第三講 利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析

利用基因芯片進(jìn)行

基因表達(dá)譜分析第三講第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析RNA的檢測(cè):表達(dá)豐度，剪切體DNA的檢測(cè)：SNP，CGH，MethylationcDNA芯片的主要用于：表達(dá)譜芯片，CGH寡核苷酸芯片主要用于：診斷芯片，SNP分型芯片基因芯片應(yīng)用第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析MoreMicroarrayApplicationsChromosomesDNAGenepromotersmRNAmRNAvariantsmicroRNAsaCGHSNPsmiRNADNARNASNPsChIP/LAmiRNAGeneExpressionAlternateSplicing第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析雙色熒光系統(tǒng)cDNA芯片技術(shù)及載有較長(zhǎng)片段的寡核苷酸芯片實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組兩種組織的mRNA在反轉(zhuǎn)錄成cDNA的過程中分別標(biāo)記上Cy3和Cy5兩種熒光，制備成探針，競(jìng)爭(zhēng)性地與芯片上的核酸片段進(jìn)行雜交兩種波長(zhǎng)的激光掃描讀取競(jìng)爭(zhēng)雜交的結(jié)果，通過計(jì)算機(jī)處理就能確定芯片上基因所結(jié)合探針的量，通過計(jì)算兩種熒光強(qiáng)度的比值來判斷兩種組織中基因表達(dá)是否有變化。第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析數(shù)據(jù)分析、尋找差異表達(dá)的基因Cy3標(biāo)記的A組織mRNACy5標(biāo)記的B組織mRNA混合探針以兩種波長(zhǎng)的激光掃描Cy3-532nmCy5-635nm雜交雙熒光系統(tǒng)芯片的原理及流程圖第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析單色熒光系統(tǒng)較短的寡核苷酸芯片如Affymatrix芯片；載有較長(zhǎng)片段的寡核苷酸芯片也可使用，如Illumina芯片實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別用同樣的熒光物質(zhì)標(biāo)記（或生物素biotin），分別與芯片雜交，即一張芯片只雜交一個(gè)樣本根據(jù)雜交結(jié)果判斷待測(cè)樣品同芯片上哪個(gè)片段結(jié)合，通過與對(duì)照組的比較轉(zhuǎn)化成基因表達(dá)的改變第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析數(shù)據(jù)分析、尋找差異表達(dá)的基因探針A：biotin標(biāo)記掃描雜交探針B：biotin標(biāo)記兩張芯片上相同位點(diǎn)信號(hào)比單熒光系統(tǒng)芯片的原理及流程圖第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析單通道和雙通道的比較單通道實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性更好，使得比較不同樣品之間各種基因表達(dá)的相對(duì)比例是可靠的。進(jìn)行多個(gè)樣品之間（芯片之間）的比較時(shí)，只需在多個(gè)樣本中設(shè)置對(duì)照。由于點(diǎn)樣的是寡核苷酸，探針無法檢測(cè)。雙通道（點(diǎn)樣cDNA）重復(fù)性相對(duì)較差，但是探針可以測(cè)序驗(yàn)證。雙色法需在每次雜交檢測(cè)中設(shè)置對(duì)照，只能進(jìn)行兩個(gè)樣品之間的比較，芯片之間的比較并不可靠第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析ExpressionAnalysisArrays（Affymetrix)第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析UniquePM-MMProbeDesign11-20pairsof25merprobe3′5′AAAAA3’UTREachgeneisrepresentedontheprobearraybymultipleprobepairsEachprobepairconsistsofaperfectmatchandamismatcholigonucleotidePerfectMatchMismatchChipProbePairProbecellorfeature第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析PM-MM探針設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)靈敏度的提高

將已克隆的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以不同的濃度摻入到組織樣品中。經(jīng)過標(biāo)記的樣品與AffymetrixGenechip人類基因組芯片雜交，在克隆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物濃度低于8pM時(shí)，PM單獨(dú)探針無法探測(cè)出相應(yīng)的濃度變化，而與MM探針聯(lián)合使用則可以探測(cè)出。第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析單鏈和雙鏈探針雙鏈探針在液相條件下自我復(fù)性從而大大降低與固著的靶DNA雜交的機(jī)會(huì)，從而降低了探測(cè)靈敏度，因此需更多的探針量。單鏈，使雜交靈敏度提高第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析基因芯片實(shí)驗(yàn)流程及方法第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析cDNAmicroarrayTWOCHANNELMICROARRAY第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析AffymetrixExpressionAnalysis第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析ReverseTranscriptaseinvitrotranscriptionmRNAcDNAFragmentationofcRNAcRNAGeneChipHybridization標(biāo)記第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析

