西伯利亞鱘魚種質(zhì)鑒定方法

西伯利亞鱘魚種質(zhì)鑒定方法齡項目魚種8月齡成魚3齡親魚10齡全長體長體長:,不同年齡組的西伯利亞鱘魚體長和體重范圍見表2。

表2西伯利亞鱘各年齡組體長和體重范圍12345年齡體長40,5050,7070,8590,100100,120體重400,6001500,20003000,40005000,70007000,9000依據(jù)北方地區(qū)流水養(yǎng)殖模式,:自然條件下雌魚為19齡,20齡,雄魚為17齡,18齡;人工養(yǎng)殖條件下雌魚為7齡以上,雄魚為5齡以上。

繁殖周期:野生狀態(tài)下為2年以上;人工養(yǎng)殖條件下為1年以上。

懷卵量占體重的10%,30%。

=。

同工酶有6條酶帶,電泳圖及酶帶電泳模式圖見圖2。

圖2西伯利亞鱘肝臟酯酶電泳圖譜及模式圖1為電泳圖譜,擴增的結(jié)果如圖3所示。

圖3引物的擴增產(chǎn)物1為西伯利亞鱘池,2、3為西伯利亞鱘個體,,西伯利亞鱘在這14對引物的等位基因長度范圍見表3。

基因型數(shù)據(jù)分析結(jié)果見圖4。

表314個微衛(wèi)星引物序列及其在西伯利亞鱘的等位基因長度范圍位點名稱引物序列5’-3’等位基因長度范圍-1101::143,203-105::157,173-107::188,242-109::162,300-114::201,2513-117::191,25939::178,27640::384,41841:322,41019::120,13922::140,24239::119,14054::149,22168::128,250表示西伯利亞鱘品種池表示非西伯利亞鱘樣品圖4微衛(wèi)星標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)分析結(jié)果圖,。

,,低速1000離心3,棄上清。

%的生理鹽水洗滌三次后,在管中加滿70%的冷乙醇固定過夜,留意固定時使細(xì)胞充分散開。

,用酶10μ,20μ37;碘化丙碇50μ4染色30。

,加入適量的同樣處理的雞血紅細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀測定熒光強度,計算西伯利亞鱘魚與雞血細(xì)胞=熒光強度之比,即可得到鱘魚的含量。

。

,放血。

隨后解剖,,置于0生理鹽水中,用生理鹽水洗去組織血污。

然后稱重,放入玻璃勻漿器中,按1:5。

勻漿后在4冰箱放置1小時,4條件下,12000離心30,吸取上清液,,-80低溫冰箱中保存,供同工酶電泳分析用。

:-,分別膠為10%,濃縮膠為4%,小型雙垂直電泳槽電泳電壓100,電泳時間為9,10,之后改為電壓60,電泳時間為6,7。

:每槽加樣7μ,與等體積的溴酚藍(lán)蔗糖液混勻后加樣,在4冰箱中進行電泳。

:將α--***中,,。

凝膠板在37與染色液,保溫30,50,即可呈現(xiàn)棕紅色同工酶區(qū)帶,用蒸餾水沖洗3次后,7%醋酸固定。

,進行尾椎靜脈采血,抗凝,去除血漿后-20保存。

,置于75%酒精中常溫保存。

***仿法抽提個體基因組,利用紫外分光光度法確定濃度,將個體基因組液稀釋至濃度10μ;從每個個體基因組的稀釋液中取出10μ集于一管中,制成品種的池。

+擴增反應(yīng)總體積為25μ,其中包括摸板30、10緩沖液含、2μ、酶5μ、引物1法和微衛(wèi)星法分別使用各自的引物。

法反應(yīng)程序為:95預(yù)變性5,9445、3645、7290,45,72延長5。

微衛(wèi)星法反應(yīng)程序為:94變性45、退火45各引物退火溫度詳見表4、72延長45,40,72再延長5。

擴增反應(yīng)結(jié)束后,取5μ產(chǎn)物與1μ上樣緩沖液混合點樣,%瓊脂糖凝膠中電泳1,2,電壓80伏,紫外燈下觀看結(jié)果并拍照記錄。

表414個微衛(wèi)星位點重復(fù)序列結(jié)構(gòu)和退火溫度位點名稱重復(fù)序列結(jié)構(gòu)退火溫度-11015510-1055015-10757175-10955520-1146023-11755839581840616124165171953522525193955145455226855,94解鏈5,快速置于冰中冷卻至室溫,4保存?zhèn)溆谩?/p>

使用95%酒精把長板擦洗一遍,;再使用95%酒精把短板也擦洗一遍,待酒精揮發(fā)后涂200μ剝離溶液。

取6%變性聚丙烯酰***溶液80,加入60μ四***乙二***,180μ的10%過硫酸銨現(xiàn)用現(xiàn)配,充分混勻后灌入兩塊玻璃之間。

用鯊魚齒梳子的背面沿兩玻璃板縫隙水平插入膠中約5-6。

,拔出梳子,用自來水將玻璃板表面沖洗潔凈,擦干后裝在電泳槽上。

緩沖液,使緩沖液沒過短板。

1800恒壓預(yù)電泳20。

預(yù)電泳之后,在每個加樣孔中加入5μ解鏈后樣品,-。

電泳結(jié)束后,當(dāng)心分別兩塊玻璃板,將粘有凝膠的長板浸入染色液中,染色5-15,用蒸餾水漂洗30,浸入在顯影液中顯影至帶型清楚,再用蒸餾水漂洗5。

晾干長板后,拍照紀(jì)錄結(jié)果。

,基因型判讀同上述法。

使用熒光微衛(wèi)星引物進行擴增時,直接使用基因