高效液相色譜-課件

第四章高效液相色譜法

(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)

一、概述20世紀(jì)60年代末70年代初理論：氣相色譜的理論技術(shù)：高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點(diǎn)。1ppt課件

1．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法

優(yōu)點(diǎn)：高速、高效、高靈敏度、高自動化。2ppt課件2．高效液相色譜法與氣相色譜法

①分析對象。

②流動相。

③

溫度。

3ppt課件二、高效液相色譜儀

主要結(jié)構(gòu)：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)。輔助裝置：如梯度淋洗，自動進(jìn)樣數(shù)據(jù)處理等。4ppt課件5ppt課件

1．高壓輸液系統(tǒng)

部件組成：儲液罐，高壓輸液泵（核心），過濾器，壓力脈動阻尼器6ppt課件⑴儲液罐化學(xué)惰性低壓脫氣法吹氦脫氣法超聲波脫氣法7ppt課件⑵高壓輸液泵

、①要求：流量穩(wěn)定，無脈動輸出壓力高流量范圍寬耐酸，堿緩沖液腐蝕泵體易于清洗：具有梯度洗脫功能，8ppt課件②高壓輸液泵的分類

液壓隔膜泵氣動放大泵注射泵往復(fù)柱塞泵9ppt課件10ppt課件A、液壓隔膜泵

11ppt課件B、氣動放大泵

12ppt課件C、注射泵

13ppt課件D、往復(fù)柱塞泵

往復(fù)泵的優(yōu)點(diǎn)：液缸容積小，易于情況，更換系統(tǒng)，特別適合于梯度淋洗，廣泛應(yīng)用于HPLC，但：有脈動，14ppt課件D、往復(fù)柱塞泵克服脈動辦法：①采用多頭泵交替聯(lián)動②壓力脈動阻滯器③改進(jìn)驅(qū)動凸輪的幾何形狀WATERS泵的特點(diǎn)、泵體、脈動阻滯器、驅(qū)動凸輪。15ppt課件⑶梯度洗脫裝量梯度洗脫，又稱：溶劑程序分類：1：低壓樣度洗脫裝置

2：高壓梯度洗脫裝置16ppt課件2．進(jìn)樣系統(tǒng)

高效液相色譜法中對進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。以克服柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。注射器、進(jìn)樣閥17ppt課件18ppt課件3分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱:柱管與固定相兩部分。柱管材料:玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。故金屬管用得較多。柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm（4.6mm,5mm），凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，預(yù)柱。粒度（＜20μm）填充法:勻漿填充法，19ppt課件4．檢測系統(tǒng)

有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等。現(xiàn)將常用的檢測器介紹如下:20ppt課件

（l）紫外檢測器

最常用：80%的化合物有紫外吸收應(yīng)用最早，最廣靈敏度高對環(huán)境溫度及流速波動不敏感可適用于梯度洗脫原理：比爾定律

21ppt課件A、紫外檢測器的分類與特點(diǎn)單波長式多波長式紫外/可見分光式光電二極管陣列快速掃描式22ppt課件a單波長紫外檢測器

1如紫外—254檢測器光源：低壓錄燈254nm80~85%檢測池：樣品池小于10ul

光路長：10mm

參比池：空氣光電接收元件：光電倍增管光電管光敏電阻23ppt課件b多波長紫外檢測器

光路：與單波長紫外吸收檢測器一致，但：光源是氘燈或氫燈波長：200~400nm，靈敏度：比254nm紫外檢測器要低。

24ppt課件c紫外—可見分光式檢測器

是裝有流通池的紫外—可見分光光度計(jì)，光源：氘燈和鎢燈

25ppt課件d掃描型可變波長紫外檢測器在色譜流停止工作的情況下，記錄樣品池中洗脫組分的吸收行為，既可提供色譜圖，又可提供光譜圖；既可定量，又可定性分析。但，中斷色譜信息，不方便。26ppt課件e光電二極管陳列紫外檢測器

DAD1976年開始報(bào)道可獲得“在流”色譜的全部光譜信息，即不必停留。可能隨色譜峰掃描。與其他快速掃描檢測器相比：結(jié)構(gòu)簡單；工作可靠；性能好。27ppt課件光路特點(diǎn)

