第四章-發(fā)酵工程-生概自制課件

第四章發(fā)酵工程涉及內(nèi)容

一、發(fā)酵工程概況二、微生物發(fā)酵過(guò)程三、液體深層發(fā)酵四、固體發(fā)酵五、典型產(chǎn)品的發(fā)酵一、發(fā)酵工程概況（一）發(fā)酵的定義：

發(fā)酵（fermentation）最初來(lái)自拉丁語(yǔ)“發(fā)泡”（fervere），是指酵母作用于果汁或發(fā)芽谷物產(chǎn)生CO2的現(xiàn)象。巴斯德研究了酒精發(fā)酵的生理意義，認(rèn)為發(fā)酵是酵母在無(wú)氧狀態(tài)下的呼吸過(guò)程。生物化學(xué)上將發(fā)酵定義為“微生物在無(wú)氧時(shí)的代謝過(guò)程”。目前，人們把利用微生物在有氧或無(wú)氧條件下的生命活動(dòng)來(lái)制備微生物菌體或其代謝產(chǎn)物的過(guò)程統(tǒng)稱為發(fā)酵。

（二）發(fā)酵工程的定義

采用現(xiàn)代化工程技術(shù)手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，或直接把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程的一種新技術(shù)。以微生物作為研究對(duì)象，也稱微生物工程。現(xiàn)代的發(fā)酵工程不僅包括菌體生產(chǎn)和代謝產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)，還包括微生物機(jī)能的利用。其主要內(nèi)容包括生產(chǎn)菌種的選育，發(fā)酵條件的優(yōu)化與控制，反應(yīng)器的設(shè)計(jì)及產(chǎn)物的分離、提取與精制等。

（三）發(fā)酵工程發(fā)展

起始時(shí)間發(fā)酵階段主要產(chǎn)品主要技術(shù)古代-1900天然發(fā)酵酒、醋、醬油、干酪天然接種分批培養(yǎng)1905純培養(yǎng)酒精、丙酮、丁醇密閉純培養(yǎng)1940通氣攪拌抗生素、有機(jī)酸、酶、維生素通氣攪拌技術(shù)連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)1956代謝調(diào)控氨基酸、核苷酸選育代謝調(diào)節(jié)和缺陷生產(chǎn)菌株1973基因工程胰島素、干擾素基因工程菌原生質(zhì)體融合等遠(yuǎn)古人類發(fā)現(xiàn)：吃剩的米粥數(shù)日后變成了醇香可口的飲料—人類最早發(fā)明的酒我國(guó)古代的釀酒作坊（四川新都縣出土的漢代畫(huà)像）微生物學(xué)的奠基人——偉大的巴斯德

我國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品醬油、醋、腐乳等享譽(yù)世界

我國(guó)的釀酒已經(jīng)有4000多年的歷史

我國(guó)的醬油距今已有3000

年的歷史

1857年巴斯德證明發(fā)酵是由于微生物的作用

（四）發(fā)酵類型根據(jù)微生物發(fā)酵產(chǎn)物的不同分為

1.微生物菌體發(fā)酵以獲得某種用途的菌體為目的的發(fā)酵。

1)用于面包制作的酵母發(fā)酵及用于人類食品或動(dòng)物飼料的微生物菌體蛋白（螺旋藻等）

2)藥用真菌香菇類、依賴蟲(chóng)蛹而生存的冬蟲(chóng)夏草以及擔(dān)子菌的靈芝等。

蟲(chóng)草真菌的子囊孢子侵襲蟲(chóng)草蝙蝠蛾的幼蟲(chóng)形成的“冬蟲(chóng)夏草”3)生物防治劑

蘇云金桿菌、蠟樣芽孢桿菌和側(cè)孢芽孢桿菌細(xì)胞中的伴孢晶體可毒殺鱗翅目、雙翅目的害蟲(chóng)；絲狀真菌的白僵菌、綠僵菌可防治松毛蟲(chóng)等。2.微生物酶發(fā)酵：獲得微生物酶制劑，多用于食品工業(yè)和輕工業(yè)中，如微生物生產(chǎn)的淀粉酶和糖化酶用于生產(chǎn)葡萄糖；也用于醫(yī)藥生產(chǎn)和醫(yī)療檢測(cè)中，膽固醇氧化酶用于檢查血清中膽固醇的含量，葡萄糖氧化酶用于檢查血中葡萄糖的含量等等。3.微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵：獲得微生物代謝產(chǎn)物，分為初級(jí)代謝產(chǎn)物（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所產(chǎn)生的產(chǎn)物如氨基酸、核苷酸糖類等，是菌體生長(zhǎng)繁殖所必需的）和次級(jí)代謝產(chǎn)物（生長(zhǎng)靜止期合成一些具有特定功能的產(chǎn)物，如抗生素、細(xì)菌毒素等，

