免疫組織化學檢驗技術（免疫學檢驗課件）

第二十二章

免疫組織化學檢驗技術本章要點免疫組織化學檢驗技術又稱免疫細胞化學檢驗技術---是利用標記的特異性抗體（或抗原）與組織細胞內(nèi)抗原（或抗體）進行的抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對組織和細胞抗原進行定性、定位、定量測定的免疫檢測方法。本章要點免疫組化的檢測原理組織抗原抗體標記物1、熒光2、酶3、親和技術4、金標標記抗體本章要點免疫組化的檢測原理組織抗原標記抗體+標記的抗原抗體物本章要點免疫組化的檢測原理間接法直接法兩種免疫細胞化學反應方法CONTENTS目錄免疫組化檢驗技術基本知識酶免組織化學檢驗技術化學發(fā)光酶免疫分析熒光免疫組織化學檢驗技術其他免疫組織化學檢驗技術0102030405免疫組化檢驗技術基本知識01免疫組化檢驗技術基本知識免疫組化全過程抗原的提取與純化免疫動物或細胞融合，制備特異性抗體及純化標記物與抗體集合形成標記抗體標本的處理抗原抗體反應和呈色反應顯微鏡下觀察結果免疫組化檢驗技術基本知識一、標本制作標本制作是獲得良好的免疫細胞組織化學分析的保障，良好的細胞和組織學結構將有助于抗原的準確顯示和定位。（一）標本的主要來源主要有：活體組織；各種體液及穿刺液；培養(yǎng)細胞等。123免疫組化檢驗技術基本知識（二）標本的固定與保存組織材料的固定目的防止組織細胞的死后變化，以保持其固有形態(tài)。使細胞內(nèi)的蛋白質等各種抗原成份轉變成不溶性物質，以保持它原有的結構。使組織中的各種物質沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不同的折射率，以便染色后易于鑒別和觀察。1免疫組化檢驗技術基本知識（二）標本的固定與保存組織材料的固定目的固定劑兼有硬化作用，使組織硬化，便于制片。防止細胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結構。經(jīng)過固定的組織能對染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便于辨認。1免疫組化檢驗技術基本知識固定劑的選擇最佳固定劑的標準最好地保持細胞和組織的形態(tài)結構。最大限度地保存抗原的免疫活性。2免疫組化檢驗技術基本知識固定方法固定方法常用浸泡法—主要適用于活檢和手術標本以及其它不能進行灌注的組織固定。灌注法—適用于動物實驗研究。3免疫組化檢驗技術基本知識各種抗原的固定抗原固定劑固定溫度與時間蛋白質95%乙醇室溫，3~15min免疫球蛋白丙酮4℃，30min酶四氯化磺4℃，30min激素1%聚甲醛4℃，4h~5h細菌丙酮、甲醇室溫，3~10min病毒丙酮、無水乙醇室溫，5~10min四氯化磺4℃，30~60min類脂質10%甲醛室溫，3~10min細胞懸液1%聚甲醛室溫，2min免疫組化檢驗技術基本知識（三）玻片的處理玻片的處理是做好免疫組化染色的重要步驟之一。一般用免疫組織化學的載玻片均需涂一定的黏合劑，常用的切片黏合劑有樹脂膠、多聚賴氨酸和防脫片劑。（四）切片方法的選擇免疫組化檢驗技術基本知識冰凍切片和石蠟切片時免疫組化中最常用的制片方法。冰凍切片制片方法簡單，可避免石蠟切片因固定、脫水、浸蠟等步驟造成的抗原損失。迅速冷凍可防止冰晶的形成，避免組織細胞結構的破壞。免疫組化檢驗技術基本知識冰凍切片和石蠟切片時免疫組化中最常用的制片方法。石蠟切片觀察組織細胞結構的理想方法，可用于陳舊石蠟包埋材料的回顧性免疫組化研究，切片薄，有連續(xù)性，蠟塊可長期保存，但是抗原的保存量不如冰凍切片。免疫組化檢驗技術基本知識二、抗原處理（一）進行抗原的暴露和修復的原因固定液的影響；抗體制備的影響。12免疫組化檢驗技術基本知識（二）抗原的暴露主要采用酶消化的方法：在選擇酶消化時，應針對要顯示的不同的抗原成分而選用不同的酶。在日常工作中用胰蛋白酶消化即可。12免疫組化檢驗技術基本知識（三）熱誘導的抗原修復抗原修復是以高溫、高壓對常規(guī)固定石蠟切片進行抗原修復以提高抗原抗體的陽性檢出率：微波處理法；水浴鍋法；壓力鍋法。123免疫組化檢驗技術基本知識三、抗體處理（一）抗體的選擇具有高度特異性和穩(wěn)定性的優(yōu)質抗體。