山東大學(xué)細(xì)胞第二十章課件

第二十章細(xì)胞工程

生物工程：通過(guò)技術(shù)手段，利用生物體或生物過(guò)程生產(chǎn)有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)品的學(xué)科。1．細(xì)胞培養(yǎng)1962年開(kāi)始，用于生物醫(yī)學(xué)研究，生產(chǎn)酶制劑，生長(zhǎng)因子，疫苗，單抗等2．細(xì)胞融合3.細(xì)胞拆合4.哺乳動(dòng)物胚胎培養(yǎng)和胚胎移植5．轉(zhuǎn)基因技術(shù)：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；轉(zhuǎn)基因植物6．哺乳動(dòng)物克隆技術(shù)：動(dòng)物克?。患?xì)胞克隆細(xì)胞工程的主要技術(shù)領(lǐng)域：1．細(xì)胞培養(yǎng)

植物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)無(wú)性繁殖消除病害種質(zhì)保存合成次生代謝物動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)血清、無(wú)血清Vero細(xì)胞和狂犬病毒的培養(yǎng)工藝DMEM培養(yǎng)基胎牛血清其他成分錐形瓶逐級(jí)放大培養(yǎng)加堿（碳酸氫鈉）加糖（葡萄糖）灌注培養(yǎng)液微載體5L種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)液50L生物反應(yīng)器接種狂犬病毒出液口收獲病毒2．細(xì)胞融合兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。單克隆抗體融合：B淋巴細(xì)胞+骨髓瘤細(xì)胞篩選：HAT選擇培養(yǎng)液，HGPRT-、TK-骨髓瘤細(xì)胞株單克隆抗體

1975年英國(guó)科學(xué)家Milstein和Kohler將產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞同腫瘤細(xì)胞融合，成功建立了單克隆抗體技術(shù)，而獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。

每個(gè)B淋巴細(xì)胞僅專(zhuān)一地產(chǎn)生、分泌一種針對(duì)某種抗原決定簇的特異性抗體，而腫瘤細(xì)胞可以無(wú)限增殖，因此雜交瘤細(xì)胞可在體外培養(yǎng)或移植到體內(nèi)條件下分泌大量單克隆抗體。

單克隆抗體技術(shù)的最主要優(yōu)點(diǎn)是可以用不純的抗原分子大量制備純一的單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生單克隆抗體示意圖HAT系次黃嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidin）三種物質(zhì)各英文首字之綴列，HAT培養(yǎng)基也就是指含有這三種物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基。3．細(xì)胞拆合細(xì)胞拆合：把細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，然后把不同來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核相互配合，形成核質(zhì)雜交細(xì)胞。方法：（1）物理法：微玻璃針、紫外線、激光。（2）化學(xué)法：細(xì)胞松弛素B處理，并結(jié)合離心技術(shù)，將細(xì)胞拆分為核體（karyoplast）或稱(chēng)小細(xì)胞（minicell）和胞質(zhì)體（cytoplast）4．哺乳動(dòng)物胚胎培養(yǎng)和胚胎移植（1）胚胎培養(yǎng)。體外受精。（2）胚胎移植。（3）嵌合體。（4）胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell,ES細(xì)胞）—早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離來(lái)的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的全能或多能細(xì)胞。ES細(xì)胞的特點(diǎn)：A：具有全能性或多能性；B：可在體外擴(kuò)增、進(jìn)行遺傳操作，而不失去其全能性。C：在條件培養(yǎng)基或飼養(yǎng)層細(xì)胞上，才處于未分化狀態(tài)。ES細(xì)胞的主要應(yīng)用：A：制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。B：基因打靶或稱(chēng)基因敲除。C：克隆細(xì)胞和組織干細(xì)胞工程

