生物大分子提取技術-課件

1ppt課件桂花贊幾度風雨一場涼人間迎來桂花芳銀桂周身亮繁星丹桂濃妝新嫁娘枝頭鳥雀絮絮贊樹下騷客搜枯腸清風淡云圓月下乾坤萬里共清香2ppt課件生物大分子分離純化的意義①生命科學研究的需要：從生物材料中分離制備核酸、蛋白質，研究其結構與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質有重大意義。②醫(yī)學檢驗需要：是分析標本中包含的分子信息的前提條件，對于精確診斷疾病具有重要意義。③醫(yī)療實踐的需要：如用胰島素治療糖尿病。④基因工程的需要：基因工程疫苗和藥物。3ppt課件中心法則4ppt課件核酸、蛋白質（酶）是重要的生物大分子存在于一切生物體中核酸是遺傳信息的攜帶者在有機體內指導各種蛋白質的合成。蛋白質是生物功能的執(zhí)行者擔負著生物催化、物質運輸、運動、防御、生長調控以及記憶、識別等多種生理功能。5ppt課件核酸-DNA與RNA結構6ppt課件脫氧腺嘌呤核苷A7ppt課件A-T對G-C對8ppt課件5’CGAATCAGAA3’

3’GCTTAGTCTT5’

雙鏈DNA高級結構9ppt課件核酸的性質DNA:雙螺旋;RNA單鏈帶電性-----電泳水溶性------溶液變性、復性-------分子雜交光吸收性質-------濃度\純度測定DNA增色效應------TM值測定10ppt課件蛋白質結構11ppt課件12ppt課件蛋白質性質雙帶電性-----電泳\等電點水溶性\脂溶性------溶液分子間識別-------抗原抗體反應光吸收性質-------濃度\純度測定變性13ppt課件生物大分子分離純化的一般程序①材料的選擇和預處理②破碎細胞及提取（有時還需要進行細胞器的分離）③分離純化：包括粗分級分離和細分級分離其中前兩個階段為生物大分子分離純化的前處理。14ppt課件一、材料的選擇與預處理選材，科研選材則無需考慮上述問題，只要能達到實驗目的即可。臨床選材則要考慮病人的依從性。預處理，如動物材料需要除去一些與實驗無關的結締組織、脂肪組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開。若不立即進行實驗或加工，應冷凍保存。15ppt課件應選擇適當?shù)姆椒▽⒔M織和細胞破碎，生物大分子從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)和生物活性。但若材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進行組織細胞的破碎。二、組織細胞的破碎16ppt課件一般動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質組成的細胞壁，一般常用與石英砂和適當?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理也能達到目的。細菌細胞的破碎比較困難，因為整個細菌細胞壁的骨架實際上是一借共價鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎的方法常有超聲波、與石英砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。組織細胞的破碎方法17ppt課件細胞器包括細胞核、線粒體、核糖體、內質網(wǎng)，植物細胞還有葉綠體。如果要分離制備分布在這些細胞器中的生物大分子，為了防止其他細胞組分中的物質對制備物的干擾或污染，還需先將細胞器分離出來，然后在某一細胞器中分離某一物質。采用差速離心法分離細胞器，即將破碎后的細胞在適當?shù)慕橘|中進行離心，常用的介質有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細胞組分按質量大小的不同，經過不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經多次分步離心后，即可獲得所需組分。三、細胞器的分離18ppt課件將組織細胞破碎，使目標分子被釋放出來，并將其與其它細胞成分分離,這就是提取。在此過程中，必須立即將細胞勻漿液置于一定條件下和溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，避免因長久放置造成制備物的分解破壞，四、提取19ppt課件從細胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈的，含有大量雜質，必須進一步分離純化，這一階段可分為粗分級分離和細分級分離兩步進行。五、分離純化20ppt課件核酸分離純化的一般程序破碎細胞或組織提取純化21ppt課件核酸提取技術DNA提取技術原理、方法、應用RNA提取技術原理、方法、應用22ppt課件核酸提取的要求1、純度：2、完整度：3、活性：4、收率：5、速度：主要取決于研究的目的和應用上的要求。如用于基因擴增的模板DNA純度要求較低，而用于治療的DNA則純度要求很高。大分子完整度越高越好。要求大分子保持天然構象狀態(tài)，有高度的生物活性。希望收率越高越好，但在分離純化過程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。越快速越好。23ppt課件DNA的提取純化本質：將DNA從組織或細胞中分離沉淀出來。要求：去除雜蛋白、多糖、脂類等大分子雜質，同時要快速簡便。常用的提取方法：酚-氯仿提取法鹽析法高溫裂解法固相吸附洗脫法碘化鈉提取法磁珠分離法24ppt課件舉例:外周血DNA提取的方法步驟1、標本預處理：1mlEDTA抗凝貯凍血于室溫解凍后移入5ml離心管中，加入1ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS），混勻，3500g離心15min,傾去上清。重復一次。用0.7mlDNA提取液混懸白細胞沉淀，37℃水浴溫育1h。2、消化：上述DNA提取液混懸白細胞，37℃水浴溫育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至終濃度為100-200ug/ml,上下轉動混勻，液體變粘稠。50℃水浴保溫3h，裂解細胞，消化蛋白。保溫過程中，應不時上下轉動幾次，混勻反應液。