（二）抗體的稀釋抗原抗體反應須有適當?shù)谋壤^量或不足均不能達到預期結果。（三）抗體的合理保存抗體是免疫組織化學技術的首要試劑。要特別注意保持抗體的生物活性。免疫組化檢驗技術基本知識四、常用標記物（一）熒光素如：異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明。（二）酶如：辣根過氧化物酶(HRP)。（三）生物素-親和素系統(tǒng)（四）免疫金標記技術（五）免疫鐵蛋白技術免疫組化檢驗技術基本知識五、免疫組織化學技術的結果判斷（一）對照染色設計為了保證免疫組織化學染色的準確性，證明和肯定陽性結果的特異性，排除某些非特異性染色，通常需針對第一抗體設立對照。陽性對照用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行免疫組織化學染色。目的是證實所用免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性的可能。1免疫組化檢驗技術基本知識陰性對照用確證不含已知抗原的標本作對照，應呈陰性結果，稱陰性對照。目的是排除假陽性。2免疫組化檢驗技術基本知識陰性試劑對照是指用于證實在免疫組化染色中所用試劑（尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性）而設立的同步免疫染色對照，包括有：空白對照、替代對照、吸收試驗和抑制試驗等。自身對照是指在同一標記切片上的自身組織成分的陰性背景對照。34免疫組化檢驗技術基本知識（二）陽性結果陽性細胞的顯色可位于細胞膜、細胞質和細胞核。免疫顯色強度和陽性細胞密度是定性、定量指標。陽性細胞的著色形態(tài)（如胞膜型、胞核型、胞質(漿)型等）及組織分布特點（如局灶型、彌漫型、片塊型等）主要是定位指標。哪怕只有少數(shù)細胞陽性（只要是抗原所在部位）也應視為陽性表達。免疫組化檢驗技術基本知識（三）陰性結果陰性結果不能簡單視為抗原不表達，由于染色方法靈敏度有高低之分，有時可因靈敏度不夠，而導致陰性反應。（四）特異性顯色和非特異性顯色的鑒別分布位置特異性反應必須分布于特定抗原部位。非特異性反應無一定的分布規(guī)律。1免疫組化檢驗技術基本知識顯色強度特異性反應由于細胞內(nèi)抗原含量不同，顯色強度不一。陽性細胞的染色常定位于細胞，并與陰性細胞間有明顯間隔。而非特異性染色常不限于單個細胞，常為成片的細胞自身對照。其他在過大的組織塊，中心固定不良也會導致非特異性顯色。23免疫組化檢驗技術基本知識染色特異性染色非特異性染色顯色部位特定細胞或間質細胞和間質均勻染色或更強顯色定位特定，具有結構性無特定部位，無結構性顯色程度同一部位呈不同程度顯色無分布規(guī)律，某一片均勻著色免疫組化檢驗技術基本知識六、質量控制（一）試劑質量控制質量控制是免疫組織化學檢驗技術取得滿意結果的必要條件?？贵w的質量是免疫組織化學染色成功的關鍵（二）操作過程質量控制（三）儀器設備和器具的質量控制實驗操作標本的質量控制酶免組織化學檢驗技術02酶免組織化學檢驗技術酶免組織化學檢驗技術是在一定條件下，應用酶標抗體（抗原）與組織或細胞標本中的抗原（抗體）發(fā)生反應，然后加入酶的底物，催化底物顯色，借助光鏡或電鏡，就可識別出標本中抗原（抗體）的分布和性質；也可通過圖像分析技術達到定量的目的。酶免組織化學檢驗技術一、標本制作常用的標本有組織切片、組織印片和細胞涂片。酶免組織化學檢驗技術可分為：酶標記抗體免疫組織化學染色法；非標記抗體酶免疫組織化學染色法。酶免組織化學檢驗技術二、酶標記抗體的免疫組化染色法酶標記抗體的免疫組織化學染色法是借助交聯(lián)劑的共價鍵作用將酶直接連接在抗體（或抗抗體）上，酶標抗體（或抗抗體）與組織內(nèi)特異抗原或抗原抗體復合物反應后，通過酶對底物的催化作用，生成不溶性有色產(chǎn)物并沉淀在特定位置，達到對抗原定性、定位、定量檢測的目的。（一）原理酶免組織化學檢驗技術（二）技術類型（三）方法評價直接法形成抗原一抗體一酶復合物。間接法形成Ag-Ab1-Ab2﹡E復合物。酶標抗體三步染色法為間接法的改良法形成Ag-Ab1-Ab2﹡E-Ab3﹡E復合物。