與菌體生長(zhǎng)繁殖無(wú)明顯關(guān)系）兩種。4.微生物的轉(zhuǎn)化發(fā)酵利用微生物細(xì)胞的一種或多種酶把一種化合物轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相關(guān)的更有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)物。脫氫反應(yīng)、氧化反應(yīng)、脫水反應(yīng)、縮合反應(yīng)、脫氨反應(yīng)等。最古老的生物轉(zhuǎn)化，就是利用菌體將乙醇轉(zhuǎn)化成乙酸的醋酸發(fā)酵。包括醇類轉(zhuǎn)化、甾類轉(zhuǎn)化和抗生素轉(zhuǎn)化等。5.生物工程細(xì)胞發(fā)酵：

利用生物工程技術(shù)所獲得的細(xì)胞，如DNA重組的“工程菌”以及細(xì)胞融合所得的“雜交”細(xì)胞等進(jìn)行培養(yǎng)的新型發(fā)酵，其產(chǎn)物多種多樣。有用基因工程菌生產(chǎn)的有胰島素、干擾素等，用雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的用于疾病治療和診斷的各種單克隆抗體等。（五）發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)特點(diǎn)：①操作條件比較溫和，通常在常溫常壓下進(jìn)行，耗能少，設(shè)備簡(jiǎn)單；②以淀粉、糖蜜或農(nóng)副產(chǎn)品、工業(yè)廢水或植物秸稈、木屑等可再生資源等為主要原料，成本低。③過(guò)程反應(yīng)以生命體（微生物自身）的自動(dòng)調(diào)節(jié)方式進(jìn)行，多個(gè)反應(yīng)可一次性完成；④能合成復(fù)雜的高分子化合物，如：酶、光學(xué)活性體等；能選擇性的在復(fù)雜化合物的特定部位進(jìn)行氧化、還原、官能團(tuán)導(dǎo)入等特殊反應(yīng)；⑤生產(chǎn)過(guò)程中，需要防止雜菌污染（設(shè)備、空氣）。（六）微生物工業(yè)的范圍（1）醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)抗生素、維生素、人胰島素、乙肝疫苗、干擾素等（2）食品工業(yè)微生物蛋白、酒類、飲料、氨基酸、食品添加劑等（3）能源工業(yè)酒精、沼氣發(fā)酵（4）化學(xué)工業(yè)可降解的生物塑料、化工原料、生物表面活性劑等（5）冶金工業(yè)利用微生物探礦、冶金、石油脫硫等（6）農(nóng)業(yè)

生物固氮和生產(chǎn)生物殺蟲(chóng)劑及微生物飼料（7）環(huán)境保護(hù)凈化有毒高分子化合物、降解浮油、處理廢水、污水等二、微生物發(fā)酵過(guò)程1、發(fā)酵的方式

a.按微生物種類分即微生物反應(yīng)過(guò)程，是指由微生物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中所引起的生化反應(yīng)的過(guò)程。好氧性發(fā)酵厭氧性發(fā)酵兼性厭氧發(fā)酵酵母菌，缺氧時(shí)厭氧發(fā)酵積累酒精，有氧時(shí)好氧性發(fā)酵，大量繁殖菌體細(xì)胞

需不斷地通入一定量的無(wú)菌空氣（黑曲霉的檸檬酸發(fā)酵、棒狀桿菌的谷氨酸發(fā)酵）不需供給空氣（乳酸桿菌的乳酸發(fā)酵）b.按培養(yǎng)基狀態(tài)分液體發(fā)酵（最常用）固體發(fā)酵c、按照發(fā)酵設(shè)備類型分深層發(fā)酵在液體培養(yǎng)基的表面和內(nèi)部進(jìn)行微生物培養(yǎng)

敞口發(fā)酵密閉發(fā)酵淺盤(pán)發(fā)酵繁殖快并進(jìn)行好氧發(fā)酵，如酵母表面培養(yǎng)法，在液體上面形成一層菌膜工藝復(fù)雜，設(shè)備要求高2、發(fā)酵工業(yè)中常用的微生物

微生物：

個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，肉眼不可見(jiàn)或看不清楚的微小生物的統(tǒng)稱。其種類包括原核生物的細(xì)菌（真細(xì)菌和古細(xì)菌）、放線菌、支原體、立克次氏體、衣原體和螺旋體等；屬于真核生物的真菌（酵母菌、霉菌和擔(dān)子菌）、單細(xì)胞藻類和原生動(dòng)物以及沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的病毒（動(dòng)物、植物和微生物病毒）和亞病毒。

