細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)課堂第九講細(xì)胞培養(yǎng)總結(jié)課件-002

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)課堂PPT第九講細(xì)胞培養(yǎng)總結(jié)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)課堂PPT第九講細(xì)胞培養(yǎng)總結(jié)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)課堂PPT第九講細(xì)胞培養(yǎng)總結(jié)（一）細(xì)胞培養(yǎng)所用制品的清洗與消毒在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都非常敏感，這些物質(zhì)若有殘留，會(huì)影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細(xì)胞殘留物非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品玻璃器皿的清洗膠塞的清洗塑料制品的清洗2021/1/52（二）細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或超純水

1：水2：細(xì)胞培養(yǎng)基市場(chǎng)上可提供干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640、高糖DMEM、低糖DMEM、F12等2021/1/53細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考：

建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時(shí)咨詢。其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基。用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，可以用生長(zhǎng)曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。2021/1/543：血清熱滅活：56℃,30分鐘加熱已完全解凍的血清

—熱滅活目的：滅活血清中的補(bǔ)體成分。

—

適用于細(xì)胞因子和免疫相關(guān)實(shí)驗(yàn)，否則建議血清不要滅活。因?yàn)闊崽幚頃?huì)造成血清沉淀物顯著增多，還會(huì)影響血清的質(zhì)量。滅活后有時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞生長(zhǎng)速度，且細(xì)胞貼壁率降低。血清中的沉淀物絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm，5分鐘去除，也可不用處理；顯微鏡下“小黑點(diǎn)”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號(hào)的血清。2021/1/554:平衡鹽液體組織細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體，可以維持滲透壓、調(diào)節(jié)pH值、供給細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)離子成分用于洗滌組織、細(xì)胞等KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNa2CO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01g

D-Hanks’平衡鹽溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)2021/1/56PBS（Phosphate-BufferedSallines）KCl0.20gKH2PO40.20gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16gDPBS（Dulbecco’sPhosphate-BufferedSallines）標(biāo)準(zhǔn)型CaCl2(anhyd.)(無水氯化鈣)0.10gKCl0.20gKH2PO40.20gMgCl2·6H2O0.10gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16g2021/1/575：消化液分離組織和分散細(xì)胞常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液?jiǎn)为?dú)或混合使用2021/1/586：pH調(diào)整液NaHCO3溶液常用濃度為7.5%。配制時(shí)用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存HEPES（分子量238.31）溶液羥乙基哌秦乙硫磺酸，一種弱酸，無細(xì)胞毒性主要作用：防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右。HEPES配制使用終濃度一般為10-50mmol/L常配成1M儲(chǔ)存液：用20ml雙蒸水溶解4.76克HEPES，過濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保存。使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入2mlHEPES儲(chǔ)存液，終濃度為20mmol/L2021/1/597：谷氨酰胺補(bǔ)充液谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時(shí)，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，臨用前加入培養(yǎng)液中；使用終濃度為1–4mmol/L配制方法：一般配制為100倍儲(chǔ)存液，濃度200mmol/L（29.22g/L）谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫30℃），過濾除菌，分裝，-20℃保存；使用時(shí)向100ml培養(yǎng)液中加入0.5–2ml儲(chǔ)存液，終濃度為1–4mmol/L2021/1/5108：酚紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH指示橙紅色表示中性pH，黃色代表酸性pH，紫紅色表示堿性pH在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅因?yàn)橐延幸恍┭芯勘砻鳎悍蛹t能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用2021/1/5119：抗生素溶液抗生素使用種類與濃度：

工作濃度儲(chǔ)存溫度殺滅細(xì)菌

penicillin(青霉素)100U/ml-20℃G(+)

streptomycin(鏈霉素)100ug/ml-20℃G(+),G(-)

gentamicin(慶大霉素)50ug/ml-20℃G(+),G(-),支原體

amphotericinB(兩性霉素B)2.5ug/ml-20℃真菌

nystatin(制霉菌素)50ug/ml-20℃真菌

2021/1/512（三）、器材和液體的準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)用的玻璃器材培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，160℃，2小時(shí)干烤滅菌后備用手術(shù)器材、瓶塞、配制好的PBS液15磅，121℃，20分鐘蒸氣滅菌培養(yǎng)液、小牛血清、消化液抽濾后備用

