血清丙型肝炎病毒抗體檢測作業(yè)指導書

血清丙型肝炎病毒抗體檢測作業(yè)指導書（ELISA）

原理

在微孔條上預包被丙型肝炎病毒（HCV）重組嵌合抗原，采用ELISA法檢測丙型肝炎病毒抗體。樣品加入已有樣品稀釋液的包被抗原反應孔，在隨后的溫育過程中，若樣品中含特異抗體，則該抗體與包被抗原形成抗原抗體復合物被吸附到固相，再加入酶標記的第二，最終形成抗原-抗體-酶標二抗復合物，洗滌除去未結合的游離酶，加入顯色劑后顯色。

標本采集

2.1采集前病人準備：受檢者應空腹

2.2標本種類：血清或血漿

2.3標本要求：采集病人靜脈血2ml，室溫放置不超過4小時，分離血清備用。

標本儲存：2-8°C保存不應超過1周，-20°C不應超過3個月，-70°C長期保存，應避免反復凍融。

標本運輸：密封，室溫運輸。

標本拒收標準：污染、標本量不足、嚴重溶血或脂血標本不宜作此項檢測。

試劑

6.1試劑名稱：丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒

6.2試劑生產(chǎn)廠家：河南華美生物工程有限公司。

6.3包裝規(guī)格：96Test/Kit

6.4試劑盒組成：包被反應板，樣品稀釋液，酶標記抗體，陽性對照血清，陰性對照血清，濃縮洗滌液，底物A，底物B，終止液，封口膜，密封袋。

6.5試劑儲存條件及有效期：2-8°C避光保存，有效期6個月。

儀器設備

7.1儀器名稱：自動酶標儀

7.2儀器廠家：KHB

7.3儀器型號：ST360

操作步驟

8.1平衡：將試劑盒各組分取出，平衡至室溫（18-25°C），微孔板開封后，余者及時以自封袋封存。

8.2配液：濃縮洗滌液配制前充分搖勻（如有晶體應充分溶解），濃縮洗滌液和蒸餾水或去離子水按1：19稀釋后使用。

8.3編號：將微孔條固定于支架，按序編號。

8.4加樣品稀釋液：用加樣器在微孔反應條板孔中加入樣品稀釋液，每孔100l，空下四孔準備加對照。

8.5加標本和留空白：將每份待檢標本各10l分別加入已有樣品稀釋液的各孔中，留下一孔不加標本作空白對照，標好位置。

8.6加對照：在預先空下的四孔中用加樣器分別加入陰性對照一孔，陽性對照三孔，每孔100l，標好位置。對照應在所有標本加完以后再加，以保證閾值準確性。

8.7溫育（一）：充分混勻，加上封板膜，置37℃溫育30分鐘。

8.8洗滌（一）：用洗滌液充分洗滌5次，洗滌完扣干（每次應保持30-60秒的浸泡時間）。

8.9加酶：分別在每孔中加入酶標記抗體100l，輕拍混勻。

8.10溫育（二）：充分混勻，加上封板膜，置37℃溫育30分鐘。

8.11洗滌（二）：用洗滌液充分洗滌5次，洗滌完扣干（每次應保持30-60秒的浸泡時間）。

8.12顯色：每孔加入底物A、B各50l，輕拍混勻，置37℃暗處20分鐘。

8.13終止：每孔加終止液50l，混勻。

8.14測定：用酶標儀單波長450nm或雙波長450/630nm測定各孔OD值（用單波長測定時需設空白對照一孔，30分鐘內(nèi)完成測定，并記錄結果）。

結果判斷與分析

9.1臨界值（C.O.）的計算：臨界值＝0.05＋0.08×陽性對照孔OD值，陰性對照OD均值大于0.1時應重新試驗，小于0.05時以0.05計算。三孔陽性對照OD平均值大于陰性對照0.6以上，方可認為試劑盒有效；若一孔陽性對照OD值與三孔陽性對照OD平均值差異大于30%，該孔應舍棄，并用另兩孔重新計算OD平均值。

9.2結果判定：樣品OD值S/C.O>=1者為陽性

樣品OD值S/C.O<1者為陰性

10.質(zhì)量控制：每次用含2NCU/mlHCV抗體的質(zhì)控血清同步檢測，以S/CO值繪制質(zhì)控圖，S/CO值應在控制范圍內(nèi)。

11.參考范圍：陰性

12.臨床意義：在血清中抗HCV抗體陽性表明有急性或慢性HCV感染。

13.操作性能：靈敏度高。

14.方法局限性

14.1某些樣本會出現(xiàn)非特異性交叉反應。

14.2早期感染有可能漏檢。

14.3樣品顯色深淺與樣品中抗體的含量沒有一定正相關。

15.注意事項

15.1試劑的使用：整個檢測工作中應嚴格防止交叉感染，操作時必須帶手套，穿工作衣，嚴格健全和執(zhí)行消毒隔離制度。所有樣品，洗棄液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

15.2試劑的組分：本試劑盒中樣品稀釋液采用變色技術，在加原始血清或血漿標本后由黃綠色變?yōu)樘m紫色。非原始血清或血漿（如稀釋標本等）顏色變化不明顯或變?yōu)槠渌伾珵檎，F(xiàn)象。

15.3加樣：

15.3.1樣品稀釋液，待測標本，陰性對照和陽性對照均須用加樣器加注，并經(jīng)常核對其準確性。

15.3.2陰陽對照無須稀釋，直接用加樣器加100ul于各孔中。

15.3.3陰陽對照應在所有待測標本加完后再加，以保證閾值計算的準確性。

15.3.4先統(tǒng)一加顯色劑A，后統(tǒng)一加顯色劑B，兩者順序不要顛倒，顯色計時從加入第一孔顯色劑B開始。15.4洗滌時各孔均須加滿，防止孔口內(nèi)有游離酶未能洗凈。15.5溫育：注意控制反應時間，溫育30分鐘應控制在30±1分鐘內(nèi)，溫育20分鐘應控制在20±1分鐘內(nèi)，避免因反應時間延長造成整體顯色升高。15.6判斷：15.6.1測定結果的判定必須以酶標儀讀數(shù)為準。肉眼觀測顯色但OD值低于閾值的標本應判為陰性。15.6.2檢測時必須設置空白對照，并在結果分析時注意扣除空白值。15.7所有樣品都應按傳染源處理。15.8封口膜使用說明15.8.1微孔板拆封后，在取出當天所需的微孔條后，其余微孔條可以封口膜封存以避免受潮。在封存時，注意勿把封口膜粘貼到微孔條底部，以免影響其透光性。15.8.2微孔板溫育時，以封口膜覆蓋孔口，可避免其他因素對實驗帶來的非預期的影響。15.9不同品名、不同批號的試劑不可混用，以免產(chǎn)生錯誤結果。16.當檢測系統(tǒng)（儀器）不能工作時，所采取的補救措施：應保證所有操