細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌在發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用最廣，藻類和擔(dān)子菌亦有應(yīng)用。細(xì)菌：

自然界中分布最廣、數(shù)量最多的一類微生物，屬單細(xì)胞原核生物，有球狀（雙球、四聯(lián)球、八疊球、鏈球、葡萄球菌等）、桿狀、螺旋狀等多種形態(tài)，以較典型的二分裂方式繁殖。

細(xì)菌形態(tài)圖細(xì)菌形態(tài)及結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖桿菌二分裂過(guò)程電鏡照片及模式圖細(xì)菌的二分裂繁殖細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，單環(huán)DNA染色質(zhì)體被復(fù)制，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等組分同時(shí)增加一倍，然后在細(xì)胞中部產(chǎn)生一橫斷間隔，染色質(zhì)體分開(kāi)，繼而間隔分裂形成細(xì)胞壁，最后形成兩個(gè)相同的子細(xì)胞。如果間隔不完全分裂就形成鏈狀細(xì)胞。發(fā)酵工業(yè)中常用的細(xì)菌有枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、醋酸桿菌、棒狀桿菌、短桿菌等，可用于生產(chǎn)淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等等。2）放線菌：因其菌落呈放射狀而得名（菌絲末端伸長(zhǎng)和分支，彼此交錯(cuò)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，稱為菌絲體）。為原核生物，分布廣，在含有機(jī)質(zhì)豐富的微堿性土壤中較多。大多腐生，少數(shù)寄生。主要以

無(wú)性孢子進(jìn)行繁殖，也可借菌絲片段進(jìn)行繁殖。

放線菌形態(tài)根據(jù)放線菌菌絲形態(tài)和功能可分為營(yíng)養(yǎng)菌絲、氣生絲和孢子絲三種：①營(yíng)養(yǎng)菌絲

又叫初級(jí)菌絲或一級(jí)菌絲，匍匐生長(zhǎng)于培養(yǎng)基內(nèi)，可吸收營(yíng)養(yǎng)物，故亦稱基內(nèi)菌絲。②氣生菌絲

又稱二級(jí)菌絲。營(yíng)養(yǎng)菌絲體發(fā)育到一定時(shí)期，長(zhǎng)出培養(yǎng)基外并伸向空間的菌絲。疊生于營(yíng)養(yǎng)菌絲上，可覆蓋整個(gè)菌落表面。為繁殖后代做準(zhǔn)備，傳遞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。③孢子絲

氣生菌絲體發(fā)育到一定程度，分化出可形成孢子的菌絲（產(chǎn)孢絲或繁殖菌絲）。孢子絲的形狀有直形、波曲和螺旋形之分，著生方式有互生、輪生或叢生等，形態(tài)固定，

可作為菌種鑒定的依據(jù)。

鏈霉菌的形態(tài)構(gòu)造模式放線菌的各種孢子絲形態(tài)放線菌能用于產(chǎn)生多種抗生素。從微生物中發(fā)現(xiàn)的抗生素，有60％以上是放線菌產(chǎn)生的，如鏈霉素、金霉素、紅霉素、慶大霉素等。發(fā)酵工業(yè)常用的放線菌主要來(lái)自于鏈霉菌屬、小單孢菌屬和諾卡氏菌屬等。3）酵母菌：?jiǎn)渭?xì)胞真核生物，主要分布于含糖質(zhì)較多的偏酸性環(huán)境中，如水果、蔬菜和植物葉片上及果園土壤中。大多為腐生，常以單個(gè)細(xì)胞存在，主要以出芽形式進(jìn)行繁殖。母細(xì)胞體積長(zhǎng)到一定程度時(shí)就開(kāi)始發(fā)芽，芽長(zhǎng)大的同時(shí)母細(xì)胞縮小，在母子細(xì)胞間形成隔膜，最后形成同樣大小的母子細(xì)胞。如果子芽不與母細(xì)胞脫離就形成鏈狀細(xì)胞，稱為假菌絲。也有部分酵母以裂殖和子囊孢子的形式進(jìn)行繁殖。酵母光鏡圖酵母電鏡鏡圖酵母結(jié)構(gòu)圖酵母菌的芽殖過(guò)程1.泡；2.小管；3.核；4.液泡酵母菌假菌絲的形成圖中1、2、3、4·······是出芽的順序酵母生長(zhǎng)旺盛時(shí)，芽體還未脫落時(shí)又生成新的芽體，形成假菌絲。酵母菌子囊孢子的形成過(guò)程（有性生殖）