2021/1/513冷凍保存細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇要點(diǎn)快速解凍凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3分鐘）；用80g離心2－3分鐘，棄上清液；用5－10ml新鮮完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞團(tuán)，并計(jì)數(shù)細(xì)胞；接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度為3×105/ml；24小時(shí)后去除未貼壁的細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)。2021/1/514二、細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)2021/1/515原代培養(yǎng)——1.植塊法培養(yǎng)2021/1/516原代培養(yǎng)

——2.酶解組織

消化、接種培養(yǎng)2021/1/517原代細(xì)胞植塊培養(yǎng)細(xì)胞接種后一般幾小時(shí)內(nèi)就能貼壁，并開始生長(zhǎng)如接種的細(xì)胞密度適宜，5天到一周即可形成單層2021/1/518貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法2021/1/519傳代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果傳代細(xì)胞培養(yǎng)2021/1/520二、細(xì)胞增殖檢測(cè)2021/1/521（一）、細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定

。計(jì)數(shù)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，分別數(shù)出四角的四個(gè)大鉻（每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻）中死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)。計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度

細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)/ml＝

（四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4）×稀釋倍數(shù)×104公式中說明：除以4表示4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)平均；乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每個(gè)大格體積：長(zhǎng)1.0mm×寬1.0mm×高0.1mm＝0.1mm3

；（

1ml＝103mm3）2021/1/5222021/1/523細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)和活力測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果2021/1/524（二）、CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果2021/1/5251123456789101112A0.1820.0660.0490.0490.050.050.050.0510.0520.0510.0520.051450B0.0512.5262.6232.6312.6812.7092.6532.6082.8410.0510.0510.05450C0.052.4982.62.5452.5652.5212.5982.4662.4490.0510.0510.049450D0.0512.6322.6812.6812.6112.4842.4382.5452.5020.0610.0520.057450E0.0512.6522.6612.6172.4482.5792.6412.6652.620.050.0510.049450F0.052.6252.642.5662.5972.6182.7322.8212.4740.050.050.05450G0.0512.7362.6312.632.7242.812.8182.8682.830.0490.0510.051450H0.050.0510.0540.0520.0550.050.050.0550.0520.0490.0490.0494501-11-24-14-22-12-23-13-22.3442.4412.4492.4992.5272.4712.4262.6592.3162.4182.3632.3832.3392.4162.2842.2672.452.4992.4992.4292.3022.2562.3632.322.472.4792.4352.2662.3972.4592.4832.4382.4432.4582.3842.4152.4362.552.6392.2922.5542.4492.4482.5422.6282.6362.6862.6482021/1/52621234567101112A0.2150.0420.0530.0430.0420.0420.0410.0420.0430.042450B0.0421.9792.1532.2642.3372.4072.3362.5092.4540.042450C0.0422.0852.1652.2812.3892.2572.5342.3592.4510.04450D0.0452.0961.8452.4982.4452.4232.4552.5272.4290.042450E0.072.261.5282.3832.4051.8512.1462.3932.3870.044450F0.0412.221.6672.462.31.4692.2772.3742.4130.043450G0.0452.3231.872.5382.3041.7032.3812.4252.2120.053450H0.0420.0440.0440.0460.040.0430.0420.0410.0440.0434506-16-27-17-28-18-25-15-21.7641.9382.0492.1222.1922.1212.2942.2391.871.952.0662.1742.0422.3192.1442.2361.8811.632.2832.232.2082.242.3122.2142.0451.3132.1682.191.6361.9312.1782.1722.0051.4522.2452.0851.2542.0622.1592.1982.1081.6552.3232.0891.4882.1662.211.9972021/1/527（三）、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期2021/1/528（四）、細(xì)胞分裂指數(shù)測(cè)定2021/1/529（五）、EDU或BRDU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)2021/1/530二、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)檢測(cè)2021/1/531（一）、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)2021/1/532（二）、TRANS-WELL實(shí)驗(yàn)12021/1/533（二）、TRANS-WELL實(shí)驗(yàn)22021/1/534二、細(xì)胞凋亡檢測(cè)2021/1/535流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡2021/1/536三、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染2021/1/537Transfectionofeukaryoticcells2021/1/538TransfectionWhatisTransfection? TransfectionisamethodoftransportingDNA,RNAand/orvariousmacromoleculesintoaneukaryoticcellbyusingchemical,lipidorphysicalbasedmethods.Methods:(justafewexamples…)