實(shí)驗(yàn)過程

樣本制備樣本標(biāo)記預(yù)雜交雜交洗滌染色（如生物素標(biāo)記）掃描數(shù)據(jù)分析第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析HybridizationprocessofGeneChipLLLLabelingcRNAfragmentLLHybridizationmixtureEukaryoticHyb.ControlControlOligoB2hybridization（16hour）DataanalysisScanWash&stain第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析樣本制備

表達(dá)譜基因芯片研究的對(duì)象是樣本中的mRNA，抽提出的mRNA需要經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄酶的作用轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，同時(shí)進(jìn)行熒光標(biāo)記，標(biāo)記好的cDNA靶分子就可用于雜交?；蛐酒瑢?shí)驗(yàn)中的RNA抽提大都采用分子生物學(xué)中傳統(tǒng)的方法，但要求必須能夠盡可能多的抽提出組織中的RNA分子，保持實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)信息與組織中mRNA拷貝數(shù)信息之間的平行性。第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析mRNA的純化方法兩步法：從樣本中制備總RNA，再?gòu)目俁NA中分離mRNA,總RNA中包括rRNA、tRNA和mRNA，其中９０％以上是rRNA和tRNA，分離mRNA的原理一般利用真核生物的mRNA的３’端都有polyA尾，用poly（dT）-纖維素親和層析純化mRNA。一步法：從組織樣本中直接用poly（dT）-纖維素親和層析純化mRNA，這種方法簡(jiǎn)便，但RNA的純度不夠，當(dāng)組織量少或?qū)NA質(zhì)量要求不高時(shí)可采用第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析逆轉(zhuǎn)錄：合成cDNA一鏈mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA時(shí)用poly（dT）作引物，可以直接用總RNA作為摸板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記，簡(jiǎn)化步驟，減少mRNA的損失，從而減少對(duì)組織的需求，也避免了從總RNA中純化mRNA的工作總RNA的純度不如mRNA高，直接從總RNA進(jìn)行mRNA的逆轉(zhuǎn)錄在一定程度上會(huì)影響到逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的效率，需要盡可能保證總RNA的純度第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析樣本量從多少總RNA中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄才能滿足實(shí)驗(yàn)需要？非擴(kuò)增：20微克；擴(kuò)增：1微克有些情況下，樣本極為稀有，不可能得到大量的mRNA靶分子基因芯片實(shí)驗(yàn)對(duì)總RNA量的需求在一定程度上限制了該技術(shù)的推廣發(fā)展方向：提高檢測(cè)靈敏度，減少基因芯片實(shí)驗(yàn)樣本用量第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析核苷酸的修飾方法熒光標(biāo)記：需避光，合成效率低，不同的熒光修飾會(huì)影響標(biāo)記效率，如Cy3標(biāo)記的和Cy5標(biāo)記的NTP摻入到DNA和RNA鏈中的效率是不一樣的；最終也導(dǎo)致成本高熒光標(biāo)記：標(biāo)記分子在特定的波長(zhǎng)范圍被激光光源激發(fā)出熒光，從而對(duì)含有標(biāo)記分子的樣本進(jìn)行檢測(cè)。如花青素（Cyanin）Cy3、Cy5，其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為：550/570和649/670。大部分掃描儀都能對(duì)這兩種熒光標(biāo)記進(jìn)行圖像處理。這種標(biāo)記方法沒有同位素標(biāo)記的限制；而且具有極高的靈敏度，能夠進(jìn)行定量檢測(cè)第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析生物素標(biāo)記的dNTP：利用biotin-Streptavidinphycoerythrin[Fluorescentdye]的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)記探針穩(wěn)定，不失活，并能配用多種檢測(cè)系統(tǒng)，簡(jiǎn)單方便，掃描成本較低。熒光素標(biāo)記的dNTP：Cy3-的dNTP，Cy5-的dNTP同位素標(biāo)記的dNTPaminoallyl（氨烯丙基）NTP：便宜，摻入DNA和RNA鏈的效率與未標(biāo)記的NTP相同；檢測(cè)的時(shí)候只需在它的氨基反應(yīng)基團(tuán)上偶聯(lián)Cy系列的染料或其他染料；但實(shí)驗(yàn)誤差大核苷酸的修飾方法第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析標(biāo)記方法RNA樣本不擴(kuò)增進(jìn)行標(biāo)記：在反轉(zhuǎn)錄的體系中加入Cy3或Cy5標(biāo)記過的dNTP類似物，通過反轉(zhuǎn)錄酶的作用，標(biāo)記新合成的cDNA。這種實(shí)驗(yàn)方法效率較低，對(duì)RNA樣本需求量大，通常要50～200μg總RNA，1～3μgmRNARNA樣本擴(kuò)增后進(jìn)行標(biāo)記第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析聯(lián)合應(yīng)用cDNA擴(kuò)增和模板指導(dǎo)下的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來完成線性擴(kuò)增。PCR方法：同一用量和限制循環(huán)次數(shù)的條件下，通過RT-PCR可平行的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的RNA樣本以滿足實(shí)驗(yàn)要求并同時(shí)進(jìn)行熒光標(biāo)記。擴(kuò)增mRNA（cRNA）靶分子第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析基于T7的mRNA線性擴(kuò)增：利用模板指導(dǎo)下的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來完成線性擴(kuò)增。該方法能從1～50ngmRNA分子出發(fā)擴(kuò)增出足夠數(shù)量的cDNA靶分子。這種擴(kuò)增方法更具線性擴(kuò)增mRNA（cRNA）靶分子第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析合成cDNA二鏈在小鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)cDNA一鏈。MMLV反轉(zhuǎn)錄酶會(huì)在cDNA一鏈的3’端加上非模板的寡聚C殘基，這時(shí)加入3’端帶有寡聚G的引物，可以結(jié)合到cDNA的3’端，生成一小段雙鏈的cDNA，再在DNA聚合酶的作用下延伸形成加入RNaseH，水解掉RNA模板，以殘留的與cDNA一鏈配對(duì)的短片段RNA為引物，在DNA聚合酶的作用下生成雙鏈cDNA第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析mRNA

