細胞因子檢測方法課件

細胞因子檢測方法基礎醫(yī)學院微免學系王慧娟1編輯課件背景細胞因子檢測是判斷機體免疫功能的一個重要指標疾病的診斷、病程觀察、療效判斷及細胞因子治療監(jiān)測等2編輯課件（一）依賴性細胞株：生物分析法

（二）功能檢測：生物分析法

（三）免疫測定：免疫分析法

（四）功能測定與抗體抑制（五）分子雜交技術：mRNA的測定

（六）多聚酶鏈反應技術（PCR）：mRNA的測定

3編輯課件生物分析法4編輯課件（一）依賴性細胞株一些腫瘤細胞株必須依賴于細胞因子方能在體外增殖，如DTLL細胞株依賴IL-2；FDC-PL細胞株依賴于小鼠IL-3；TF-1細胞株依賴于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用這些依賴細胞株檢測相應的細胞因子。這種方法敏感性高，特異性也不錯，但可異的是并非所有細胞因都能找到相應的細胞株，因而限制了它的應用。5編輯課件（二）功能檢測利用一些細胞因子的功能特性，可建立相應的活性測定方法，如干擾素的抑制病毒感染效應，腫瘤壞死因子對L929細胞的殺傷作用等。這樣的方法敏感性高，但特異性不夠，容易受一些擾因素的影響。6編輯課件免疫分析法（1）放免實驗（RIA）（2）酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）7編輯課件mRNA的測定（1）分子雜交實驗（2）逆轉錄PCR（RT-PCR）8編輯課件小結生物學檢測法比較敏感，又可直接測定生物學功能，是最可靠的方法，適用于各種實驗目的，是科研部門最常用的技術，但需要長期培養(yǎng)依賴性細胞株，檢測耗時長，步驟繁雜，影響因素多，不容易熟練掌握。免疫學檢測法比較簡單，迅速，重復性好，但所測定的只代表相應細胞因子的量而不代表活性，同時敏感度也低于生物活性檢測法（約低10～100倍）。分子生物學法只能檢測基因表達情況，不能直接提供有關因子的濃度及活性等資料，主要用于機制探討。9編輯課件影響因素原理與方法靈敏度準確度和特異性精密度：免疫分析法的精密度較其生物分析法有較大提高；批內變異通常為20%～25%，因此有必要進行2次或3次檢測標準化生物分析法和免疫分析法結合使用

10編輯課件免疫分析法ELISA細胞內細胞因子的流式細胞儀檢測

ELISPOT11編輯課件ELISA

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay1．間接ELISA（IndirectELISA）：用于篩檢抗體（抗特定抗原成分的特異性抗體）。此法是測定抗體最常用的方法。2．夾心ELISA（SandwichELISA）：用于檢測目的抗原的量。其優(yōu)點是避免了對特異性抗體的直接標記，但增加了操作步驟和測定時間。3．競爭ELISA（CompetitiveELISA）用于確定抗原特異性或待檢標本中含交叉反應成分時為了提高實驗的特異性而使用的一種方法。根據標記抗原與同種未標記待測抗原與抗體間發(fā)生競爭性結合的原理，主要用于測定小分子抗原。

12編輯課件夾心ELISA第1步，包被捕獲抗體到96孔板中，BSA阻斷后加入標準品或者標本第2步，加入酶標的抗體，結合被捕獲的細胞因子第3步，加入酶的底物顯色，酶標儀或者化學發(fā)光議讀取結果（OD：opticaldensity）第4步，繪制標準曲線，計算標本中細胞因子的含量13編輯課件14編輯課件注意事項實驗前：確定試劑盒在有效期內仔細閱讀說明書按說明書確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積）根據檢測標本數(shù)量確定所需試劑的量按說明書將所用試劑平衡至室溫，配制所需試劑

15編輯課件注意事項標本的制備和貯存：血清、血漿標本：盡快分裝，貯存在-70℃，避免反復凍融。使用前將標本平衡至室溫，不能用水浴鍋細胞培養(yǎng)上清液：1500g離心10～15分鐘去除細胞和細胞殘渣。16編輯課件注意事項試劑盒貯存條件和有效期未開封試劑盒：貯存在2-8℃開封/復溶試劑：2-8℃可以1個月左右標準品：分裝并貯存在-20℃以下，1個月，避免反復凍融微孔板：將未使用的板條用箔紙包好，加上干燥劑沿四周封口。2-8℃可以1個月左右

