免檢流式細胞術（免疫學檢驗課件）

流式細胞術流式細胞術（FCM）的基本含義。流式細胞儀的基本結構及檢測原理。FCM單細胞標本的制備及熒光染色的主要方法。FCM的檢測分析方法。流式免疫熒光技術的應用。本章要點FCM的檢測原理

1FCM的關鍵技術

2FCM的檢測分析

3FCM的臨床應用

4前言流式細胞術（flowcytometry，FCM）是以流式細胞儀作為檢測工具，通過檢測標記的熒光信號，在功能水平上對懸液中的單細胞或其他生物粒子進行高速、逐一的細胞定量分析和分選技術。FCM檢測對象：細胞及其參數(如DNA含量、細胞體積、蛋白質含量、酶活性、細胞膜受體和表面抗原等)。FCM優(yōu)點：具有速度快、精度高、準確性好等。第一節(jié)FCM的檢測原理激光光電倍增管放大電路激光技術單克隆抗體技術細胞熒光化學技術光電測量技術電子物理技術電子計算機技術能對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞或生物顆粒同時進行多參數、快速定量分析和分選一、細胞分析原理

熒光顯微鏡技術單克隆抗體與熒光染料技術計算機技術處理光信號激發(fā)光源改為激光提高檢測靈敏度和特異性

提高檢測速度和統(tǒng)計分析精確性

（一）流式細胞儀基本結構

包括流動室和液流驅動系統(tǒng)流動室

由樣品管、鞘液和噴嘴等組成，是流式細胞儀的核心組件，在這里待測樣品與激光相交。

液流驅動系統(tǒng)包括壓縮空氣泵、壓力感受器、鞘液過濾器和樣品壓力調節(jié)器等。

1.液流系統(tǒng)流動室和液流驅動系統(tǒng)

作用：依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)。

FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個細胞流）樣本管鞘液管由激光光源、分色反光鏡、光速成形器、透鏡組和光電倍增管組成。流式細胞儀的測定是基于對光信號的檢測來實現的，因此光學系統(tǒng)是流式細胞儀中最為重要的一個系統(tǒng)。2.光學系統(tǒng)光學系統(tǒng)是進行實驗數據的分析、存儲、顯示的重要組件，由計算機及相應的軟件組成。作用：將產生的各種光信號成比例的轉換成電信號，進行數字化處理后轉入電子計算機進行數據采集和分析。3.數據處理系統(tǒng)流式細胞儀的數據參數前向散射光側向散射光熒光前向散射光檢測器

側向散射光檢測器

在激光束的正前方，又稱小角散射FSC信號的強弱與細胞的體積大小成正比，檢測的是細胞或其他顆粒的表面屬性在激光束的垂直方向，又稱90°散射SSC信號的強弱與細胞內顆粒結構的質量成正比，用于檢測細胞內部結構屬性前向散射光示意圖細胞大小側向散射光示意圖結構復雜程度血液白細胞散點圖淋巴細胞單核細胞粒細胞熒光信號：由待檢細胞上標記的特異性熒光染料受激光激發(fā)后產生。特異性熒光探針與單克隆抗體結合后，與細胞膜或細胞內的靶抗原結合，經染色后的細胞在激光的照射下，熒光染料發(fā)出比激發(fā)光波長長的熒光，檢測熒光素信號的強弱就可以了解抗原表達量的多少。高度聚焦激光束

（二）細胞分析原理

單細胞懸液

特異性熒光染料標記抗體染色流動室檢測區(qū)

恒定氣壓鞘液噴出

高壓

細胞單行排列

特異性熒光

+散射光

入射光束與液柱垂直方向前向小角方向熒光信號

側向散射光信號

前向散射光信號

熒光檢測系統(tǒng)

散射光檢測系統(tǒng)

前向散射光感受器

光信號光信號電信號計算機系統(tǒng)轉換

放大

細胞分析原理

不同光信號的轉換二、細胞分選原理

（一）分選的基本原理

流式細胞儀的分選是指從細胞群體中分離出感興趣的細胞，檢測的任意參數都可作為分選時指定的細胞的依據。分選的方式有捕獲式分選和電荷式分選，目前應用最多的是電荷式分選。電荷式分選基本原理（二）FCM分選指標

