轉(zhuǎn)座子在基因工程中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)座子在基因工程中的應(yīng)用第1頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.美國(guó)遺傳學(xué)家B．McClintock的轉(zhuǎn)座學(xué)說(shuō)2.轉(zhuǎn)座子類型3.轉(zhuǎn)座機(jī)制4.轉(zhuǎn)座子在基因工程中的應(yīng)用第2頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.美國(guó)遺傳學(xué)家B．McClintock的轉(zhuǎn)座學(xué)說(shuō)1951年，提出其六年的研究成果－跳躍基因?qū)W說(shuō)。此學(xué)說(shuō)指出：玉米的染色體中含有跳躍基因，可于染色體上依狀況進(jìn)行移動(dòng)，而此基因可控制或影響某些構(gòu)造基因的表達(dá)。1956年再次闡述跳躍基因?qū)W說(shuō)與相關(guān)的機(jī)制1970年代末期，分子生物學(xué)有進(jìn)一步的發(fā)展后，她的理論才漸漸受到重視與認(rèn)同，于1983年，獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)Ac(Activator):自主性轉(zhuǎn)座子，自己能編碼轉(zhuǎn)位酶，能自由地在基因組中轉(zhuǎn)座.Ds(Dissociation):非自主性轉(zhuǎn)座子，本身不能編碼轉(zhuǎn)位酶，必須依靠Ac轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)位酶才能產(chǎn)生轉(zhuǎn)座.（玉米色素基因C附近有Ds)SAc:StableAc,去掉Ac中轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列

Ac-Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)第3頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第4頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)座子是染色體DNA上可復(fù)制和移動(dòng)的DNA序列。一段DNA順序可以從原位上單獨(dú)復(fù)制或斷裂下來(lái)，環(huán)化后插入另一位點(diǎn)，并對(duì)其后的基因起調(diào)控作用，此過(guò)程稱轉(zhuǎn)座。這段序列稱跳躍基因或轉(zhuǎn)座子，可分插入序列（insertionsequence，IS）、轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）、Mu噬菌體（Muphage）。按轉(zhuǎn)座方式分復(fù)制性和非復(fù)制性轉(zhuǎn)座子。2.轉(zhuǎn)座子類型2.1原核生物中的轉(zhuǎn)座因子IS是最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座因子，不含任何宿主基因的可轉(zhuǎn)位的DNA序列稱為插入序列。它們是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。(1)插入序列ISIS本身沒(méi)有任何表型效應(yīng)，只攜帶和它轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因，稱為轉(zhuǎn)座酶基因。第5頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月除IS1以外，所有已知IS序列都只有一個(gè)開(kāi)放閱讀框（openreadingframe，ORF），翻譯起始位點(diǎn)緊接第一個(gè)反向重復(fù)區(qū)，終止點(diǎn)位于第二個(gè)反向重復(fù)區(qū)或重復(fù)區(qū)附近。IS1含有兩個(gè)分開(kāi)的讀碼框，只有移碼通讀才能產(chǎn)生功能型轉(zhuǎn)座酶。一般情況下，每個(gè)IS轉(zhuǎn)座頻率是10－4

～10－3／世代，恢復(fù)頻率則低得多，為10－7

～10－6／世代。第6頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(2)轉(zhuǎn)座子TnTn是一類較大的轉(zhuǎn)座子，除了含有與轉(zhuǎn)座作用有關(guān)基因外，還帶有抗藥基因以及其他基因，如乳糖發(fā)酵基因,因此Tn的轉(zhuǎn)座能使宿主菌獲得有關(guān)基因的特性。Tn分子大小一般在2～25kb，兩端有相同序列，如IR。某些Tn的IR便是已知的IS，帶有IS的Tn也稱為復(fù)合轉(zhuǎn)座子（compositetransposon）。Tn5、Tn10和Tn903都屬于復(fù)合轉(zhuǎn)座子.不含IS的Tn稱為簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子（simpletransposon），如Tn3等第7頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月無(wú)論是IS或Tn的兩端都有反向重復(fù)序列，兩端反向重復(fù)序列的存在與它們的轉(zhuǎn)座功能密切相關(guān)。