28ppt課件工作原理

核心：二極管陣列元件是一般由200~1024個組成光波范圍：200~600mm每只分辨率為1~2nm光點(diǎn)管越多，分辯率越高如使用211個二極管陳列元件，最快時10ms可是成一次測量。因而每秒可收集20000多個數(shù)據(jù)可以得到三維圖。29ppt課件應(yīng)用

色譜峰純度檢查。比較光譜法、吸收比法。色譜峰鑒定與標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)光譜比較正常紫外光譜的比較導(dǎo)數(shù)紫外光譜的比較三維色譜能提供更多全面的信息。30ppt課件31ppt課件32ppt課件（2）熒光檢測法在HPLC種僅次于紫外檢測器。靈敏度高。最小檢測限比紫外低一個數(shù)量級。選擇性好，優(yōu)于紫外。但應(yīng)用沒有紫外廣泛。可以衍生化反應(yīng)33ppt課件工作原理光致發(fā)光現(xiàn)象34ppt課件（3）電化學(xué)檢測法利用電化學(xué)固有的靈敏度線性范圍106，高靈敏度10-12g，可與熒光相比，具很強(qiáng)的專屬性。35ppt課件理論基礎(chǔ)

法拉第第一定律在電介過程中，電極上起反應(yīng)的物質(zhì)量（W）與通過電介池的電量（Q）成正比。法拉第第二定律各種不同的電介質(zhì)溶液中，通過相同的電量時，電極上析出的電極產(chǎn)物的當(dāng)量數(shù)相同。（96487庫侖）36ppt課件電化學(xué)檢測種類電流檢測器安培檢測器，應(yīng)用最為廣泛的一種。

組成：工作電極，參考電極，輔助電極電量檢測器

測電量：根據(jù)法拉第定律可計(jì)算組分的濃度。37ppt課件（4）化學(xué)發(fā)光檢測法：

某些物質(zhì)，進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，生成處于激發(fā)態(tài)的中間體和反應(yīng)產(chǎn)物。激發(fā)態(tài)→回→基態(tài)→化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)條件：反應(yīng)的自由能應(yīng)足以生成電子激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物

常用的化學(xué)發(fā)光劑：光澤精C、魯米諾38ppt課件（5）示差折光率檢測器

通用性檢測器。根據(jù)化合物的折光率不同。光會偏轉(zhuǎn)。光偏轉(zhuǎn)的程度與樣品的濃度成正比。但靈敏度低。溫度、梯度、電解質(zhì)。39ppt課件（6）蒸發(fā)光散射檢測器：ELSD樣品霧化干燥細(xì)顆粒激光照射散射40ppt課件（7）常用檢測器的比較

表紫外示差熒光安培ELSD類型選通選選通線性2.4×104104103104104最小檢出量（g/ml）10-1010-710-1110-910-7能否梯度能不能能不能能對流速不不不敏不對溫度不敏不敏不41ppt課件(8)銀杏黃酮提取物標(biāo)準(zhǔn)銀杏總黃酮銀杏總內(nèi)酯白果酸42ppt課件三、高效液相色譜的固定相和流動相

（－）固定相

分類：以承受高壓能力來分類剛性固體、硬膠。剛性固體：以二氧化硅為基質(zhì)。硬膠：它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中。

43ppt課件分類：

固定相按孔隙深度分類：表面多孔型固定相全多孔型固定相44ppt課件1.表面多孔型固定相基體：實(shí)心玻璃珠，表面多孔：多孔活性材料，多孔活性材料：硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。特性：厚度薄、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達(dá)平衡，45ppt課件2．全多孔型固定相它由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。特性：這類固定相由于顆粒很細(xì)（5～10μm），孔較淺，傳質(zhì)快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。46ppt課件

47ppt課件（二）流動相

正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：（1）溶劑對于樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑要與檢測器匹配。（3）高純度。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。

(5)低粘度。48ppt課件49ppt課件四、高效液相色譜法的主要類型及選擇（－）液一液分配色譜法（LLPC）流動相和固定相：液體。樣品類型：極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的各類化合物。1．分離原理原理：液液萃取相同。50ppt課件