123酶免組織化學檢驗技術三、非標記抗體酶免疫組化染色法該技術首先用酶免疫動物，制備效價高、特異性強的抗酶抗體（Ab3），將酶與Ab3結合形成復合物，然后利用第二抗體（Ab2）作橋，Ab2既可與Ab3的Fc段結合，又可與結合在組織抗原上的第一抗體（Ab1）的Fc段結合，經(jīng)酶催化底物的顯色反應，達到對抗原的檢測。（一）原理酶免組織化學檢驗技術（二）技術類型酶橋法用辣根過氧化物酶（HRP）免疫動物（如兔）制備抗HRP的抗體（Ab3），經(jīng)Ab2（如羊抗兔）作橋，將結合在組織抗原上的Ab1(兔抗相應組織抗原的抗體)與Ab3連接起來，最后將HRP與Ab3結合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP復合物，加底物顯色。1酶免組織化學檢驗技術酶免組織化學檢驗技術PAP法即過氧化物酶（P）-抗過氧化物酶（AP）法，為酶橋法的改良，技術要點基本上與酶橋法相同，但該法將抗酶抗體（抗過氧化物酶（AP））與酶（過氧化物酶（P））制成了可溶性復合物（PAP）,該復合物由2個抗酶抗體和3個過氧化物酶分子組成，呈五角形，非常穩(wěn)定。通過橋抗體（Ab2）將特異性識別組織抗原的抗體（Ab1）與PAP復合物的抗酶抗體連接起來。2酶免組織化學檢驗技術酶免組織化學檢驗技術酶免組織化學檢驗技術雙橋PAP法該法是PAP法的改良，通過兩次連接橋抗體和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP復合物，在抗原抗體復合物上結合了比PAP法更多的酶分子，大大增強了方法的敏感性。3酶免組織化學檢驗技術APAAP法APAAP法就是以堿性磷酸酶代替HRP建立的堿性磷酸酶（AP）-抗堿性磷酸酶（AAP）法，簡稱APAAP法。技術要點與PAP法相似。4酶免組織化學檢驗技術該技術既可檢測抗原，又可檢測抗體。由于酶不是標記在抗體上，而是經(jīng)抗原（酶）抗體反應與抗酶抗體結合，避免了酶標抗體的缺點，提高了方法的敏感性。尤其是雙橋PAP法，是當今免疫組化技術中敏感性較高的方法。（三）方法評價酶免組織化學檢驗技術四、臨床應用酶免疫組織化學檢驗技術主要用于組織切片或其它抗原的定性、定位、定量檢測。組織切片中各類抗原性物質，如各類蛋白質、酶、激素、細胞、病毒、腫瘤抗原、漿細胞中的免疫球蛋白、各種多肽、細胞表面標志等均可檢測。熒光免疫組織化學檢驗技術03熒光免疫組織化學檢驗技術利用抗原抗體特異性結合的原理，先用熒光素標記已知抗體并以此作為探針，檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后，即會發(fā)出一定波長的熒光，進而對組織中的某種抗原進行定性、定位和定量分析。熒光免疫組織化學檢驗技術一、標本制作常見的臨床標本材料主要有組織、細胞和細菌三大類，按不同標本性質可制作涂片、印片或組織切片等。（一）載玻片和蓋玻片的處理載玻片和蓋玻片要厚薄均勻、潔凈及透光性好。熒光免疫組織化學檢驗技術（二）制片組織切片：組織材料可制備成冰凍切片或石蠟切片。印片：組織材料也可制成印片。涂片：細胞或細菌要制成涂片，涂片應薄且均勻。123熒光免疫組織化學檢驗技術（三）標本的固定防止細胞或切片從玻片上脫落。去除妨礙抗原抗體結合的類脂。便于保存。除活細胞外，其他標本應在染色前以適當?shù)姆绞焦潭ā?23主要目的是：熒光免疫組織化學檢驗技術（四）標本片的保存固定好的標本片應盡快熒光染色檢查，如需保存，置-20℃下低溫干燥保存。熒光免疫組織化學檢驗技術二、熒光抗體標記及染色熒光抗體是熒光免疫技術的關鍵試劑，是將熒光素與特異性抗體通過共價鍵的方式結合而成。其制備過程通常包括抗體的標記、純化和鑒定三步。在已固定的標本上滴加經(jīng)適當稀釋的熒光抗體，置于帶蓋的濕盒內(nèi)，37℃溫育30min。檢測不耐熱抗原以4℃過夜為宜。溫育后充分洗滌、干燥、鏡檢。熒光免疫組織化學檢驗技術三、臨床應用此外還應用于HLA、腫瘤組織中的腫瘤抗原、組織中的免疫球蛋白和補體組分、激素和酶的定位等。在自身免疫性疾病中的應用。各種病原微生物的快速檢查和鑒定。寄生蟲感染的診斷。白細胞分化抗原的檢測。1234親和組織化學檢驗技術04親和組織化學檢驗技術親和組織化學是利用兩種物質之間的高度親和力而建立的一種方法。