1-4：兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)突起結(jié)合；5：接合子（雙倍體細(xì)胞核）；6-9：核分裂，形成4-8個(gè)細(xì)胞核；10、11：子核與原生質(zhì)形成孢子發(fā)酵工業(yè)上常用的酵母菌有：啤酒酵母、假絲酵母、類酵母等，主要用于釀酒、制造面包、制造低凝固點(diǎn)石油、生產(chǎn)脂肪酶以及生產(chǎn)可食用、藥用和飼料用的酵母菌體蛋白等。4）霉菌：凡生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上形成絨毛狀、網(wǎng)狀或絮狀菌絲的真菌。分布廣，大量存在于土壤、空氣、水和生物體內(nèi)外等處。喜偏酸性環(huán)境，大多數(shù)為好氧性，多腐生，少數(shù)寄生。各種曲霉的菌落青霉菌落各種病原真菌的菌落霉菌的營(yíng)養(yǎng)體由菌絲體組成A.無(wú)隔多核菌絲；B.有隔單核菌絲；C.有隔多核菌絲

霉菌的繁殖能力很強(qiáng)，它以無(wú)性孢子（為主）和有性孢子進(jìn)行繁殖。其生長(zhǎng)方式是菌絲末端的伸長(zhǎng)和頂端分支，彼此交錯(cuò)呈網(wǎng)狀。為適應(yīng)不同的環(huán)境條件和更有效地?cái)z取營(yíng)養(yǎng)滿足生長(zhǎng)發(fā)育的需要，許多霉菌的菌絲分化成一些特殊的形態(tài)和組織（菌絲變態(tài)）。如:假根（根霉屬霉菌，固著和吸收養(yǎng)料）、寄生性吸器、捕食性真菌的菌套和菌網(wǎng)（用于捕捉其它小生物如線蟲(chóng)、草履蟲(chóng)等）根霉的結(jié)構(gòu)示意圖具假根

寄生性真菌的吸器A.球狀B.根狀C.指狀D.佛手狀

捕食性真菌的菌套和菌網(wǎng)

A.菌套B.簡(jiǎn)單菌網(wǎng)C.復(fù)雜菌網(wǎng)

黃曲霉的分生孢子青霉的分生孢子鏈霉菌的菌絲及分生孢子發(fā)酵工業(yè)上常用的霉菌有：藻狀菌綱的根霉、毛霉、犁頭霉，子囊菌綱的紅曲霉，半知菌類的曲霉、青霉等，主要用于生產(chǎn)多種酶制劑、抗生素、有機(jī)酸及甾體激素等。5）其他微生物：a、擔(dān)子菌（菇類）主要用于多糖、橡膠物質(zhì)和抗癌藥物（香菇）的開(kāi)發(fā)。b、藻類（螺旋藻）螺旋藻自養(yǎng)型微生物可作人類保健食品和飼料；可通過(guò)藻類利用光能將C02轉(zhuǎn)變?yōu)槭停焕闷涔夂戏艢渥饔脕?lái)取得氫能。3、培養(yǎng)基1）培養(yǎng)基種類可按照培養(yǎng)基的組成成分、物理狀態(tài)和功能進(jìn)行分類。a、按組成成分分按成分不同劃分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基含化學(xué)成分還不清楚或不恒定的天然有機(jī)物（動(dòng)、植物或微生物的浸出物、水解液等物質(zhì)(牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、蛋白胨等）化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成，實(shí)驗(yàn)室作有關(guān)營(yíng)養(yǎng)、代謝、分類鑒定、生物測(cè)定及選育菌種、遺傳分析等定量研究按物理狀態(tài)不同劃分液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑（1.5%-2.0%瓊脂），使其呈固體狀態(tài)瓊脂含量一般為0.2%-0.7%固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基常用來(lái)進(jìn)行微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)及菌種保藏觀察微生物的運(yùn)動(dòng)特征、分類鑒定及噬菌體效價(jià)滴定

不加任何凝固劑大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用的研究b、按物理狀態(tài)分

1）孢子培養(yǎng)基：用于制備大量?jī)?yōu)質(zhì)孢子（植物或微生物所產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的細(xì)胞，能直接發(fā)育成新個(gè)體

），且不能產(chǎn)生變異。基質(zhì)濃度(特別是有機(jī)氮源)要低些，無(wú)機(jī)鹽的濃度要適量，否則影響孢子的數(shù)量和質(zhì)量。生產(chǎn)中常用的孢子培養(yǎng)基有麩皮培養(yǎng)基，大(小)米培養(yǎng)基，瓊脂斜面培養(yǎng)基等。

c、根據(jù)在生產(chǎn)中的用途分

2）種子培養(yǎng)基：

供孢子發(fā)芽和菌體生長(zhǎng)繁殖使用。要求營(yíng)養(yǎng)成分豐富且完整，易被菌體吸收利用。其中氮源和維生素的含量應(yīng)略高些，但總濃度以略