17編輯課件檢測方法的進展高通量細胞因子檢測CBA(CytometricBeadArray)是一種微珠多用途檢測分析技術，它由一系列的微珠組合來捕獲并結合流式細胞儀技術檢測細胞培養(yǎng)液、EDTA血漿、血清樣本中被檢測物質的量。其采用夾心法分析策略，與傳統(tǒng)的ELISA分析技術相比，此方法可以同時檢測多項指標。用已知的標準品和對照標準曲線就可以得出被測樣本的濃度。此分析方法不受樣本量的限制，而且可以得到一個樣本的多個數(shù)據。18編輯課件夾心ELISA缺點：不能顯示出單個細胞產生細胞因子的同一性和頻率性的直接信息細胞內細胞因子的免疫熒光檢測ELISPOT原位雜交單一細胞PCR19編輯課件細胞內細胞因子的流式細胞儀檢測原理：Brefeldin(BFA)、Monensin阻斷了胞內高爾基體介導的轉運方法，使得細胞因子聚集、蓄積，增強細胞因子信號，可被流式細胞儀檢測。用途：檢測單個細胞內多個細胞因子；并可區(qū)分表達特定細胞因子的細胞亞群。20編輯課件細胞內細胞因子的流式細胞儀檢測方法：用抗細胞因子抗體與細胞表面或胞內特定亞群標志組合，即可檢測不同細胞亞群細胞因子的分泌，同時采用特殊的化學與抗體選擇，確保靜止與無細胞因子分泌細胞的最小熒光背景。特點：快速

簡便：無需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無需分離PBMCs；

靈敏度高：高度靈敏的熒光標記與檢測系統(tǒng)；

高效：在同一細胞內同時檢測兩種或更多種細胞因子，也可根據細胞免疫表型區(qū)分分泌細胞因子的細胞亞群；

接近生物體的分析條件：全血檢測保留細胞及生化微環(huán)境更準確反映了體內狀況。21編輯課件所需儀器流式細胞儀

22編輯課件所需試劑１．細胞表面染色的熒光標記的單抗試劑２．熒光標記的細胞因子抗體３．激活劑：①Phorbol12-Myristate13Acetate(PMA)②Ionomycin③StaphylococcalenterotoxinB(SEB)４．蛋白轉運抑制劑：阻斷高爾基體介導的轉運作用，使得刺激細胞表達的細胞因子聚集在胞漿內質網內，以利于準確檢測細胞產生細胞因子的能力①Brefeldin-A(BFA)：10mg/ml．在激活過程最后4-5小時使用BFA，過度孵育會導致細胞活力下降②Monensin：3uM/files/FLOWapplicaion/TH1TH2/brefeldin%20a.pdf23編輯課件所需試劑５．固定劑：含4%的多聚甲醛PBS溶液細胞在體外刺激后需要對細胞進行固定。固定的目的在于通過蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細胞因子固定在細胞內，另一方面避免細胞表面抗原丟失。６．破膜劑：含1％皂甙、0.05％疊氮化鈉的Hanks溶液（HBBS）將細胞膜穿孔，以利于熒光標記的細胞因子抗體進入細胞內，與相應的細胞因子結合

24編輯課件細胞培養(yǎng)和刺激的基本方法人IFN-γ：人的PBMCs使用PMA(10ng/ml)和Ionomycin(1uM)刺激4-24小時人TNF-α：使用PMA(50ng/ml)和Ionomycin(500ng/ml)刺激６小時人IL-2：人的PBMCs使用PMA(10ng/ml)和Ionomycin(1uM)刺激4-24小時小鼠IL-2：細胞在包被抗小鼠CD3抗體(25ug/ml)的培養(yǎng)板中，使用抗CD28抗體(2ug/ml)+PMA(5ng/ml)+Ionomycin(500ng/ml)刺激6小時25編輯課件基本過程（以全血為例）１、收獲細胞２、阻斷Fc受體：消除非特異性的結合染色３、細胞表面染色４、固定和破膜５、細胞內染色26編輯課件27編輯課件免疫分析法ELISA細胞內細胞因子的流式細胞儀檢測

