生物大分子的電子顯微鏡技術(shù)

生物大分子的電子顯微鏡技術(shù)第1頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月關(guān)于生物大分子：蛋白質(zhì)，酶，核酸，多糖，脂類研究生物大分子的意義：理化特性及空間構(gòu)像與功能研究生物大分子的方法物理化學(xué)方法探討理化特性

X－射線衍射技術(shù)分析結(jié)晶樣品

電子顯微鏡的直接觀察技術(shù)第2頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酸的電子顯微鏡研究技術(shù)核酸的分類：核小體－－DNA與蛋白質(zhì)聚合一起構(gòu)成的染色體的單位DNA雙鏈dsDNA、線性的，超螺旋的，單鏈ssDNARNA單鏈ssRNA、線性的，三葉草形的

雙鏈dsRNA第3頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月核酸分子電鏡觀察的要求:核酸分子需要打開(kāi)超螺旋成為二維伸展的長(zhǎng)鏈;核酸分子太細(xì)需要加粗；提高電子反差。第4頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分子長(zhǎng)度測(cè)量及計(jì)算對(duì)已知的標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行觀察和計(jì)算，完整的分子的長(zhǎng)度應(yīng)相對(duì)一致。觀察100個(gè)以上的分子，拍像記錄；矯正電鏡放大倍數(shù)；測(cè)量分子，50~200份單分子；統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算平均值，作出長(zhǎng)度分布圖；用已知的標(biāo)準(zhǔn)分子進(jìn)行對(duì)照測(cè)算經(jīng)驗(yàn)公式：ds1um=2.07X106Dass1um=1.20X106Da第5頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月特點(diǎn)和應(yīng)用樣品量少；操作簡(jiǎn)便；制備樣品時(shí)間短。適合觀察核酸分子的形狀和長(zhǎng)度、雙鏈或單鏈的區(qū)分、根據(jù)長(zhǎng)度計(jì)算核酸的分子量；進(jìn)行異源雙鏈分子分析、分子雜交、轉(zhuǎn)錄復(fù)合體、核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體等研究；基因組織結(jié)構(gòu)、基因片段的缺失、斷裂基因、插入或倒置、基因定位及堿基組成特征等方面的研究。第6頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)單分子展層操作對(duì)核酸樣品和試劑的要求：1.核酸樣品純度高，去除其他混雜的核酸和蛋白質(zhì)成份；2.核酸樣品為新鮮制備,并盡量保持其長(zhǎng)鏈的完整性;3.樣品濃度在5ug∕ml以上;4.樣品溶液中無(wú)表面活性劑及變性劑等其他污染;5.溶液的PH在6~10之間;6.展層的堿性蛋白常選擇細(xì)胞色素C,電泳純;7.所用試劑為分析純,器具潔凈,無(wú)去污劑等殘留;8.制備RNA樣品的試劑與器具須高溫烘烤,使RNA酶失活.第7頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月染色與投影染色----增加核酸分子的電子密度

樣品展層后,粘取至銅網(wǎng)上,經(jīng)過(guò)染色和金屬投影以增強(qiáng)反差.染色液為1~2%的PTA,(用90%乙醇配制,100ml染液中含1ml的濃硫酸)或醋酸雙氧鈾,染色10~30秒后.自然晾干.投影-----使核酸細(xì)分子的直徑加粗

染色后的樣品以投影角度5~9o,用鉑~鈀合金進(jìn)行旋轉(zhuǎn)投影,或再加噴一薄層碳膜,以增加強(qiáng)度.

第8頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月染色與投影染色----增加核酸分子的電子密度

樣品展層后,粘取至銅網(wǎng)上,經(jīng)過(guò)染色和金屬投影以增強(qiáng)反差.染色液為1~2%的PTA,(用90%乙醇配制,100ml染液中含1ml的濃硫酸)或醋酸雙氧鈾,染色10~30秒后.自然晾干.投影-----使核酸細(xì)分子的直徑加粗

染色后的樣品以投影角度5~9o,用鉑~鈀合金進(jìn)行旋轉(zhuǎn)投影,或再加噴一薄層碳膜,以增加強(qiáng)度.