稀薄為宜，以便菌體的生長(zhǎng)繁殖。常用的原料有葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米漿、酵母粉、硫酸銨、尿素、硫酸鎂、磷酸鹽等。培養(yǎng)基的組成隨菌種而改變，成分要與發(fā)酵培養(yǎng)基相關(guān)聯(lián)（使種子盡快適應(yīng)發(fā)酵罐內(nèi)的環(huán)境）。3）發(fā)酵培養(yǎng)基：

供菌體生長(zhǎng)繁殖及合成大量代謝產(chǎn)物。要求組成豐富完整，營(yíng)養(yǎng)成分的濃度和黏度適中，利于菌體的生長(zhǎng)，進(jìn)而合成大量代謝產(chǎn)物。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成要考慮菌體在發(fā)酵過(guò)程中的各種生化代謝的協(xié)調(diào)，在產(chǎn)物合成期，使發(fā)酵液pH不出現(xiàn)大的波動(dòng)。2）發(fā)酵培養(yǎng)基的組成

微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有六大類要素:水、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子和產(chǎn)物形成的誘導(dǎo)物、前體和促進(jìn)劑。①水（水質(zhì)影響較大）培養(yǎng)基的主要成分，構(gòu)成菌體細(xì)胞，傳遞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，直接參與代謝反應(yīng)。深井水、自來(lái)水和地表水皆可。

②

碳源

構(gòu)成菌體和產(chǎn)物的碳架及能量來(lái)源。包括各種單糖

(如葡萄糖)、雙糖(如蔗糖)和淀粉、纖維素等多糖；玉米淀粉；油脂（霉菌和放線菌生長(zhǎng)的消泡劑）；有機(jī)酸；醇類；石油產(chǎn)品等。③氮源構(gòu)成微生物細(xì)胞本身的物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮素來(lái)源。有機(jī)和無(wú)機(jī)氮源兩大類，黃豆、花生、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、酵母粉；氨水、硫酸銨、氯化銨、硝酸鹽等。④無(wú)機(jī)鹽和微量元素磷酸鹽、硫酸鹽、氯化鈉、氯化鉀及微量元素如鎂、鐵、鈷、鋅、錳等。構(gòu)成菌體原生質(zhì)的成分（P、S

等）；作為酶的組成成分或維持酶的活性（Mg、Fe、

Mn等）；調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓和影響細(xì)胞膜的通透性（NaCl、KCl等）；參與產(chǎn)物的生物合成等。需要量甚微，0.1μg/mL的濃度即可。⑤生長(zhǎng)因子自身不能合成，需要額外加入的微量有機(jī)物，包括氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶、脂肪酸等。如酵母膏、牛肉膏、蛋白胨和一些動(dòng)植物組織的浸出物。⑥產(chǎn)物形成的誘導(dǎo)物、前體和促進(jìn)劑

誘導(dǎo)物促使胞外酶合成；前體可被菌體直接用于產(chǎn)物合成而自身結(jié)構(gòu)無(wú)顯著改變（如合成紅霉素的丙酸等）；促進(jìn)劑能刺激菌株的生長(zhǎng)，提高發(fā)酵產(chǎn)量，縮短發(fā)酵周期（在四環(huán)素發(fā)酵中加入溴化鈉和M促進(jìn)劑（2-巰基苯并噻唑），能抑制金霉素的生物合成，同時(shí)增加四環(huán)素產(chǎn)量）。4、發(fā)酵一般過(guò)程發(fā)酵過(guò)程一般包括了以下的基本步驟：a菌種的選育b培養(yǎng)基的配制c滅菌d種子的擴(kuò)大培養(yǎng)和接種e發(fā)酵過(guò)程f下游加工過(guò)程（產(chǎn)物分離提純）發(fā)酵過(guò)程流程簡(jiǎn)圖1）菌種的選育

①?gòu)淖匀唤缰邢确蛛x出相應(yīng)的菌種；②利用誘變篩選出符合生產(chǎn)要求的優(yōu)良菌種；③利用基因工程、細(xì)胞工程的方法構(gòu)建工程細(xì)胞或工程菌。

如：可將人工合成的人的胰島素基因與大腸桿菌的質(zhì)粒結(jié)合，形成重組DNA，再把重組DNA

導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)形成工程菌。通過(guò)篩選則可培養(yǎng)出能生產(chǎn)人的胰島素的菌種。

2）培養(yǎng)基的配制配制原則：

①根據(jù)不同的菌種，選擇不同的材料配制培養(yǎng)基。配制的培養(yǎng)基應(yīng)滿足微生物在碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、水、無(wú)機(jī)鹽等方面的營(yíng)養(yǎng)要求，并為微生物提供適宜的PH。