如Tn3的兩個(gè)IR中任一個(gè)順式作用元件缺失都會(huì)阻止轉(zhuǎn)座。TnA轉(zhuǎn)座子家族第8頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）轉(zhuǎn)座噬菌體1963年發(fā)現(xiàn)了一種特殊的噬菌體，稱為Mu（mutatorphage），它是大腸桿菌的一種溫和噬菌體，Mu幾乎可插入宿主染色體任何一個(gè)位置上。它的兩端沒(méi)有黏性末端，插入某基因中就引起該基因突變。其整合方式不同于λ噬菌體，而類似于轉(zhuǎn)座因子的作用。第9頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Mu是DNA噬菌體，含有38kb線狀DNA，兩端各帶一小段大腸桿菌的DNA，這與該噬菌體插入大腸桿菌染色體上有關(guān)。Mu的轉(zhuǎn)座頻率比一般的轉(zhuǎn)座子要高。Mu的復(fù)制能力和它的轉(zhuǎn)座能力是密切相關(guān)的，Mu的生存依靠轉(zhuǎn)座，復(fù)制轉(zhuǎn)座是其正常生活史中的一種方式。在轉(zhuǎn)座過(guò)程中，它擺脫兩端原有的細(xì)菌DNA而轉(zhuǎn)座到新的某個(gè)位點(diǎn)上。它是以兩種方式轉(zhuǎn)座。在感染宿主細(xì)胞時(shí)，Mu不經(jīng)復(fù)制便整合進(jìn)宿主基因組；在溶菌周期中，拷貝數(shù)通過(guò)復(fù)制轉(zhuǎn)座而擴(kuò)增。兩種方式的轉(zhuǎn)座在轉(zhuǎn)座子和靶位點(diǎn)間有相同反應(yīng)機(jī)制，但反應(yīng)結(jié)果不同第10頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.2真核生物中的轉(zhuǎn)座因子（1）酵母菌基因組中的轉(zhuǎn)座子目前在酵母中研究得較清楚的轉(zhuǎn)座子是Ty（transposonyeast，Ty）系列,它們的一般長(zhǎng)度約為5900bp，兩端含有兩個(gè)稱為δ的同向長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR），長(zhǎng)度約340bp。δ因子大約由70%的AT組成，每一個(gè)δ因子都含有一個(gè)啟動(dòng)子和一段被轉(zhuǎn)座酶識(shí)別的序列第11頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Ty1因子只編碼一條長(zhǎng)5.7kb的mRNA，轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子位于Ty1因子左端的LTR之中。mRNA編碼兩種蛋白質(zhì)。在某些酵母品系中，Ty1因子可多達(dá)35個(gè)拷貝，但拷貝數(shù)因品系不同而有差別。Ty1因子轉(zhuǎn)座是通過(guò)一種RNA中間產(chǎn)物進(jìn)行的，其過(guò)程類似反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制與整合，所以Ty1因子也稱作反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。一般認(rèn)為T(mén)y1因子轉(zhuǎn)座時(shí)，首先以其DNA為模板合成一個(gè)拷貝的RNA，然后再通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成一條新的Ty1因子，最后這條新的Ty1轉(zhuǎn)座子再插入到新的位點(diǎn)上第12頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

釀酒酵母中有控制a與α兩種接合型的兩個(gè)基因a與α。這兩個(gè)基因都能轉(zhuǎn)座。當(dāng)a基因從它的位置HMR轉(zhuǎn)座到MAT位置后便能表達(dá)，細(xì)胞就成為a接合型；當(dāng)α基因從它的位置HML轉(zhuǎn)座到MAT后，原來(lái)在MAT上的a基因消失，α基因得以表達(dá)，細(xì)胞便能轉(zhuǎn)換成α接合型。這兩個(gè)轉(zhuǎn)座子具有明顯的生理功能，它們與其他轉(zhuǎn)座子不同之處是只能轉(zhuǎn)座到MAT這一個(gè)位置上，而其他的轉(zhuǎn)座子幾乎可以轉(zhuǎn)座到該基因組中任何位置上。酵母接合型相互轉(zhuǎn)換是屬于復(fù)制型轉(zhuǎn)座。果蠅中的轉(zhuǎn)座子除了P因子外還有copia、FB等。它們的結(jié)構(gòu)雖有所不同，但兩端都有反向重復(fù)序列。（2）其他真核生物轉(zhuǎn)座子玉米中Ac-Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，非復(fù)制性轉(zhuǎn)座。SpmdSpm系統(tǒng)等已知重復(fù)序列占了人類基因組50%以上，其中轉(zhuǎn)座子占重復(fù)序列的45%。所有的轉(zhuǎn)座子都是多拷貝的第13頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.轉(zhuǎn)座機(jī)制（1）復(fù)制型轉(zhuǎn)座特點(diǎn)：轉(zhuǎn)座以后原來(lái)位置上的轉(zhuǎn)座子保持不變?cè)谛碌奈恢蒙系霓D(zhuǎn)座子的兩側(cè)出現(xiàn)正向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座過(guò)程出現(xiàn)共聯(lián)體。