ELISPOT28編輯課件ELISPOTEnzyme-linkedImmunospotAssay

29編輯課件30編輯課件ELISPOT發(fā)展歷史1963年：Jerne等人創(chuàng)立的溶血空斑技術(hemo-lyticplaqueformingcellassay,HPF),這項技術可用于檢測并計數(shù)單個抗體形成細胞。1983年：Czerkinsky等成功地檢測出因受刺激而分泌抗體的B細胞頻率接近體內實驗的環(huán)境，藉由檢測T細胞分泌的各類細胞因子，來定量機體內免疫反應啟始者PrecursorT亞群的大小，預測體內免疫系統(tǒng)即將進行的下游免疫反應。1996：俄亥俄卅CaseWesternReserve大學PaulLehmann團隊引進PVDF薄膜的應用（Forsthuberetal.,Science,1996），解決了低敏感度的問題。Nordstrom等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法來提高這種方法的敏感性Herr用計算機輔助圖像分析系統(tǒng)(computer-assistedvideoimageanalysis,CVIA)自動分析TNF-α酶聯(lián)免疫斑點的大小和數(shù)量,計算與負載抗原肽的靶細胞接觸后PBMC中抗原特異性CD8+T細胞的數(shù)量Vaquerano等將數(shù)碼相機和計算機結合起來,開發(fā)出類似的斑點計數(shù)系統(tǒng),認為當每孔斑點數(shù)大于100時,這種方法更客觀、可重復性高且節(jié)省時間31編輯課件32編輯課件檢測原理細胞受到刺激后局部產生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產生了細胞因子，通過顯微鏡或ELISPOT酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結果。33編輯課件ELISPOT標準操作程序D1ELISPOT包被程序

每孔加入15μl70%的乙醇預濕30秒，PVDF膜變成半透明狀（加樣注意?。┘尤?00μl去離子水洗滌三次，盡量減少乙醇的殘留每孔加入100μl包被抗體工作液，4°C包被過夜34編輯課件ELISPOT標準操作程序D2傾倒包被液，用PBS洗滌5次，最后一次，在滅菌的吸水紙上扣干200μl試劑盒自帶的稀釋好的封閉液，37°C封閉1小時傾倒封閉液，無須洗滌，直接可以進行細胞培養(yǎng)。（也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存數(shù)周。）35編輯課件ELISPOT標準操作程序D2鋪細胞,加入刺激物，培養(yǎng)正對照（PHA刺激）10μl，終濃度4ug/mL樣品負對照（不加刺激物）背景負對照（不含細胞，只加培養(yǎng)基和所有的檢測試劑）：100μl的U-Cytech無血清培養(yǎng)基設置2-4個孔的重復36編輯課件ELISPOT標準操作程序D2以前做的封閉，可加入200μl的U-Cytech無血清培養(yǎng)基，室溫靜置10分鐘，傾倒，然后再重復一次加入不同濃度的細胞，100μl/well，細胞在孔中的分布要盡量均勻加入刺激物（配制成10X終濃度，10μl/well）到實驗孔不要再震動或者拍擊ELISPOT板蓋上板蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)18-24hr在整個培養(yǎng)過程中避免移動、碰撞培養(yǎng)板。避免開關培養(yǎng)箱的箱門！