②

培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)，以利于產(chǎn)物的合成。

③

物理、化學(xué)條件適宜。（pH、水活度、滲透壓）

④

培養(yǎng)基在滿足微生物的營(yíng)養(yǎng)需求的基礎(chǔ)上應(yīng)盡量降低生產(chǎn)成本，以得到更高的經(jīng)濟(jì)效益。3）滅菌包括設(shè)備滅菌、培養(yǎng)基（補(bǔ)料）滅菌、空氣滅菌等。

a、滅菌的原因：

在發(fā)酵過(guò)程中如混入其他微生物，將與菌種形成競(jìng)爭(zhēng)或抑制關(guān)系，造成減產(chǎn)甚至無(wú)產(chǎn)品產(chǎn)生。（若在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中混入放線菌，則其分泌的抗生素就會(huì)使谷氨酸棒狀桿菌死亡。b、滅菌的方法：

濕熱滅菌。飽和蒸汽對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，121℃（約0.1

MPa）維持20～30min?？諝獬鷦t可用介質(zhì)過(guò)濾，可用定期滅菌的干燥介質(zhì)來(lái)截流的空氣中所含微生物，制得無(wú)菌空氣。發(fā)酵罐滅菌處理4）種子擴(kuò)大培養(yǎng)和接種

a、種子擴(kuò)大培養(yǎng)含義：

將保存在沙土管、冷凍干燥管或冰箱中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面培養(yǎng)基上活化，再經(jīng)過(guò)

茄子瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，以促使菌體數(shù)量快速增加，能在短時(shí)間里得到大量的純種（種子）。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后的種子再進(jìn)行發(fā)酵可縮短生產(chǎn)周期，提高設(shè)備利用率。可分為孢子進(jìn)罐培養(yǎng)和菌絲進(jìn)罐培養(yǎng)兩種。種子的制備一般使用種子罐，常為二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)。種子擴(kuò)大培養(yǎng)流程圖

1.沙土孢子2.冷凍干燥孢子3.斜面孢子4.菌絲體搖瓶液體培養(yǎng)

5.茄子瓶斜面培養(yǎng)6.固體培養(yǎng)基培養(yǎng)

7.8.種子罐培養(yǎng)9.發(fā)酵罐培養(yǎng)b、接種：

從孢子懸浮液容器（種子容器）或種子罐將種子移入生產(chǎn)發(fā)酵罐中，進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，要注意防止雜菌污染。接種：孢子懸浮容器或種子罐→發(fā)酵罐5）發(fā)酵

將已經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)、旺盛繁殖的種子在一定條件

控制下繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖并積累代謝產(chǎn)物。以獲得

大量產(chǎn)品（菌體或代謝產(chǎn)物）為目的，是整個(gè)

發(fā)酵工程的中心環(huán)節(jié)。

6）下游處理

發(fā)酵結(jié)束后，要對(duì)發(fā)酵液或微生物細(xì)胞進(jìn)行分

離和提取精制，制成所需產(chǎn)品。三、液體深層發(fā)酵

（一)發(fā)酵的操作方式

分批發(fā)酵

補(bǔ)料分批發(fā)酵

連續(xù)發(fā)酵

1.分批發(fā)酵

封閉系統(tǒng)，培養(yǎng)基和菌種一次性加入，中間與外界無(wú)物料交換（除空氣進(jìn)出外）。發(fā)酵過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)不斷減少，微生物不斷增殖，環(huán)境非穩(wěn)態(tài)，微生物生長(zhǎng)周期明顯；總生產(chǎn)能力不高，目前應(yīng)用較廣泛。

按操作方式分分批發(fā)酵：封閉系統(tǒng)，只能在一段有限的時(shí)間內(nèi)維持微生物的增殖，微生物處在限制性的條件下生長(zhǎng)，表現(xiàn)出典型的生長(zhǎng)周期，大多數(shù)分批發(fā)酵在到達(dá)衰亡期前就結(jié)束。

典型的分批發(fā)酵工藝流程

2.連續(xù)發(fā)酵

以一定速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)以相同的速度流出培養(yǎng)液，使罐內(nèi)的液量維持恒定，微生物在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)，可有效延長(zhǎng)分批培養(yǎng)中的對(duì)數(shù)期。培養(yǎng)基等量流入流出；各種變化＝0；不存在生長(zhǎng)周期。分為攪拌罐式（單、多罐）和管式反應(yīng)器兩種?？赏ㄟ^(guò)恒濁器法或恒化器法對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行控制。目前主要用于研究工作中，如發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定，過(guò)程條件的優(yōu)化試驗(yàn)等。工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用不多，用于廢水處理，面包、飼料酵母等生產(chǎn)（設(shè)備要求高，周期長(zhǎng)，菌體易變異，易污染，黏性絲狀菌菌體易結(jié)團(tuán)和黏附于罐壁）。攪拌式單罐連續(xù)發(fā)酵（a）和多罐連續(xù)發(fā)酵（b）反應(yīng)器的出口，裝一支路使細(xì)胞返回（2.細(xì)胞分離器），或者來(lái)自另一個(gè)連續(xù)培養(yǎng)罐。（未進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用）