2固定相類型：固定相選擇較簡單。例如：強(qiáng)極性β，β′一氧二丙睛，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈?。流失問題：化學(xué)鍵合固定相。重大突破。應(yīng)用最廣泛。

3/4以上的分離是在化學(xué)鍵合固定

相上進(jìn)行的。51ppt課件3．流動相基本要求：盡可能不與固定相互溶，流動相與固定相的極性差別越顯著越好正相分配色譜：流動相的極性小于固定相的極性，它適用于極性化合物的分離。極性小的先流出，極性大的后流出。

反相分配色譜：流動相的極性大于固定相的極性。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。

52ppt課件（二）化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）

化學(xué)鍵合相色譜法：簡稱鍵合相色譜，采用化學(xué)鍵合相的液相色譜。特點(diǎn)：不易流失，適用于梯度淋洗，表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。適用于種類繁多樣品的分離。53ppt課件1．鍵合固定相類型

載體：

硅膠。(Si一OH)與有機(jī)分可成鍵,一般可分三類（1）疏水基團(tuán)如不同鏈長的烷烴（C8和C18）和苯基等（2）極性基團(tuán)如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）離子交換基團(tuán)如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基，季鍍鹽；作為陽離子交換基團(tuán)的磺酸等.54ppt課件2．鍵合固定相的制備（l）硅酸酯（≡Si一OR）鍵合固定相。用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應(yīng)：

≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20

特性：傳質(zhì)特性好,但易水解且受熱不穩(wěn)定，僅適用于不含水或醇的流動相。（2）≡Si－C或Si一N共價鍵合固定相制備反應(yīng)如下

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特性：共價鍵健合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點(diǎn)是反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時，必須限制PH在4～8范圍內(nèi)。57ppt課件（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）鍵合固定相制備反應(yīng)如下：

58ppt課件C18柱的反應(yīng)與鈍化59ppt課件特性：

這類鍵會固定相具有熱穩(wěn)定好，

不易吸水，

耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)。

能在70℃以下，

PH=2～8范圍內(nèi)正常工作，

應(yīng)用較廣泛.160ppt課件3．反相健合相色譜法

固定相：非極性，如硅膠一C18H37、硅膠一苯基等。流動相：極性較強(qiáng)的溶劑，樣品對象：樣品范圍廣。流出程序：優(yōu)點(diǎn)：柱效高，能獲得無拖尾色譜峰的。61ppt課件分離機(jī)理疏溶劑作用理論。非極性的烷基鍵合相“分子毛”，“分子毛”有較強(qiáng)的疏水特性。被分離物質(zhì)分為：非極性部分與極性部分。一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；這種締合作用是可逆的。而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作用。顯然，兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。62ppt課件分離機(jī)理疏溶劑作用理論。締合作用的強(qiáng)度和溶質(zhì)的色譜保留值取決于三個因素：

①溶質(zhì)分子中非極性部分的總表面積

②鍵合相上烷基的總表面積

③洗脫液的表面張力

表面張力大，S與L締合時釋放的能量多，k也大加入電解質(zhì)，表面張力大，k也大。有機(jī)極性溶劑增加，表面張力小，k也小。無機(jī)鹽增加，表面張力大，k也大。63ppt課件64ppt課件分離機(jī)理雙保留機(jī)理，以下共同貢獻(xiàn)：疏溶劑作用親硅醇基效應(yīng)

65ppt課件4.正相鍵合相色譜法

固定相：極性的有機(jī)基團(tuán)，CN、NH2等鍵合在硅膠表面。流動相：非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇等）。流出程序：極性大，后出；極性小，先出。樣品對象：分離極性化合物。異構(gòu)體。特別適用于分離不同類型的化合物。66ppt課件5.離子性鍵合相色譜法

固定相；硅膠為基質(zhì)，鍵合各種離子交換基團(tuán)，如一SO3H一CH2NH2、－C00H、一CH2N（CH3）等。流動相：緩沖溶液。分離原理：離子交換。離子性化學(xué)鍵合相色譜法優(yōu)點(diǎn)：

①可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）。

②不易流失。

③特別適用于梯度淋洗。缺點(diǎn)：不能用酸、堿度過大或存在氧化劑的溶液作流動相的體系。67ppt課件

68ppt課件（三）液一固吸附色譜法(LSAC)