37編輯課件ELISPOT標準操作程序D3培養(yǎng)后操作

傾倒孔內的細胞及培養(yǎng)基，低滲法將細胞裂解：每孔加200μl冰冷的去離子水，將板置于冰上冰浴10分鐘200μl的PBST洗滌10遍，洗滌最后一遍之后，將板倒扣在吸水紙上拍干稀釋檢測抗體，每孔加入100μL生物素標記的檢測抗體，37°C1小時200μl的PBST洗滌5遍，洗滌最后一遍時，將PVDF膜板的背面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護層，將板倒扣在吸水紙上拍干38編輯課件ELISPOT標準操作程序D3在一個淺托盤中盛上干凈的PBST，將膜板的底面浸入，輕輕搖晃幾次即可。（注意：一定要將膜的背面和塑料保護層上的液體甩干之后，再合攏，蓋上，不要傷害到膜?。?9編輯課件ELISPOT標準操作程序D3稀釋酶標的鏈霉親和素，每孔加入100μl，37°C1小時200μl的PBST洗滌5遍，洗滌最后一遍時，將PVDF膜板的背面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護層，將板倒扣在吸水紙上拍干解凍已配好的顯色液，每孔加入100μl的顯色液，室溫靜置20-30分鐘，注意避光。40編輯課件ELISPOT標準操作程序D3待斑點生長到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過程將板倒扣在吸水紙上，拍干細小的水珠，之后取下保護層，放在通風的地方，室溫靜置10-30分鐘，讓膜自然晾干注意不要將板放到烤箱內，防止膜發(fā)脆、破裂!ELISPPOT板置于BiosysBioreader4000PRO自動讀板儀內，調節(jié)好合適的參數(shù)，斑點計數(shù)，并記錄斑點的各種參數(shù)，作統(tǒng)計分析。41編輯課件結果判定儀器先以高分辨率鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影像；這些影像可以進一步使用手動、或是自動方式計算斑點數(shù)目使用ImmuneSpot分析軟件，可以先設定條件，然后同時分析斑點的大小，以推估細胞因子分泌的多寡。克服傳統(tǒng)顯微鏡判讀方法耗費人力、及人為客觀性等缺點ImmunoSpot影像掃描分析儀可以提供不同的數(shù)據格式，包括未處理與處理過的膜表面影像、每個小孔中的斑點數(shù)目、每個小孔中的平均斑點數(shù)目、每個小孔中斑點大小的直方統(tǒng)計圖。42編輯課件結果判定計算機可以利用斑點的深淺、是否以中心為原點向四周減淡等特征對細胞分泌動力學特征進行分析43編輯課件技術優(yōu)勢------與ELISAELISA通過顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。ELISPOT也是通過顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過計算機輔助的分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）由于是單細胞水平檢測，ELISPOT比ELISA更靈敏，能從20萬-30萬細胞中檢出1個分泌該蛋白的細胞。捕獲抗體具有高親和力、高特異性、低內毒素的單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。44編輯課件技術優(yōu)勢------與有限稀釋法（limitingdilutionanalysis,LDA）

LDA：對特異性CTL細胞進行定量,免疫反應動力學和記憶毒性T淋巴細胞(memorialCTL,mCTL)亞群的細胞周期需高強度抗原刺激,這會加快效應CTL(eCTL)凋亡,且不能定量測定eCTL細胞數(shù)量或測定值偏低較繁瑣,培養(yǎng)時間可長達2～3周，而且很容易造成T細胞數(shù)量損失。45編輯課件技術優(yōu)勢------與四聚體法（Tetramer）MHC-Ⅰ類分子抗原肽四聚體法——定量檢測抗原特異性CTL的“金標準”優(yōu)勢：迅速、直接、靈敏且特異性強,即使當體內mCTL水平低于1%,用MHC-Ⅰ抗原肽四聚體法仍可直接測到準確的值,比LDA敏感度要高5～10倍該技術的困難：除了合成及穩(wěn)定MHCⅠ類分子的技術困難外,最主要缺點是表位的選擇。由于每次反應只能分析單一的抗原表位,而MHCⅠ類分子結合的各種表位,能否形成CTL反應,卻隨著基因背景及時間的變化而變化。優(yōu)勢表位的篩選可以通過Elispot來進行,但對整個肽庫進行掃描,并不容易。當然,生物信息學的運用對表位的篩選有很大的幫助。有研究結果表明,并非所有經過Tetramer鑒定的陽性細胞都有確切的功能,Tetramer陽性的細胞數(shù)是用ELISPOT分析能分泌INF2γ細胞數(shù)的10倍,其中很多是不表現(xiàn)功能的惰性細胞,可能代表了記憶型CTL前體細胞。46