管式連續(xù)發(fā)酵

1、管式反應(yīng)器；2、種子罐培養(yǎng)液沿管向前流動(dòng)，管中停留時(shí)間不同的料液混合程度低，各處營(yíng)養(yǎng)物濃度、細(xì)胞密度、氧濃度和產(chǎn)率等都不相同。恒濁培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)維持一定總體積，培養(yǎng)液過(guò)量，保持菌體濃度恒定（當(dāng)菌體濃度↑，濁度↑，控制使流速↑，反之亦然），

微生物始終以最高速率進(jìn)行生長(zhǎng)。

工業(yè)生產(chǎn)中用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)與菌體生長(zhǎng)相平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等。恒濁培養(yǎng)示意圖恒化連續(xù)培養(yǎng)維持一定總體積，保持培養(yǎng)液流速保持不變，通過(guò)控制某一種營(yíng)養(yǎng)物（生長(zhǎng)限制因子）濃度，使微生物始終在低于其最高生長(zhǎng)速率條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。（科研用）

恒濁器與恒化器的比較裝置控制對(duì)象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長(zhǎng)速率產(chǎn)物應(yīng)用恒濁器菌體密度（內(nèi)控制）無(wú)限制生長(zhǎng)因子不恒定最高大量菌體或與菌體形成相平行的產(chǎn)物生產(chǎn)為主恒化器培養(yǎng)基濃度（外控制）有限制生長(zhǎng)因子恒定低于最高不同生長(zhǎng)速率的菌體實(shí)驗(yàn)室為主3.補(bǔ)料分批發(fā)酵在分批發(fā)酵時(shí)，以某種方式向培養(yǎng)系統(tǒng)補(bǔ)加一定物料的培養(yǎng)技術(shù)，介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間，又稱半連續(xù)發(fā)酵?？煞譃閱我谎a(bǔ)料分批發(fā)酵和反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵兩種。1）單一補(bǔ)料分批發(fā)酵：

開(kāi)始時(shí)投入一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，中間連續(xù)補(bǔ)加碳源或氮源或其他必需基質(zhì)到最大操作容積后停止，一次放出。2）反復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵：

在前者基礎(chǔ)上，每隔一定時(shí)間按放出部分發(fā)酵液，始終不超過(guò)發(fā)酵罐最大操作容積，延長(zhǎng)發(fā)酵周期。與分批及連續(xù)發(fā)酵比較：①分批加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，定期放出產(chǎn)物可解除分批發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物基質(zhì)抑制、產(chǎn)物反饋抑制和葡萄糖分解阻遏效應(yīng)。②避免進(jìn)行好氧分批發(fā)酵時(shí)，因一次性投入糖過(guò)多造成細(xì)胞大量生長(zhǎng)，耗氧過(guò)多，以至通風(fēng)攪拌設(shè)備不能匹配的狀況。③減少菌體生成量，提高有用產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。不存在連續(xù)發(fā)酵時(shí)出現(xiàn)的菌種老化和變異問(wèn)題，適用范圍也比連續(xù)發(fā)酵廣。廣泛應(yīng)用于整個(gè)發(fā)酵行業(yè)，單細(xì)胞蛋白、氨基酸、抗生素、維生素等。在液體、固體發(fā)酵及混合培養(yǎng)中均有應(yīng)用。（二）發(fā)酵工藝控制：

在發(fā)酵過(guò)程中隨時(shí)取樣檢測(cè)以了解發(fā)酵進(jìn)程，及時(shí)添加必需的培養(yǎng)基成分來(lái)延長(zhǎng)菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期的時(shí)間，以得到更多的發(fā)酵產(chǎn)物。直接參數(shù)（溫度、壓力、pH、溶解氧）和間接參數(shù)（細(xì)胞生長(zhǎng)速率、產(chǎn)物合成速率等）反應(yīng)。

1、影響發(fā)酵過(guò)程的因素：

發(fā)酵生產(chǎn)中溫度、pH、溶氧量等對(duì)發(fā)酵過(guò)程影響較大。

（1）溫度

影響酶的活性、生物合成的途徑、發(fā)酵液的物理性質(zhì)及菌種對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解吸收等。生長(zhǎng)及發(fā)酵最適溫度不同，但因發(fā)酵液體積過(guò)大，升降溫不便。故常選擇較適合的培養(yǎng)溫度，以達(dá)到最高產(chǎn)量。

