細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)第1頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月2第四章細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)4.1基本操作技術(shù)和要求

第2頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月3培養(yǎng)前準(zhǔn)備制訂試驗(yàn)計(jì)劃和操作程序準(zhǔn)備各種器材物品培養(yǎng)室和超凈臺(tái)的消毒0.2%新潔爾滅托洗地面紫外燈照射30-60分鐘以75%乙醇擦拭無菌操作臺(tái)面培養(yǎng)室內(nèi)的無菌操作第3頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月4洗手和著裝徹底洗手以75%乙醇消毒手和前臂可穿經(jīng)紫外線照射30min的一般清潔工作服。無菌培養(yǎng)操作一切操作都應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過灼燒進(jìn)行。小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。培養(yǎng)室內(nèi)的無菌操作第4頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月5第5頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月6第6頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月7第7頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月8第8頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月9第9頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月10無菌操作中常犯的錯(cuò)誤吸管、剪刀等碰到其他器皿第10頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月11無菌操作中常犯的錯(cuò)誤正確的拿管姿勢(shì)錯(cuò)誤的拿管姿勢(shì)拿吸管時(shí)手碰到無菌區(qū)！第11頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月12無菌操作中常犯的錯(cuò)誤培養(yǎng)基浸濕吸管底部的棉花第12頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月134.2原代培養(yǎng)第13頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月14

將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個(gè)小時(shí)后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細(xì)胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長狀態(tài)。細(xì)胞和組織培養(yǎng)

第14頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月15計(jì)數(shù)細(xì)胞細(xì)胞數(shù)/ml=計(jì)數(shù)16格×稀釋倍數(shù)

×104第15頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月16原理：（1）計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。（2）血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。（3）存活測試之步驟為dyeexclusion（染料排除），利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypanblue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypanblue，則用紅色之Erythrosinbluish。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時(shí)間延長，部分活細(xì)胞也開始攝取染料；因?yàn)榕_(tái)盼蘭對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。第16頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月17兩個(gè)概念

原代培養(yǎng)直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進(jìn)行傳代培養(yǎng)（Subculture）的細(xì)胞，便不再稱為原代培養(yǎng)，而改稱為細(xì)胞系。傳代培養(yǎng)細(xì)胞長滿瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無限地傳代下去。第17頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月18培養(yǎng)細(xì)胞的取材

理論上講各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實(shí)際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。第18頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月19組織塊培養(yǎng)法

新鮮取材的組織中細(xì)胞仍具有分裂增殖的能力。將組織切成小塊培養(yǎng)在模擬體內(nèi)的環(huán)境中，小塊組織的細(xì)胞可以游離出來，從培養(yǎng)液中吸取營養(yǎng)，繼續(xù)分裂生長。組織塊培養(yǎng)法適用范圍廣，常用于肝臟、皮膚、角膜、骨骼、韌帶、血管、神經(jīng)、心臟等器官和組織的培養(yǎng)。58第19頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月20第20頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月21第21頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月22第22頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月23第23頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月24第24頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月25第25頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月26培養(yǎng)要點(diǎn)材料新鮮嚴(yán)格無菌操作剔除脂肪等附著組織組織塊剪小（直徑﹤1mm）擺放開（間距﹥5mm）第26頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月27常犯的錯(cuò)誤

操作中不換器械沖洗次數(shù)不夠組織碎片太大組織塊擺放太密培養(yǎng)液加入太多第27頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月28消化培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法所用的酶有多種，目前應(yīng)用最廣的是胰蛋白酶。它是一種內(nèi)切酶，可專一水解有精胺酸或賴氨酸的羧基形成的肽鍵。從而消除妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)，包括基質(zhì)、纖維等，使細(xì)胞分散，易于貼壁并從外界吸收養(yǎng)分和排除代謝物消化法適用于組織量大的原代培養(yǎng)。胰蛋白酶液適用于消化間質(zhì)少的組織，如羊膜、胚胎、上皮、肝和腎等組織及傳代細(xì)胞。59第28頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月2955切成1--2mm3小塊20--60min第29頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月30第30頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月31第31頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月32第32頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月33第33頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月34第34頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月35第35頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月36培養(yǎng)要點(diǎn)36合適的胰蛋白酶濃度（通常為0.25%）合適的消化時(shí)間：消化時(shí)，待組織塊變得較疏松，顏色略白為止（通常為37℃，20-40分鐘）第36頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月37常犯的錯(cuò)誤

水浴鍋未預(yù)熱組織塊太大第37頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月38胰蛋白酶消化不足或過度吹打用力過重常犯的錯(cuò)誤

第38頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月394.3傳代培養(yǎng)和細(xì)胞系的維持

第39頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月40傳代細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞在原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的操作叫傳代。為獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株，或大量的同種細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞形成致密的單層后需進(jìn)行傳代培養(yǎng)。63第40頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月41首次傳代注意事項(xiàng)細(xì)胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前（80%），不要急于傳代。傳代時(shí)不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間，因而要根據(jù)需要注意觀察及時(shí)處理。首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增殖。63第41頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月42細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長的特點(diǎn)，傳代方法有3種懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l/2～2/3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代半懸浮生長細(xì)胞傳代此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液64第42頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月43貼壁生長細(xì)胞傳代方法吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液PBS洗一次加入1～2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置2～10min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測）吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液吸取1/10～1/40細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)第43頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月44第44頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月45第45頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月46Trypsin消化細(xì)胞未消化細(xì)胞細(xì)胞消化過程第46頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月47第47頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月48第48頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月49培養(yǎng)要點(diǎn)嚴(yán)格的無菌操作適度消化第49頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月50細(xì)胞培養(yǎng)中需要注意的問題培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細(xì)胞生長，不能盲目增加每單位體積的細(xì)胞濃度PH：初培養(yǎng)pH應(yīng)為7.4，培養(yǎng)過程應(yīng)不低于7.0培養(yǎng)瓶內(nèi)的空間：一般培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10第50頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月51細(xì)胞培養(yǎng)中需要注意的問題容積、深度、表面面積：培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.2～0.5ml/cm2。需高濃度氧的，在淺的培養(yǎng)液（2mm）中生長較好；需要低濃度氧的,在深的培養(yǎng)液（5mm）中生長較好。去除死細(xì)胞溫度控制：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)溫度波動(dòng)的敏感性很大。溫度低于36.5℃，細(xì)胞生長緩慢；溫度高于37.5℃，細(xì)胞存活力降低第51頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月52細(xì)胞系的維持細(xì)胞系檔案要記錄好；細(xì)胞系的傳代、換液一般都有自身的規(guī)律性，在維持傳代時(shí)要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性；多種細(xì)胞系維持傳代，要嚴(yán)格操作程序，以防細(xì)胞之間交叉污染；每一種細(xì)胞系都應(yīng)有充足的凍存儲(chǔ)備。65第52頁，課件共57頁，創(chuàng)作于2023年2月53培養(yǎng)細(xì)胞的純化自然純化人工純化

酶消化法機(jī)械刮除法反復(fù)貼壁法克隆法培養(yǎng)基限定方法流式細(xì)胞儀分離法

65第53頁，課件共57頁，創(chuàng)作于20