1-DNA重組技術(shù)的基本工具-課件

1-DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程的概念DNA重組技術(shù)基因DNA分子水平剪切→拼接→導(dǎo)入→表達2

自然界是否存在一種生物的DNA進入另一生物的情況？噬菌體侵染細菌的實驗。思考：3基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路基礎(chǔ)理論

艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體。4基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路基礎(chǔ)理論

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。5基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路基礎(chǔ)理論梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制6基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路基礎(chǔ)理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制7科技探索之路基礎(chǔ)理論1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實驗加以證明?；A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程8大家應(yīng)該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流9科技探索之路1)1967年基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2)1970年工具酶的發(fā)現(xiàn)3)1977年DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明4)1972年DNA體外重組的實現(xiàn)5)1973年重組DNA表達實驗的成功6)1980年第一例轉(zhuǎn)基因動物問世7)1988年P(guān)CR技術(shù)的發(fā)明基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程10第一節(jié)

DNA重組技術(shù)的基本工具一.準(zhǔn)確切割DNA的工具（“分子手術(shù)刀”）

——限制性核酸內(nèi)切酶二.DNA片段的連接工具（“分子縫合針”）

——DNA連接酶三.基因轉(zhuǎn)移工具（“分子運輸車”）

——基因進入受體細胞的載體11⒈主要來源：主要從原核生物中分離純化思考一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”根據(jù)你所掌握的知識你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使之失效，從而達到保護自身的目的。12⒉種類與命名：

現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)核酸切酶(限制酶)。

練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）SmaⅠ大腸桿菌（EscherichiacoliR）EcoRⅠ133.作用特點（1）識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列例如：大腸桿菌的EcoRⅠ限制酶只能識別GAATTC序列，一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”（2）在特定的位點切割DNA分子。并在G和A之間切開?！禺愋?4限制酶的識別序列：

能被限制性內(nèi)切酶特異性識別的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。“分子手術(shù)刀”---限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成,少數(shù)的識別序列由4、5或8個核苷酸組成15切割DNA分子實質(zhì)是斷開兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。16產(chǎn)生黏性末端或平末端一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”4.作用結(jié)果：EcoRⅠ限制酶

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。17SmaⅠ平末端平末端一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口是平整的，這樣的切口叫平末端。18⒈主要來源：⒉種類與命名：⒊作用特點（特異性）4.限制酶識別序列5.作用結(jié)果：識別特定核苷酸序列，并且使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要從原核生物中分離純化產(chǎn)生黏性末端或平末端大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成少數(shù)的識別序列由4、5或8個核苷酸組成“分子手術(shù)刀”---限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)19……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來源的DNA片段混合如何將不同種來源的DNA片段連接起來？生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切201.作用:把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來。2.作用原理：催化磷酸二酯鍵形成二、DNA連接酶——“分子縫合針”213.種類：（1）E·coliDNA連接酶（2）T4DNA連接酶兩種酶的區(qū)別：E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別二、DNA連接酶——“分子縫合針”22

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵23

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶24DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?形成磷酸二酯鍵以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸連接成一條互補的DNA鏈將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，不需要模板需要不需要單個脫氧核苷酸DNA分子片段25⒈運載體必備的條件：

⑴在受體細胞中能自我復(fù)制并穩(wěn)定保存

⑵有1個至多個限制酶切割位點

⑶有特殊的標(biāo)記基因，便于鑒定和選擇

⑷對受體細胞的生存無決定性作用⒉常用運載體：

⑴質(zhì)粒

⑵λ噬菌體的衍生物

⑶動植物病毒三、基因進入受體細胞的載體——

“分子運輸車”26常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別

常存在于原核細胞中，是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于擬核之外能自我復(fù)制的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。27282748361529思考與探究P7（2）2、為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？

通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。303、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？不能，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：思考與探究P7311）載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或可整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3