干細(xì)胞定義現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物的許多已分化組織和器官中都保留了一些能夠分裂形成該組織或器官的未分化原始細(xì)胞，這些細(xì)胞稱(chēng)為干細(xì)胞。干細(xì)胞形態(tài)特征：圓形，橢圓型，體積小，核質(zhì)比大，具有較強(qiáng)的端粒酶活性，因此具有較強(qiáng)增殖能力。

干細(xì)胞增殖特性緩慢性，自穩(wěn)性干細(xì)胞分類(lèi)人體干細(xì)胞基本分為三種類(lèi)型：全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和專(zhuān)能干細(xì)胞?！じ杉?xì)胞分化模式·胚胎干細(xì)胞(embryostemcell)：具有分化成多種細(xì)胞類(lèi)型及構(gòu)建組織的潛能?！ぴ煅杉?xì)胞

·單能干細(xì)胞（monopotentialcell）體內(nèi)干細(xì)胞的意義在于源源不斷地補(bǔ)充體內(nèi)一些短命組織的細(xì)胞來(lái)源，如血液細(xì)胞、皮膚細(xì)胞以及精巢等，或者組織或器官受到局部損傷時(shí)，它們可以再分裂形成新的該組織和器官，是體內(nèi)的一種自我修復(fù)機(jī)制。人類(lèi)干細(xì)胞工程就是利用人體內(nèi)干細(xì)胞的特征來(lái)達(dá)到體外產(chǎn)生人類(lèi)所需的產(chǎn)物的探索。主要用于器官修復(fù)，基因治療等。5.轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因植物6．哺乳動(dòng)物克隆技術(shù)克隆動(dòng)物在畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用：（1）良種家蓄的培育；（2）研究藥理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；（3）保護(hù)瀕危動(dòng)物；（4）提供治療疾病的組織器官；（5）與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)結(jié)合，提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)效率。動(dòng)物克隆

生物繁殖后代通常是以精、卵細(xì)胞結(jié)合的有性生殖方式進(jìn)行。通過(guò)營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞繁殖個(gè)體的方法稱(chēng)為無(wú)性繁殖?？寺∈侵鸽x體條件下的無(wú)性繁殖。1981年Illmenses

率先報(bào)告用小鼠幼胚細(xì)胞核克隆出正常小鼠。隨后，1984年Willadsen用未成熟羊胚細(xì)胞核克隆出一頭羊。

英國(guó)PPI生物技術(shù)的羅斯林（Roslin）研究所的維爾穆特(Wilmut)博士1997年2月27日在世界著名權(quán)威雜志《Nature》宣布的用乳腺細(xì)胞的細(xì)胞核克隆出一只綿羊“

多莉

(Dolly)”的消息?！岸嗬颉钡恼Q生，既說(shuō)明了體細(xì)胞核的遺傳全能性，也翻開(kāi)了人類(lèi)以體細(xì)胞核競(jìng)相克隆哺乳動(dòng)物的新篇章。此項(xiàng)技術(shù)因而榮登美國(guó)《Science》周刊評(píng)出的1997年十大科學(xué)發(fā)現(xiàn)

的榜首。

綿羊B乳腺細(xì)胞核易核卵融合卵綿羊C子宮多莉植入植入生產(chǎn)克隆多莉羊示意圖取出未受精卵去核電激體外胚胎發(fā)育綿羊A多莉克隆猴

(1)遺傳素質(zhì)完全一致的克隆動(dòng)物將更有利于開(kāi)展對(duì)動(dòng)物(人)生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和健康等機(jī)理的研究；

(2)有利于大量培養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)良的家畜;(3)經(jīng)轉(zhuǎn)基因的克隆哺乳動(dòng)物，將能為人類(lèi)提供源源不斷的廉價(jià)的藥品、保健品以及較易被人體接受的移植器官；

(4)科學(xué)家將很快地從目前的同種克隆技術(shù)推進(jìn)到異種克隆,即借腹懷胎的新領(lǐng)域,這無(wú)疑將大大促進(jìn)對(duì)瀕臨滅種的哺乳動(dòng)物的保護(hù)工作。