第9頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月電鏡觀察要求染色，投影后，核酸分子的直徑從20A增至80~100A，故在10萬(wàn)倍以下可以觀察到；第10頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)單分子膜展層技術(shù)的原理某些堿性蛋白質(zhì)在低鹽溶液或水的表面形成不溶性變性薄膜，單濃度和加到溶液表面的量合適，該膜就展開(kāi)成為單分子層，也就是一個(gè)多肽鏈構(gòu)成的分子網(wǎng)。如果將核酸樣品混合在溶液中，堿性蛋白上的氨基酸堿性基團(tuán)便與核酸分子鏈上的酸性基團(tuán)以水合鍵結(jié)合，核酸分子相對(duì)穩(wěn)定地固著在蛋白質(zhì)分子上。展層時(shí)，核酸分子隨著蛋白質(zhì)在溶液表面的展開(kāi)而被拉開(kāi)伸展為彎曲的二維結(jié)構(gòu)。由于蛋白質(zhì)單分子膜作基礎(chǔ)，使核酸分子保持完整性，經(jīng)撈網(wǎng)，染色，金屬投影，電鏡觀察。第11頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月特點(diǎn)和應(yīng)用樣品量少；操作簡(jiǎn)便；制備樣品時(shí)間短。適合觀察核酸分子的形狀和長(zhǎng)度、雙鏈或單鏈的區(qū)分、根據(jù)長(zhǎng)度計(jì)算核酸的分子量；進(jìn)行異源雙鏈分子分析、分子雜交、轉(zhuǎn)錄復(fù)合體、核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體等研究；基因組織結(jié)構(gòu)、基因片段的缺失、斷裂基因、插入或倒置、基因定位及堿基組成特征等方面的研究。第12頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)單分子展層操作對(duì)核酸樣品和試劑的要求：1.核酸樣品純度高，去除其他混雜的核酸和蛋白質(zhì)成份；2.核酸樣品為新鮮制備,并盡量保持其長(zhǎng)鏈的完整性;3.樣品濃度在5ug∕ml以上;4.樣品溶液中無(wú)表面活性劑及變性劑等其他污染;5.溶液的PH在6~10之間;6.展層的堿性蛋白常選擇細(xì)胞色素C,電泳純;7.所用試劑為分析純,器具潔凈,無(wú)去污劑等殘留;8.制備RNA樣品的試劑與器具須高溫烘烤,使RNA酶失活.第13頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月樣品配制醋酸銨法:上相液組成:醋酸銨(終濃度)0.5~2Mol(PH7.5)

核酸樣品0.5~1ug∕ml

總體積50ul

細(xì)胞色素C0.05~0.1mg∕ml下相液:0.05~0.25M醋酸銨水溶液或雙蒸水甲酰銨法:上相液組成:Tris-Na3EDTA(PH8.5)0.1~0.01M

核酸樣品0.5~1ug∕ml細(xì)胞色素C0.05~0.1mg∕ml甲酰銨40~50%下相液:0.1MTris~0.01MNa3EDTA(PH8.5),20%甲酰銨.第14頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第15頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月展層方法及步驟展層1.樣品溶液(上相溶液)2.展層液(下相溶液)3.滑石粉4.載玻片5.加樣器12345.沾網(wǎng):將銅網(wǎng)的膜面朝下,沾取液面上的樣品脫水與染色銅網(wǎng)以45o角插入無(wú)水乙醇片刻,進(jìn)行脫水,以同樣方法在2%PTA中染色金屬投影:在真空噴鍍儀中對(duì)樣品進(jìn)行重金屬旋轉(zhuǎn)投影.第16頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月微滴擴(kuò)散法及單滴展開(kāi)法適合微量樣品的操作,單滴展開(kāi)法的展層樣品液只需5~10ul,操作方法與展層方法相同,可用16孔酶標(biāo)板代用展層容器第17頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一步釋放法病毒，噬菌體等含核酸的細(xì)胞器，不進(jìn)行提取核酸，利用展層上相液（2M醋酸銨），下相液（0.2M醋酸銨或水溶液）鹽濃度的巨大差異，高鹽中的病毒遇到低滲溶液而破裂，核酸分子釋放，并與細(xì)胞色素C結(jié)合，隨著單分子層展開(kāi)，因此，釋放與展層在一步完成第18頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月染色與投影染色----增加核酸分子的電子密度

樣品展層后,粘取至銅網(wǎng)上,經(jīng)過(guò)染色和金屬投影以增強(qiáng)反差.染色液為1~2%的PTA,(用90%乙醇配制,100ml染液中含1ml的濃硫酸)或醋酸雙氧鈾,染色10~30秒后.自然晾干.投影-----使核酸細(xì)分子的直徑加粗

染色后的樣品以投影角度5~9o,用鉑~鈀合金進(jìn)行旋轉(zhuǎn)投影,或再加噴一薄層碳膜,以增加強(qiáng)度.

第19頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月電鏡觀察要求染色，投影后，核酸分子的直徑從20A增至80~100A，故在10萬(wàn)倍以下可以觀察到；樣品不進(jìn)行投影，只染色，分子的直徑大小改變不大，在視野中很難尋找。第20頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月無(wú)蛋白展層法用蛋白質(zhì)單分子展層技術(shù)，核酸分子被細(xì)胞色素C覆蓋，再經(jīng)染色和投影，分子的直徑從~100A，不適合觀察酶或蛋白質(zhì)與核酸的復(fù)合體，與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)組分被細(xì)胞色素C覆蓋，故建議用無(wú)蛋白展層技術(shù)。BAC法:用銨鹽類低分子化合物氯化烴基二甲基芐基銨代替細(xì)胞色素C,能在下相液表面形成一層膜吸附核酸,投影后.核酸分子直徑為40~60A.加染料法:如溴乙啶、二碘丙啶加到DNA的溶液中,DNA分子吸附到云母片上,進(jìn)行復(fù)型、投影.第21頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月RNA的展層技術(shù)第22頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第23頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月從一種非洲蛙的卵母細(xì)胞核中提取的DNA的8個(gè)基因片段。第24頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5SDNA的部分變性第25頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月雜交重復(fù)分子第26頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月X174的DNA,長(zhǎng)度約1.8m的環(huán)狀DNA(雙鏈DNA)第27頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月病毒DNA在細(xì)菌中復(fù)制時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)合在病毒DNA的特別部分，也就是DNA復(fù)制的開(kāi)始點(diǎn)。第28頁(yè)，課件共32頁(yè)，創(chuàng)作