PCR引物設(shè)計(jì)-課件

PCR引物設(shè)計(jì)1PPT課件PCR引物設(shè)計(jì)PCR的基本原理PCR引物設(shè)計(jì)的基本原則常用PCR引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0介紹2PPT課件

PCR的基本原理

3PPT課件引物引物的概念

引物是一段寡聚核苷酸序列，它是PCR特異反應(yīng)的關(guān)鍵。引物的種類(lèi)

PCR引物測(cè)序引物雜交探針簡(jiǎn)并引物其他引物引物的作用

基因獲得，測(cè)序以及檢測(cè)等。4PPT課件引物設(shè)計(jì)的原則三條最基本的原則：引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。5PPT課件主要影響因素引物長(zhǎng)度產(chǎn)物長(zhǎng)度序列Tm值引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性形成引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值在錯(cuò)配位點(diǎn)的引發(fā)效率引物及產(chǎn)物的GC含量6PPT課件引物設(shè)計(jì)的要點(diǎn)引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。引物長(zhǎng)度一般在15-30bp之間，常用的是18-27bp，不應(yīng)超過(guò)38bp。

引物過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。引物G+C的含量在40%-60%之間，Tm值最好接近72℃。

上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)；有效啟動(dòng)溫度，即退火溫度，一般低于Tm值5-10℃；引物3'端要避開(kāi)密碼子的第3位。

密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性和效率。7PPT課件引物3'端不能選擇A。3'錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在差異：A>G,C>T,所以避開(kāi)A而選擇T。ATCG在引物中要隨機(jī)分布。

可以降低引物與模板的相似性，從而減少錯(cuò)誤引發(fā)。引物自身以及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。防止形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體引物5'端和中間△G值應(yīng)該相對(duì)較高，3'端△G值應(yīng)該相對(duì)較低。△G值越高，雙鏈越穩(wěn)定，但容易在3'錯(cuò)配位置形成雙鏈結(jié)構(gòu)引發(fā)DNA聚合。引物的5'端可以修飾，3'端不可以修飾。

引物5'決定PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，對(duì)特異性影響不大。8PPT課件擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)是造成引物無(wú)效的主要原因，設(shè)計(jì)引物時(shí)一定要避開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)域。引物應(yīng)具有特異性

引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行Blast檢測(cè)，如果與其他基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)了。

當(dāng)然，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一，有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或者偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物，用作克隆目的的PCR，由于片段相對(duì)固定，其引物設(shè)計(jì)的自由度較低，所以這時(shí)候，只要盡量滿(mǎn)足這些條件就可以了。9PPT課件酶切位點(diǎn)的添加引物設(shè)計(jì)時(shí)計(jì)算Tm值，退火溫度以及GC含量時(shí)，不用把酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基計(jì)算在內(nèi)。兩個(gè)位點(diǎn)應(yīng)是載體上的，所連接的片段上沒(méi)有這兩個(gè)位點(diǎn)，且距離不能太近，否則兩個(gè)酶都切不好。兩個(gè)酶切位點(diǎn)最好不是同尾酶，否則酶切效果相當(dāng)于單酶切。最好使用酶切效率高的酶，雙酶切使用的酶最好有共同的Buffer。酶切位點(diǎn)需要保護(hù)性堿基，以利于內(nèi)切酶的切割。設(shè)計(jì)時(shí)酶切位點(diǎn)應(yīng)位于引物5'頂端。10PPT課件PCR設(shè)計(jì)引物時(shí)酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基表（例）

11PPT課件PrimerPremier5.0應(yīng)用簡(jiǎn)介12PPT課件PrimerPrimer5.0引物設(shè)計(jì)功能限制性酶切位點(diǎn)分析功能

蛋白模體基元和活性位點(diǎn)分析功能同源性分析和DNA與蛋白質(zhì)序列的互換

13PPT課件使用步驟及技巧LoadsequencePreimerPremier啟動(dòng)界面14PPT課件引物設(shè)計(jì)功能15PPT課件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，點(diǎn)擊按鈕，界面如下：16PPT課件進(jìn)一步點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)“searchcriteria”窗口，有多種參數(shù)可以調(diào)整。17PPT課件引物類(lèi)型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長(zhǎng)度選擇方式參數(shù)選擇參數(shù)選擇，一般選擇默認(rèn)，點(diǎn)擊，隨之出現(xiàn)的SearchProgress窗口顯示SearchComplete時(shí)，再按。18PPT課件默認(rèn)成對(duì)（pairs）顯示，共找到100對(duì)引物，并按照優(yōu)劣次序（Rating）排列，滿(mǎn)分100分，即各項(xiàng)指標(biāo)基本都達(dá)標(biāo)。點(diǎn)擊其中一對(duì)引物，例如第1對(duì)，并挪開(kāi)或退出該窗口，顯示“primerprimer5”主窗口，如下：19PPT課件產(chǎn)物以及模板位置引物性質(zhì)四種重要指標(biāo)的分析最佳退火溫度可供參考20PPT課件一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在四種指標(biāo)中的任何一種，因此最好的情況是最下面的分析欄里沒(méi)有，只有。但是，通常情況下，會(huì)出現(xiàn)這種情況：此時(shí)，就需要對(duì)引物進(jìn)行編輯，點(diǎn)擊21PPT課件EdithereAnalysistheresultaftereditingAccepttheeditresultReturntothemainwindow22PPT課件ResultsReport23PPT課件其他功能24PPT課件限制性?xún)?nèi)切酶分析25PPT課件Meltingtemperaturegraph26PPT課件GC%graph27PPT課件Stability28PPT課件Primer-blast引物驗(yàn)證/tools/primer-blast/29PPT課件在“PCRTemplate”下面的文本框，輸入目標(biāo)模板的序列，F(xiàn)ASTA格式或直接用AccessionNumber。如果你在這里輸入了序列，是用于引物的設(shè)計(jì)。如果你已經(jīng)設(shè)計(jì)好了引物，可在Primer