一些具有雙價或多價結合力的物質如生物素、葡萄球菌A蛋白、植物血凝素等，對某種組織成分具有高度親和力，可與蛋白質、糖類、熒光素和酶等多種類型的大小分子結合形成相應復合物，采用熒光顯微鏡、酶加底物的顯色反應等技術，在細胞或亞細胞水平進行對應親和物質的定位、定性或定量分析。用于親和組織化學的物質有生物素與親和素、植物凝集素與糖類、SPA與IgG、鏈霉親和素與生物素等。親和組織化學檢驗技術一、生物素-親和素法生物素可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素也稱抗生物素，每個親和素分子有生物素結合的4個位點，二者可牢固結合成不可逆的復合物。親和組織化學檢驗技術一、生物素-親和素法常用的技術類型有：1.標記親和素-生物素法（LAB法）將親和素與標記物（HRP）結合，一個親合素可結合多個HRP；將生物素與抗體（一抗與二抗）結合，一個抗體分子可連接多個生物素分子，抗體的活性不受影響。細胞的抗原（或通過一抗）先與生物素化的抗體結合，繼而將標記親和素結合在抗體的生物素上，如此多層放大，提高了檢測抗原的敏感性。親和組織化學檢驗技術親和組織化學檢驗技術2.橋連親和素-生物素法（BAB法）先使抗原與生物素化的抗體結合，再以游離親和素將生物素化的抗體與酶標生物素搭橋連接，也達到多層放大效果。親和組織化學檢驗技術3.親和素-生物素-辣根過氧化物酶復合物法（ABC法）此法是前兩種方法的改進，即先按一定比例將親和素與酶（辣根過氧化物酶）標生物素結合在一起，形成親和素-生物素-辣根過氧化物酶復合物（ABC復合物），當其與檢測反應體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化第二抗體（間接法）相遇時，ABC中未飽和的親和素結合部位即可與抗體上的生物素結合，最終形成晶格樣結構的復合體，其中網(wǎng)絡了大量酶分子，加底物顯色，可大大提高檢測抗原的靈敏度。親和組織化學檢驗技術親和組織化學檢驗技術SPA具有和人及許多動物如豚鼠、豬、小鼠、猴等的IgGFc結合的能力，這種結合不會影響抗體的活性。每個SPA分子可同時結合兩個IgG分子，也可一方面同IgG相結合，一方面與標記物如熒光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等相結合。二、SPA法親和組織化學檢驗技術親和組織化學檢驗技術三、鏈霉親和素—生物素技術鏈霉親和素與生物素的結合是已知自然界中最強的非共價相互作用之一，其功能類似親和素。利用生物素結合的二抗與酶標記的鏈霉親和素蛋白就組成酶標鏈霉親和素-生物素方法（LSAB）。親和組織化學檢驗技術三、鏈霉親和素—生物素技術LSAB法的特點：特異性強；分子量小，穿透力強，放大效應遠超ABC法，故其敏感性更強；等電點中性更適合組織，可明顯減少非特異性染色，低背景著色使特異性著色更清晰；操作時間縮短，更簡便。親和組織化學檢驗技術親和組織化學檢驗技術四、凝集素法一種凝集素具有專一性結合某種特異性糖基的能力，同時所有生物膜都含有一定量的糖類，后者主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。因此，凝集素可作為一種探針來研究細胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多價結合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結合，從而在光鏡或電鏡水平顯示其結合部位。親和組織化學檢驗技術一般認為細胞膜上特定的糖基可用以區(qū)別細胞的類型并反映細胞在分化、成熟和細胞病變中的變化。標記了相應示蹤物的凝集素可用來：①作為細胞分化和成熟的標記。②作為細胞特殊類型的標記。③腫瘤細胞伴有細胞膜的改變，細胞膜上的糖基也會產(chǎn)生相應的變化，也可用凝集素檢測出腫瘤細胞。親和組織化學檢驗技術常用下列染色法：直接法—標記物直接標記在凝集素上，使之直接與切片中的相應糖蛋白或糖脂相結合。間接法—將凝集素直接與切片中的相應糖基結合，而將標記物結合在抗凝集素抗體上。糖—凝集素—糖法—本法是利用過量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結合，經(jīng)沖洗后，凝集素上還存在未被