cRNA噬菌體T7

DNA編碼的酶，對(duì)T7啟動(dòng)子序列具有高度特異性，不能識(shí)別其它生物來源的啟動(dòng)子。是依賴于DNA的RNA聚合酶，具有5'→3'的RNA聚合酶活性，以含有T7啟動(dòng)子序列的雙鏈DNA為模板，以NTP為底物，合成與啟動(dòng)子下游的模板DNA互補(bǔ)的RNA。第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析FragmentationofbiotinylatedcRNA第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析芯片雜交

將靶分子變性后，用預(yù)雜交液與芯片進(jìn)行預(yù)雜交1小時(shí)左右（cDNA和長(zhǎng)鏈寡核苷酸，42度（50％甲酰胺）；短鏈寡核苷酸，50度）雜交：溫度同預(yù)雜交，標(biāo)記好的樣品與雜交倉(cāng)內(nèi)反應(yīng)14-18小時(shí)洗片，掃描檢測(cè)雜交量依賴靶DNA和探針的濃度，當(dāng)靶DNA濃度一定時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與探針量成線性關(guān)系第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析ArrayFragmentedcRNATargetRNA:DNAHybridizedArrayStreptavidinphycoerythrin[Fluorescentdye]RNA相對(duì)不穩(wěn)定第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析雜交過程影響雜交速率和雜交雙鏈穩(wěn)定性的因素1．核酸濃度2．探針的類型和長(zhǎng)度3．堿基組成4．雜交液成分（1）離子強(qiáng)度（2）Formamide（3）季銨鹽溶液（4）雜交加速劑5．不匹配序列6．雜交時(shí)間7．雜交溫度第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析原核生物樣品第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析原始圖象文件(Cy3/Cy5)→定位→柵格處理(griding)→數(shù)據(jù)自動(dòng)提取→數(shù)據(jù)入表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)→原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化(normalization)

Ratio值分析Cluster分析顯著性表達(dá)差異基因具有相似表達(dá)譜基因數(shù)據(jù)分析流程圖第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析Experimentgroup/control:Hepacellularcarcinoma/Normalliver