細胞分選對儀器的性能要求較高分選是流式細胞儀的重要功能之一分選功能的裝置較為復雜

分選指標分選速度

分選純度

分選收獲率

488nm激光+-前向散射光檢測器

熒光檢測器電磁場單個細胞被分類進入檢測管流式細胞儀分選系統(tǒng)三、流式細胞術的特點

速度快

對單個細胞或生物顆粒進行快速、逐個檢測，測量速度可以達到每秒數千個甚至上萬個細胞靈敏度高

每個細胞上只需帶有1000～3000個熒光分子即能檢測出來多參數多色熒光染色同時分析單個細胞或生物顆粒的多種特征精度高

在細胞懸液中檢測細胞，比其他技術的變異系數更小，分辨率更高純度高

可以把指定特征的細胞分選出來，分選細胞的純度可達到99%以上無害性

能保持細胞不被破壞，進行無害性定性或定量分析和分選（一）影響因素

溫度

pH值

非特異熒光固定劑

四、流式細胞術定量分析的注意事項

（二）質量控制

環(huán)境要求

儀器校正

樣本要求

設置對照

數據的獲取和分析確保標本上機檢測前的濃度為1×106/ml，細胞濃度過低可直接影響檢測結果。封閉非特異性結合位點，尤其在間接免疫熒光標記時必不可少。熒光抗體染色后需充分洗滌，注意混勻、低速離心，減少重疊細胞和細胞碎片。注意避光染色，保證細胞免疫熒光的穩(wěn)定。設置對照樣品，應采用與抗體來源同型匹配的無關對照和熒光抗體的本底對照。判定結果時，應注意減去本底熒光，使免疫熒光的定量分析更準確。（三）注意事項

第二節(jié)FCM的關鍵技術一、FCM單細胞標本的制備

流式細胞術的測定樣本必須保證是單細胞懸液，這是進行流式細胞分析的最關鍵的第一步。單細胞懸液大多來自生物樣品，主要來源于培養(yǎng)細胞、血液、新鮮實體組織及石蠟包埋組織等，不同來源的樣本制備單細胞懸液的方法也不同。以某一類細胞群為檢測對象，因此為了減少檢測時的干擾因素，常常在測定前把某一細胞群（單核細胞或血小板）從血液分離出來，制成單細胞懸液再進行標記染色。制備單個核細胞懸液的最常用方法是單次密度梯度離心法（一）外周血單細胞懸液制備

（二）培養(yǎng)細胞的單細胞懸液制備

懸浮生長

貼壁生長

反復吹打

分散細胞

常規(guī)洗滌

低速離心

蛋白酶消化

機械吹打

細胞脫落

低速離心

漂洗重懸

單細胞懸液

培養(yǎng)細胞一般是以懸浮或貼壁的方式生長將新鮮實體組織進行單細胞懸液的制備是一項困難而復雜的技術。理想的狀態(tài)是既要達到分離細胞的目的又要不損傷細胞。

最常用的方法是酶消化法、機械法、化學處理法和表面活性劑處理法等。（三）新鮮實體組織單細胞懸液制備

該制備方法的建立擴大了流式細胞術的應用范圍，有利于進行臨床回顧性研究和利用。常用的方法有二甲苯脫蠟法、組織清潔劑脫蠟法和甲氧-雙氧水處理法。石蠟切片一般適宜厚度是40μm~50μm，脫蠟須徹底，獲取組織后，用酶進行消化處理，消化時間不宜過長，以免細胞核被消化溶解，經過濾、漂洗后即可獲得單細胞懸液。（四）石蠟包埋組織單細胞懸液制備

FCM主要的信號參數包括散射光信號和熒光信號，熒光染色是保證熒光信號產生的關鍵步驟。目前間接免疫熒光染色已較少用；直接免疫熒光染色以雙色以上分析較為常用。單色免疫熒光多用于單克隆抗體特異性較高、單一細胞群的抗原檢測，多色免疫表型分析宜采用同一品牌的試劑。二、FCM樣品的熒光染色

（一）FCM常見熒光染料的種類和特性應有較高的量子產額和消光系數對488nm波長的激發(fā)光有較強的吸收能力發(fā)射光與激發(fā)光之間應有較大波長差容易與被標記的單克隆抗體結合而不影響抗體自身的特異性。理想的熒光染料需要具備：常用熒光染料的特性和應用熒光染料激發(fā)光(nm)發(fā)射光(nm)顏色應用FITC488525綠色免疫熒光PE（RDI）488575橙色免疫熒光PE-Cy5488670紅色免疫熒光PE-Cy7488755深紅色免疫熒光ECD488620橙紅色免疫熒光PI488620橙紅色DNA染色APC633670紅色1.直接免疫熒光染色法

優(yōu)點

操作簡單，方法簡便、快速特異性強，與其他抗原交叉染色較少反應中只有兩種因素（細胞與抗體）參與，結果判斷較簡單（二）FCM熒光染色的主要方法一抗二抗2.間接免疫熒光染色法優(yōu)點

敏感性高具有更廣的通用性缺點

①操作步驟繁瑣，干擾因素較多②易產生非特異性染色，結果判斷有時比較困難多色流式細胞儀的開發(fā)促進了新的熒光染料的合成及抗體標記物的發(fā)展。多色標記簡便、省時、節(jié)約成本，但對操作人員的要求較高。試劑的選擇還需結合儀器的配置考慮。3.多參數分析時熒光抗體的組合標記自發(fā)熒光：未經熒光標記的細胞受到激光照射后所發(fā)出的熒光。每種細胞群都有不同水平的自發(fā)熒光，如淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等。自發(fā)熒光易引起信號干擾，出現假陽性結果，在實際臨床檢驗工作中應注意區(qū)別。（三）自發(fā)熒光流式細胞儀測定樣品時，針對每個細胞都會記錄各個光電器件所采集的檢測信號，這些信號經過模/數電路轉換后，全部結果傳輸到計算機中存儲并分析。目前所使用的流式細胞儀為了對獲取的數據更直觀地進行觀察和分析，多用圖形化的方式對數據進行顯示。第三節(jié)FCM的檢測分析方法