以細(xì)菌的轉(zhuǎn)座子Tn3為例：切開(kāi)：轉(zhuǎn)座酶識(shí)別受體質(zhì)粒上的靶序列，并在該序列兩側(cè)各一條單鏈上造成一個(gè)切口，切口之間的距離決定了轉(zhuǎn)座后兩側(cè)正向重復(fù)序列的長(zhǎng)度。同時(shí)也可以識(shí)別自身兩邊的反向重復(fù)序列，并在3′端切開(kāi)。第14頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月連接：供體和受體結(jié)合成為共聯(lián)體，其過(guò)程是使供體切下IS或Tn3反向重復(fù)序列末端和受體黏性末端以共價(jià)鏈齊頭相連，形成兩個(gè)“缺口”。復(fù)制：由DNA多聚酶進(jìn)行修補(bǔ)復(fù)制補(bǔ)上缺口，由連接酶連接。于是在IS兩端形成了兩個(gè)正向重復(fù)序列（DR），一般為5～9bp，最長(zhǎng)的12bp。重組：在特定位點(diǎn)（黑色部分）進(jìn)行重組，結(jié)果共聯(lián)體分離形成兩部分，一個(gè)是原來(lái)含有轉(zhuǎn)座子的序列，另一個(gè)是通過(guò)轉(zhuǎn)座插入了轉(zhuǎn)座子的序列。第15頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）非復(fù)制型轉(zhuǎn)座第16頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.轉(zhuǎn)座子在基因工程中的應(yīng)用（1）作為基因工程的載體利用P因子作為載體，將外源基因轉(zhuǎn)移到果蠅胚胎種系細(xì)胞中，對(duì)果蠅進(jìn)行遺傳操作，該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是只插入一個(gè)外源基因的拷貝。也就是說(shuō)，所有轉(zhuǎn)基因果蠅只攜帶一個(gè)拷貝的外源基因，因而便于對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能研究轉(zhuǎn)座子的插入能引起新的突變體形成,其副作用也許會(huì)抵消由轉(zhuǎn)基因提供的任何優(yōu)勢(shì),以可移動(dòng)DNA片段作為載體尚存在轉(zhuǎn)移基因結(jié)果的不穩(wěn)定現(xiàn)象和內(nèi)源跳躍基因的相互影響.因此,這方面的應(yīng)用還處于探索階段.（2）轉(zhuǎn)座子標(biāo)記目的基因在基因產(chǎn)物未知的情況下一般采用兩種方法來(lái)分離控制發(fā)育的基因，一種是在特定的生理過(guò)程或發(fā)育時(shí)期采用差別篩選（differentialscreening）原理來(lái)分離目的基因，稱之為消減雜交與差別篩選。另一種是轉(zhuǎn)座子標(biāo)記（transposontagging）方法?！锏?7頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第18頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月該技術(shù)的原理：由于轉(zhuǎn)座子序列可以在基因組中轉(zhuǎn)座，如該序列轉(zhuǎn)座正好插入某一基因的外顯子區(qū)域時(shí)，導(dǎo)致該基因失活，使其表型改變而成為突變體，如該突變是由于轉(zhuǎn)座子的DNA克隆，其中必定含有與該突變體有關(guān)的基因。也就是說(shuō)，用轉(zhuǎn)座子給未知的目的基因加以標(biāo)記，便于對(duì)該基因的識(shí)別與分離。用該突變型提取DNA構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)，用標(biāo)記的轉(zhuǎn)座子序列作為探針，篩選出的克隆中，再對(duì)轉(zhuǎn)座子兩端序列進(jìn)行亞克隆，這便是被轉(zhuǎn)座子插入的基因序列。T-DNA-SAcT-DNA-Ds親株1親株2誘導(dǎo)啟動(dòng)子標(biāo)記基因1報(bào)告基因標(biāo)記基因2F1(SAc+Ds)F1突變庫(kù)強(qiáng)誘導(dǎo)培養(yǎng)報(bào)告基因的表達(dá)簽定突變的基因穩(wěn)定的突變株(Ds)自交或雜交簽定突變基因與表型關(guān)系雜交Ds報(bào)告基因第19頁(yè)，課件共21頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月對(duì)于微生物，也能利用轉(zhuǎn)座子突變制備隨機(jī)突變庫(kù)，從中篩選具有目的性狀的菌株，通過(guò)反向PCR或雜交技術(shù)確定插入失活的基因。從而確定表型與基因型關(guān)系。也可循環(huán)操作不斷改良細(xì)胞（3)調(diào)節(jié)基因表達(dá)同許多反轉(zhuǎn)錄病毒一樣，很多轉(zhuǎn)座子也帶有增強(qiáng)子，能使其插入部位附近的基因活性增加。此外，有的轉(zhuǎn)座子還含有啟動(dòng)子，也能促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄活性。如Ty因子，Tn10等.Tn10右側(cè)的IS10R以某一方向插入到由于缺失了啟動(dòng)子而不能表達(dá)的argE基因的5′端時(shí)，結(jié)果使沉默的argE基因重新表達(dá)，對(duì)該序列分析表明，其末