信號(hào)疊加圖Red:明顯上調(diào)Yellow:差異不顯著Green:明顯下調(diào)第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析假陰性：一般不關(guān)心，但也要看實(shí)驗(yàn)?zāi)康募訇?yáng)性：驗(yàn)證基因芯片結(jié)果需要傳統(tǒng)方法的驗(yàn)證第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析

新一代芯片技術(shù)

光纖微珠芯片

ScreeningUnlabeledDNATargetswithRandomlyOrderedFiber-OpticGeneArrays,Steemers,F.J.,Ferguson,J.A.,Walt,D.R.,NatureBiotechnology,18,91-94,2000.Techview:MolecularBiology.Bead-BasedFiber-OpticArrays,Walt,D.R.,Science,287,451-452,2000DecodingRandomlyOrderedDNAArrays,KevinL.Gunderson,GenomeResearch,14:870-877,2004.第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析微珠3.1um無孔無熒光硅珠每個(gè)微珠單獨(dú)質(zhì)控

光纖微珠芯片---技術(shù)原理

有效的反應(yīng)表面積和體積比低/無背景大小均一第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析Oligator?合成工廠寡聚核苷酸探針光纖微珠芯片---技術(shù)原理96孔板全自動(dòng)化合成LIMS控制所有過程年生產(chǎn)能力>20million嚴(yán)格的QC系統(tǒng)OD260檢測(cè)產(chǎn)量MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)UV毛細(xì)管電泳實(shí)時(shí)數(shù)碼色彩監(jiān)控第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析寡聚核苷酸探針3’End5’End50mer探針合成探針從3’到5’端，保證地址序列能合成并結(jié)合到微珠上。活化的微珠的氨基是否只與oligo的5端結(jié)合？23mer地址序列光纖微珠芯片---技術(shù)原理

73mer第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析23mer50mer探針3’End5’End探針與微珠連接寡聚核苷酸探針每個(gè)微珠上連接100萬左右相同的探針第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析三步法微珠制備

RawBeadsSilanization–producesageneralcouplingmolecule–anamineTrimethoxyaminopropylsilaneVerystablecomparedtoothertechniquesActivationPreparesthebeadtoattachtheOligoCyanuricChlorideImmobilizationofDNAComplexityDiscretereactions96Wellmicrotiterplate

NH2OHNNNNHClCl第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析每種(微珠+探針)單獨(dú)合成并QC不同種微珠混合在一起形成微珠池

(1624－24,000+種微珠)寡聚核苷酸探針高雜交特異性全長(zhǎng)序列探針定制靈活100%質(zhì)量檢控QC第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析BeadProductionSynthesisofOligosActivatedBeadPlates+OligoPlatesGilson96TipRobotOvenPooledBeadSetQC第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析acidetchstrandcladdingstrandcorePhoto-resistSiliconwaferplasmaetchingcleaningOpticalfiber3μmbeadsinwells芯片的組裝第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析將微珠池內(nèi)微珠倒入蝕刻光纖，微珠無序自組裝進(jìn)入小孔，每根光纖上帶一個(gè)微珠每種微珠大約有~30個(gè)重復(fù)芯片的組裝消除系統(tǒng)隨機(jī)誤差高重復(fù)性微珠之間間距均一第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析光纖束-微珠芯片的組裝傳統(tǒng)芯片圖第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析RandomBeadAssemblyMixtureofDifferentBeadTypes6x2WholeGenomeBeadChipBeadPoolispipettedontheSubstrateNoInformationofBeadIdentityandlocationonArray第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析Decoderhybridization1Decoderhybridization2芯片解碼第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析Gundersonetal.(2004)

DecodingrandomlyorderedDNAarrays.GenomeResearch14,870-877.4.芯片解碼第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析指數(shù)級(jí)解碼XY=totalnumberofcodesX=totalnumberofcolorsorstatesY=totalnumberofhybridizationstagesSingleIllumiCodeStrategyExample:38=6,56148=65,536第三講利用基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析每張芯片上每個(gè)微珠每個(gè)特性都被質(zhì)控(100%QC)位置和強(qiáng)度控制有多少重復(fù)小部分不合格地被撿出是Illumina出廠前的生產(chǎn)步驟每個(gè)芯片在出廠前已通過解碼和質(zhì)控解碼CD隨芯片送至用戶處芯片解碼第三講利用基因