Method

ApplicationCaPO4,DEAEDNATransfectionLiposomeBasedDNATransfectionPolyamineBasedDNATransfection2021/1/539Purpose/usesofTransfectionStudygenefunctionStudyproteinexpressionTransferDNAintoembryonicstemcells2021/1/540HowitworksUtilizeChemical,lipidorphysicalmethods(directmicroinjection,electroporation,biolisticparticledelivery)fortransportationofgeneticmaterialsormacromolecules.2021/1/541Howitworks–ChemicalandlipidmethodsNeutralizenegativechargesonDNAChemicalmethod:Calciumphosphate;createsprecipitatesthatsettleoncellsandaretakenin.LipidorPolymermethods:interactwithDNA,promotesbindingtocellsanduptakeviaendocytosis.2021/1/5422021/1/543Howitworks–PhysicalmethodsElectroporation:useofhighvoltagetodelivernucleicacids;poresareformedoncellmembrane.DirectMicroinjection:Useofafineneedle.HasbeenusedfortransferofDNAintoembryonicstemcells.BiolisticParticledelivery:Useshigh-velocityfordeliveryofnucleicacidsandpenetrationofcellwall.2021/1/5442021/1/545Experimentalmethod/process

(chemicalmethods)

HBS=HEPES-BufferedSaline2021/1/546Advantages/DisadvantagesAdvantages:Providestheabilitytotransferinnegativelychargedmoleculesintocellswithanegativelychargedmembrane.Liposome-mediatedtransportofDNAhashighefficiency.Goodforlong-termstudiesrequiringincorporationofgeneticmaterialintothechromosome.Disadvantages:ChemicalReagents:notusefulforlong-termstudies.Transfectionefficiencyisdependentoncellhealth,DNAquality,DNAquantity,confluency(40-80%)DirectMicroinjectionandBiolisticParticledeliveryisanexpensiveandattimesadifficultmethod.2021/1/547脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白質(zhì)粒結(jié)果Invitrogen陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染指南2021/1/548脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白融合的目標(biāo)基因表達(dá)定位在胞質(zhì)2021/1/549四、流式細(xì)胞術(shù)2021/1/550InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluidFlowcytometry流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,簡(jiǎn)稱FCM）2021/1/551FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)2021/1/552

DataProcessingFL2FL1SSCFSCFL4FL32021/1/553基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分選綠色螢光蛋白分析（GFP）：左圖顯示Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染了減毒Mengo病毒vM16，其中含轉(zhuǎn)染后8小時(shí)與病毒L肽鏈融合的GFP。直方圖顯示59％細(xì)胞表達(dá)該肽鏈，并顯示不同的表達(dá)水平。重疊的紅線表示陰性對(duì)照。2021/1/554WhatcanFlowCytometertellusaboutacell?CellLineage/SubsetPhenotypeCytokine/ChemokineProductionRepertoireCytokine/ChemokineReceptorRepertoireMigration/HomingPhenotypreCellcyclestatus2021/1/555細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量染色體分析細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體細(xì)胞凋亡在上述信號(hào)基礎(chǔ)上的細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞學(xué)應(yīng)用2021/1/556直接染色FluorescentprobeattachedtoantibodySpecificsignal:weakNonspecificbinding:low2021/1/557間接染色Fluorescentprobeattachedtoa2ndantibodySpecificsignal:strong,5-62ndAb/each1stAb;Nonspecificbinding:high2021/1/558Avidin-BiotinmethodIbiotinylatedprimaryAbbiotinavidinbiotinylateddye2021/1/559PropidiumIodideDNAExcitationEmisson300nm400nm500nm600nmFluorescein(FITC)500nmWavelengthProtein300nm400nm500nm600nmExcitationEmissonPhycoerytherin(PE)ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nmProteinAllophycocyanin(APC)ProteinExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm632.5nm(HeNe)2021/1/560CellsCycles細(xì)胞內(nèi)DNA含量增殖相關(guān)基因的表達(dá)BrdU的結(jié)合示蹤染料2021/1/561G2MG0G1s0

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle

2021/1/562AtypicalDNAHistogramG0-G1SG2-MFluorescenceIntensity#ofEvents2021/1/563紅色為正常二倍體細(xì)胞；黃色為異倍體細(xì)胞2021/1/564

增殖相關(guān)基因PCNA(Proliferatingcellnuclearantigen)

一種蛋白質(zhì)，在DNA復(fù)制和核苷酸的切除修復(fù)中起到作用Ki-67-proliferationrelatedantigenKi-S1-proliferationrelated