固定相：固體吸附劑。1．分離原理吸附:

X+nSad=Xad+nS69ppt課件

達(dá)平衡時,

Kad

=Kad為吸附平衡常數(shù)，

Kad值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難于洗脫。

Kad值小,則保留值弱，易于洗脫。

Kad值可通過吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。

70ppt課件2．固定相

吸附劑：如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。硅膠線性容量較高，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)因此硅膠用得最多。

71ppt課件3流動相

一般把吸附色譜中流動相稱作洗脫劑。對極性強(qiáng)的試樣宜用極性強(qiáng)的洗脫劑；對極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)（ε0）來量。ε0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)。氧化鋁（ε0硅膠=0·77×ε0氧化鋁）。72ppt課件73ppt課件(四）離子交換色譜法（IEC）

離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合樣品對象：離子型化合物如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。74ppt課件1．離子交換原理待測離子對固定相（離子交換樹脂）親和力的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。陽離子交換：

陰離子交換：

一般形式：R一A＋B＝R－B＋A75ppt課件達(dá)平衡時，平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：

KB/A=[A][B]r/[B][A]r，式中[A]r，[B]r分別代表樹脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（B）的濃度，[A]、[B]則代表它們在溶液中的濃度。KB/A越大，說明B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說來，B離子電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。76ppt課件

磺酸型陽離子交換樹脂，一價離子的KB/A值按以下順序：

Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+

二價離子的順序?yàn)椋?/p>

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+對于季銨型強(qiáng)堿陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序?yàn)椋篊lO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-

＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－77ppt課件2．固定相

基質(zhì)有三大類：

合成樹脂（聚苯乙烯）

纖維素

硅膠。

離子交換劑：陽離子和陰離子。

178ppt課件79ppt課件

常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種：（l）多孔型離子交換樹脂聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物。（2）薄膜型離子交換樹脂

在直徑約對30μm的固體惰性核上，凝聚1～2μm厚的樹脂層。（3）表面多孔型離子交換樹脂在固體惰性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂。（4）離子交換鍵合固定相化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。80ppt課件3．流動相

緩沖溶液。選擇：離子種類、濃度和pH值。

陰離子交換樹脂，各種陰離子的滯留次序?yàn)椋簷幟仕犭x子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞

Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-

所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。陽離子的滯留次序大為：

Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十但差別不如陰離子明顯。關(guān)于pH值的影響，要視不同情況而定。只要電離度增大，就會使樣品的保留增大。

81ppt課件（五）離子色譜法（IC）

離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。由于離子交換色譜法在無機(jī)離子分析和應(yīng)用受到限制。例如：無機(jī)離子。1975年Small等人提出后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹脂。離子色譜。樣品為陽離子，無機(jī)酸作流動相，抑制柱為陰離子交換劑。試樣→陽離子交換劑的分離→抑制柱→發(fā)生兩個重要反應(yīng)：82ppt課件R+－OH＋H+Cl--→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-

由反應(yīng)可見：一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動相本底電導(dǎo)的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，

OH-淌度為Cl-的2．6倍，提高了電導(dǎo)檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機(jī)理。亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。83ppt課件抑制柱要定期再生通過抑制柱后峰會加寬，降低了分離度。Frits等人采用了電導(dǎo)率極低的溶液，例如10-4～5×10-4mol·L-1苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。84ppt課件（六）離子對色譜法（IPC）

離子對色譜法是分離分析強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿的極好方法。1．離子對色譜法原理反離子加到流動相或固定相中，結(jié)合形成離子對。

色譜機(jī)理，至今仍不十分明確，已提出三種機(jī)理：離子對形成機(jī)理；離子交換機(jī)理；離子相互作用機(jī)理?，F(xiàn)以離子對形成機(jī)理說明之。85ppt課件色譜機(jī)理假如有一離子對色譜體系，固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，離子對生成反應(yīng)式

A-+B+＝A-B+86ppt課件離子對化合物A-B+具有疏水性，被非極性固定相（有機(jī)相）提取。如組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對的能力大小不同形成的離子對疏水性質(zhì)不同，各組分離子在固定相中滯留時間不同，因而出峰先后不同?！驹?。87ppt課件

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