固定相均為化學(xué)鍵合相。以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合相色譜法.

第114頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜（1）反相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法是現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛的方法，占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。反相色譜法一般采用非極性鍵合相，十八烷基鍵合相（簡稱ODS或C18）是最常用的非極性固定相，對于各種類型的化合物都有較強(qiáng)的適應(yīng)能力；流動相通常以水為基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量能與水互溶的極性調(diào)整劑，常用的有甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)。極性調(diào)整劑的性質(zhì)及其與水的混合比例對溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響，流動相的極性增大，洗脫能力降低，溶質(zhì)的k增大，tR增大；反之，k與tR減小。調(diào)整流動相的極性，可控制k值在所要求的范圍內(nèi)（k=1-10），對于結(jié)構(gòu)類似的組分，極性大的組分先出柱。

第115頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜（2）正相鍵合相色譜法主要用于分離分析溶于有機(jī)溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)。氰基（-CN）、氨基（-NH2）和二醇基（DIOL）鍵合相是正相色譜常用的極性鍵合相，流動相通常用烷烴（常用正已烷）加適量極性調(diào)整劑構(gòu)成。

第116頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜（3）離子對色譜法

直接將離子對試劑加入到流動相中，用以分離離子型或可離子化化合物的方法作為離子對色譜法（PIC或IPC）①基本原理:以C18或C8鍵合相為固定相，用含離子對試劑的有機(jī)溶媒-水溶液為流動相，用以分離離子型或可離子化化合物.②適用范圍:適用于有機(jī)酸、堿、鹽的分離;用離子交換色譜法無法分離的離子和非離子混合物的分離;在中藥制劑分析廣泛用于生物堿、有機(jī)酸的分析。③缺點(diǎn):離子對試劑價(jià)格比較貴.④分離條件的選擇:

離子對試劑的性質(zhì)和濃度、流動相的pH值及流動相中所含有機(jī)溶劑的種類與比例等。第117頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜a/離子對試劑的選擇通常所選用離子對試劑的電荷應(yīng)與試樣離子的電荷相反。

離子對試劑主要應(yīng)用對象1、季銨類（如四甲基、四丁基、十六烷基三甲基銨）強(qiáng)酸和弱酸（如磺酸染料、羧酸、磺胺類藥物、水溶性維生素）2、叔胺類（如三辛基胺）磺酸鹽等3、烷基磺酸鹽（如戊烷、已烷、庚烷、辛烷、十二烷基磺酸鹽）強(qiáng)堿和弱堿（如兒茶酚胺、罌粟堿、煙酰胺）4、高氯酸各種堿性物質(zhì)（如有機(jī)胺、肽）5、烷基硫酸鹽（如辛烷、十二烷基硫酸鹽）應(yīng)用對象同烷基磺酸鹽第118頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜反相離子對色譜法中流動相pH值的選擇原則樣品類型流動相PH值說明1、強(qiáng)酸（pKa<2）如磺酸染料2-7.4在整個(gè)pH范圍內(nèi)，樣品可離解，實(shí)際pH值的選擇取決于共存的其它組分類型。2、弱酸（pKa>2）如氨基酸、羧酸6-7.42-5樣品可離解，其k值取決于離子對的性質(zhì)樣品的離解被抑制，其k值取決于未離解樣品的性質(zhì)。3、強(qiáng)堿（pKa>8）如季銨類2-8同強(qiáng)酸4、弱堿（pKa<8）如兒茶酚胺6-7.42-5樣品的離解被抑制，其k值取決于未離解樣品的性質(zhì)樣品可離解，其k值取決于離子對的性質(zhì)。b/流動相pH值的控制第119頁，課件共133頁，創(chuàng)作于2023年2月五、高效液相色譜c/有機(jī)溶劑的選擇

反相離子對色譜法中，甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)是最常用的流動相，流動相中所含有機(jī)溶劑的比例越高，組分的k值越小。一般而言，樣品組分的疏水性及離子對試劑的疏水性越強(qiáng)，所需有機(jī)溶劑的比例越高。第1