克隆技術(shù)將對(duì)21世紀(jì)產(chǎn)生的重大影響植物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程，就是進(jìn)行物種改良，選育優(yōu)良作物品種，增加植物的優(yōu)良性狀，利用植物生產(chǎn)各種化學(xué)制品，還可用于保留瀕危滅絕和有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物物種。植物細(xì)胞工程技術(shù)：

一、快速繁殖技術(shù)

通過(guò)植物體細(xì)胞胚胎再生成一完整植株。這種技術(shù)主要用于花卉、樹(shù)木、蔬菜、果樹(shù)、中草藥和農(nóng)作物的快速繁殖。

二、誘導(dǎo)增加或減少植物體內(nèi)染色體組數(shù)的技術(shù)

有些植株的染色體比正常細(xì)胞少一半（單倍體），而有些經(jīng)誘導(dǎo)后染色體加倍（多倍體）。單倍體對(duì)植物品種的改良很有利；多倍體產(chǎn)量高，為不同倍性植物間的雜交提供了遺傳保證。

三、體細(xì)胞雜交技術(shù)

利用自然或人工方法使兩個(gè)工幾個(gè)不同細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞，形成體細(xì)胞雜種。

四、植物細(xì)胞應(yīng)用生產(chǎn)技術(shù)

利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，給植物細(xì)胞提供最適宜的生活環(huán)境，讓它們進(jìn)行無(wú)性繁殖，大量地培養(yǎng)成植株，解決天然資源的不足。一.植物組織培養(yǎng)

外植體愈傷組織新植株進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，一般要經(jīng)歷以下五個(gè)階段：

1外植體的選擇及培養(yǎng)。

2誘導(dǎo)去分化階段。

3繼代增殖階段。

4誘導(dǎo)分化生根成芽階段。

5移栽成活階段。

植物細(xì)胞培養(yǎng)定義在離體條件下，將愈傷組織活則其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過(guò)繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖，從而獲得大量的細(xì)胞群體的一種技術(shù)。二.植物細(xì)胞培養(yǎng)

工業(yè)化植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)主要有兩大類(lèi)：

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

三.植物細(xì)胞雜交（細(xì)胞融合）

1960年英國(guó)諾丁漢大學(xué)Cocking教授領(lǐng)導(dǎo)的小組率先利用真菌纖維素酶，成功地制備出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根細(xì)胞原生質(zhì)體,開(kāi)辟了原生質(zhì)體融合研究的新階段。

植物細(xì)胞雜交的主要過(guò)程如下：

1.原生質(zhì)體的制備。

2.原生質(zhì)體的融合

。

3.雜合體的鑒別與篩選

。細(xì)胞育種

誘導(dǎo)突變，篩選新品系、新品種

次生代謝產(chǎn)物生成

從培養(yǎng)的植物細(xì)胞中提取所需的代謝產(chǎn)物。

優(yōu)點(diǎn)

比栽培原料作物更易控制最佳生產(chǎn)條件；

培養(yǎng)物為無(wú)菌、無(wú)蟲(chóng)材料，能保證產(chǎn)品質(zhì)量；

工藝操作較為簡(jiǎn)單，可減少勞動(dòng)費(fèi)用，提高生產(chǎn)率。植物細(xì)胞工程的應(yīng)用PERSPECTIVESfortheFutureAdvancesinthecultureofhumancellswillallowthemtobeappliedtothetreatmentofdiseaseandinjury.Eventoday,severeburnpatientscanbetreatedbyremovingsomeoftheirundamagedskin,culturingthefibroblasts,andapplyingthemtoareaswheretheskinhasbeendestroyed.AsspecificgrowthfactorsforvariouscelltypesareidentifiedandexpressedinsufficientquantitiesbyrecombinantDNAtechniques,othercelltypeswillbeculturedandusedtherapeutically.Inthenottoodistantfuture,safeandeffectiveviralvectorswilllikelybedevelopedtodeliver