X軸代表一維參數。以通道表示，其與光強度之間的關系依放大器的性質而定，通道右側信號的光強度明顯高于左側，越靠右側光亮度越強。一、單參數直方圖

Y軸代表顆粒計數，反映相同熒光或散射光強度的顆粒相對數量的多少，可用于定性、定量資料的分析。單參數分析只能表達具有相同特性細胞數量與光信號強度的關系。

雙參數直方圖是一種細胞與雙測量參數的圖形，X軸與Y軸分別代表一種參數。雙參數信號常采用對數信號，最常用的基本表示法是用點密圖來顯示。如果把一個散點圖分別投影到X軸和Y軸，可得到兩個單參數直方圖。臨床實踐中常以多個散點圖聯合分析。二、雙參數直方圖

X軸反映SSC的信號強弱Y軸反映FSC的信號強弱

X軸反映FITC熒光信號強弱Y軸反映PE熒光信號強弱

點圖把代表相同細胞數目的點依次連接起來形成密閉曲線，越在里面的曲線代表的細胞數目越多，越密集的區(qū)域也就是細胞數目變化最快的區(qū)間。二維等高圖三維坐標均為參數（散射光或熒光）而非細胞數對復雜的細胞亞群觀察更為直觀、準確，但對其數據的統(tǒng)計分析較難三、三參數直方圖FCM常常需要分析三個以上的參數，但軟件技術能夠無法顯示四維空間結構。隨著FCM多色熒光信號檢測的發(fā)展，所得到的熒光信號和散射光信號需根據需要進行組合分析以獲得所需的信息。多參數分析能夠同時比較各種細胞的不同抗原表達水平，可以統(tǒng)計出多種數據。四、多參數組合分析

指同一張單參數或雙參數直方圖中根據信號的強弱來劃定分析區(qū)域，從而計算分析區(qū)域內的細胞數量。Gate設置2Region設置

1指在某一張選定參數的直方圖上根據該圖的細胞群分布選定要分析的特定細胞群，并要求該樣本的所有其他參數組合的直方圖只體現該群細胞的分布情況。Region設置

Gate設置

淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)中的一群重要細胞群，是執(zhí)行免疫功能和參與免疫調節(jié)的免疫活性細胞，主要分為T細胞、B細胞和NK細胞3大類。不同淋巴細胞表達的CD抗原都有獨自的抗原特性，在臨床疾病發(fā)生過程中對各淋巴細胞的CD抗原進行測定，對于判斷機體免疫功能狀態(tài)、了解免疫相關疾病的發(fā)病機制具有十分重要的意義。第四節(jié)FCM的臨床應用

一、淋巴細胞亞群分析采用三色標記的單克隆熒光抗體，可對T細胞亞群進行分類。Th細胞表達CD3+CD4+CD8-Tc細胞表達CD3+CD4-CD8+

（一）T淋巴細胞及亞群分析外周血中成熟B細胞特有的標志是BCR。成熟B細胞主要表達CD19、CD20、CD21、CD22分子，同時檢測CD25分子，可進一步觀察B細胞活化狀態(tài)。（二）B淋巴細胞及亞群分析（三）NK細胞分析

自然殺傷細胞主要的表面標志包括CD16、CD56。目前臨床上常采用三色熒光抗體標記將CD3-CDl6+CD56+淋巴細胞定為自然殺傷細胞。白血病免疫表型分析是利用單克隆抗體檢測白血病細胞表面和胞漿內的抗原，通過分析其表型以了解白血病細胞的分類和分期，是研究白血病分化抗原和白血病分類診斷的重要手段。白血病細胞可用造血細胞分化抗原來標記檢測?？蓹z測出具有異常表型的淋巴細胞，由此可用于對各型白血病的鑒別診斷二、白血病免疫表型分析

正確區(qū)別急性髓細胞性白血病（AML）和急性淋巴細胞性白血?。ˋLL）。正確鑒別AML中的M0、M6、M7型。正確診斷雙系列型或雙表型白血病。正確診斷少見、疑難白血病。發(fā)現僅表達個別次要非本系列相關抗原的白血病。FAB分類CD13CD33CD11bCD14HLA-DRCD34CD117MPOM0++/---++++M1++-/+-++++M2++--++/-++M3++----++M4+++++/-+/-++M5a+++/-+/-+/-+-/+M5b++++++-/+M6+/-+/-+/--+/--+M7-+/---++?-典型AML的免疫表型特點三、免疫血液病中的應用PNH是一種以補體介導的血管內溶血為特征的獲得性造血干細胞克隆性疾病。PNH患者其紅細胞、粒細胞、淋巴細胞表面的CD55、CD59抗原明顯減少或消失。臨床上常常通過流式細胞術檢測血細胞上CD55和CD59的表達，作為PNH的診斷和療效的評估依據。1.PNH診斷

PNH診斷