25ppt課件3.酚抽提純化DNA：冷卻至室溫后，加入等體積的飽和酚溶液，溫和地上下轉動離心管5-10min，直至水相與酚相混勻成乳狀液。5000g離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復酚抽提一次。加等體積的氯仿﹕異戊醇（24﹕1），上下轉動混勻，5000g離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復一次。4.沉淀DNA：加入1/5體積的3mol/LNaAc及2倍體積的冷無水乙醇，室溫下慢慢搖動離心管，即有乳白色云絮狀DNA出現(xiàn)。用玻璃棒小心挑取云絮狀的DNA，轉入另一1.5ml離心管中，加70%乙醇0.2ml，5000g離心5min洗滌DNA，棄上清。重復一次。室溫揮發(fā)殘留的乙醇，但不要讓DNA完全干燥。加TE液適量溶解DNA，DNA完全溶解通常需12-24小時。26ppt課件5.DNA的濃度測定及純度判定：取DNA溶液用TE液做適量稀釋，以TE液作空白對照，在紫外分光光度計上讀取A260和A280的光密度值。

按下面公式計算濃度：DNA濃度(ug/ul)=A260*50*稀釋倍數(shù)/1000

DNA純度的判定：A260/A280比值應介于1.7-1.8之間。27ppt課件人基因組DNA28ppt課件RNA的提取純化意義：完整RNA的提取和純化，是進行RNA研究工作如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等實驗的前提。29ppt課件關鍵點:１）樣品細胞或組織的有效破碎；２）有效地使核蛋白復合體變性；３）對內源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；5）對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。30ppt課件RNA的提取途徑：1)提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；該提取方法將導致小分子量RNA的丟失，目前已很少使用。2)直接在酸性條件下用酚-氯仿抽提，異丙醇沉淀，再用乙醇洗滌沉淀，即可去除幾乎所有殘留的蛋白質和無機鹽。因為酸性條件下DNA與蛋白質進入有機相而RNA留在水相。31ppt課件舉例：組織（細胞）總RNA提取1、

試劑耗材準備RNA提取緩沖液：4M異硫氰酸胍、25mM檸檬酸鈉、100mMβ-巰基乙醇；飽和酚：氯仿：異戊醇（50：49：1）；3M醋酸鈉pH5.2；DEPC處理的去離子水：0.5%DEPC的去離子水，充分搖勻，放置4小時以上，蒸汽高壓滅菌，分裝成小份；RNA酶抑制劑；15ml、1.5ml等離心管，0.1%DEPC浸泡過夜，蒸汽高壓滅菌。32ppt課件2操作步驟1）將10-30mg組織加入1mlRNA提取緩沖液，勻漿化；或將1mlRNA提取緩沖液加入1瓶培養(yǎng)細胞（10E6-10E7細胞），充分混勻，并使細胞裂解；2）4℃/12000rpm離心10分鐘，上清轉移到另一干凈的離心管；3）加入等體積飽和酚：氯仿：異戊醇，混勻，冰浴10分鐘；4）4℃/12000rpm離心5分鐘，小心轉移水相；33ppt課件5）氯仿：異戊醇抽提一次，轉移水相；6）加入1/10體積的3M醋酸鈉和2.5倍無水乙醇，混勻，冰浴1小時；7）4℃/14000rpm離心10分鐘；8）棄上清，75%乙醇洗一次，真空干燥20分鐘；9）加入20-50ulDEPC處理水溶解RNA，可加入少量RNA抑制劑；或加入1ml乙醇和1/10體積3M醋酸鈉（pH5.2），-20℃--70℃保存34ppt課件核酸的純化1、粗分級分離從細胞中提取得到的核酸，常混雜有蛋白質及各種大小的核酸同類物等雜質，可采用適當方法進行粗提純。粗提純中，進一步將蛋白質除去,可用去污劑或有機溶劑多次反復提取。從RNA除去混雜的DNA，可用DNase將DNA降解掉。從DNA中除去混雜的RNA，可用RNase將RNA降解掉。35ppt課件2、精分級分離核酸樣品進行精提純，一般常用超離心、電泳、柱層析等方法。超離心包括速度區(qū)帶離心、沉降平衡超離心。電泳包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖電泳。前者凝膠孔徑小，適合分離1000個核苷酸以下的核酸分子。后者孔徑大，適合分離較大的核酸分子。柱層析主要有凝膠過濾柱層析、離子交換層析、羥基磷灰石柱層析。36ppt課件3、純度鑒定：

核酸的純度鑒定一般采用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳，沉降分析和紫外吸收（A260/A280）等方法。RNA的濃度測定及純度判定：取RNA溶液用DEPC處理的純水做適量稀釋，以純水作空白對照，在紫外分光光度計上讀取A260和A280的光密度值。

按下面公式計算濃度：

RNA濃度(ug/ul)=A260*40*稀釋倍數(shù)/1000RNA純度的判定：A260/A280比值應介于1.8-2.0之間。37ppt課件38ppt課件一、蛋白質（酶）的分離純化蛋白質分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。性質方法分子大小透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾溶解度等電點沉淀、鹽析、有機溶劑沉淀電荷電泳、離子交換層析吸附性質吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析）對配體分子親和層析的生物親和力39ppt課件主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點是簡便、處理量大、既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白質，但分辨率低。1、粗分級分離40ppt課件（1）鹽析向蛋白質溶液中加入大量的中性鹽[（NH4)2SO4，Na2SO4，Na2SO4]，使蛋白質脫去水化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。鹽析作用是由于當鹽濃度較高時，鹽離子與水分子作用，使水的活度降低，原來溶液中大部分的自由水轉變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質極性基團與水分子之間的作用，破壞蛋白質分子表面的水化層。41ppt課件

不同的蛋白質分子，由于其分子表面的極性基團的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