發(fā)酵中會(huì)釋放大量的發(fā)酵熱，通常需用冷卻水（蛇形管或夾套），通過(guò)熱交換來(lái)降溫，保持恒溫發(fā)酵。（2）pH

影響酶的活性、細(xì)胞膜的帶電荷狀況及培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解等。絕大多數(shù)細(xì)菌最適pH6.3-7.5；多數(shù)霉菌和酵母菌為pH3-6、放線菌pH7-8。

pH改變及控制：培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝，是引起pH變化的重要原因，發(fā)酵液的pH變化是菌體產(chǎn)酸和產(chǎn)堿的代謝反應(yīng)的綜合結(jié)果。發(fā)酵過(guò)程的各個(gè)階段最適PH值不同，應(yīng)隨時(shí)進(jìn)行調(diào)節(jié)：首先應(yīng)考慮培養(yǎng)基的配比或在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加酸或堿。過(guò)去是直接加入酸（H2SO4）或堿（NaOH）來(lái)控制，現(xiàn)在以生理酸性物質(zhì)如(NH4)2SO4和生理堿性物質(zhì)如氨水來(lái)控制，可以調(diào)節(jié)pH同時(shí)補(bǔ)充氮源。也可用補(bǔ)料的方式（如：青霉素發(fā)酵時(shí)控制葡萄糖補(bǔ)加速率）或改變通氣量來(lái)調(diào)節(jié)pH。（3）溶解氧

好氧性微生物在進(jìn)行深層培養(yǎng)時(shí)，需要適量的氧氣以維持其呼吸代謝和某些產(chǎn)物的合成，氧的不足會(huì)造成代謝異常，產(chǎn)量降低。發(fā)酵過(guò)程中好氧菌只能利用溶解氧。因此，必須向發(fā)酵液中連續(xù)補(bǔ)充大量的氧，并要不斷攪拌，提高氧在發(fā)酵液中的溶解度；同時(shí)通過(guò)控制基質(zhì)濃度以達(dá)到合適的菌體濃度；調(diào)節(jié)溫度、液化培養(yǎng)基等方式，滿足菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成時(shí)對(duì)氧的需求。（三）發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行微生物深層培養(yǎng)的設(shè)備統(tǒng)稱發(fā)酵罐。好氧發(fā)酵設(shè)備厭氧發(fā)酵設(shè)備通風(fēng)攪拌式發(fā)酵罐機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐通用式發(fā)酵罐自吸式發(fā)酵罐循環(huán)式通風(fēng)發(fā)酵罐高位塔式發(fā)酵罐1、機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐1）通用式發(fā)酵罐封閉式，帶罐壓操作；具有機(jī)械攪拌和壓縮空氣分布裝置，容積為20cm3～200m3，最大可達(dá)500m3。機(jī)械攪拌：打碎、分散氣泡增加溶氧量，混合物料。常用渦輪攪拌器（中央有圓盤(pán)，防止氣泡在阻力較小的攪拌器中心部位沿著軸周邊上升逸出）。攪拌軸：從罐頂伸入罐內(nèi)，也采用下伸（>100m3）。傳熱裝置：夾套（<5m3）和蛇管（>5m3）傳熱降溫。擋板：加強(qiáng)攪拌，促使液體上下翻動(dòng)和控制流型，消除渦流。消泡裝置：耙式消泡槳打碎泡沫。大型發(fā)酵罐及其攪拌裝置180M3發(fā)酵罐車間給發(fā)酵罐供氧的大型空氣壓縮機(jī)小型通用式發(fā)酵罐（夾套傳熱）大中型通用式發(fā)酵罐（蛇形管傳熱）下伸式攪拌軸擋板可消除渦流耙式消泡槳的位置及形態(tài)2）自吸式發(fā)酵罐

罐體結(jié)構(gòu)與通用式發(fā)酵罐類似，攪拌器的形狀和結(jié)構(gòu)不同（帶中央吸氣口的攪拌器）。浸在發(fā)酵液中的轉(zhuǎn)子迅速旋轉(zhuǎn)，液體和空氣在離心力作用下被甩向葉輪外緣，中心形成負(fù)壓，轉(zhuǎn)子的空膛與大氣相通，發(fā)酵罐外的空氣通過(guò)過(guò)濾器不斷被吸入，轉(zhuǎn)子的攪拌使氣體分散并與發(fā)酵液充分混合，沿葉輪末端排出，向罐壁分散，經(jīng)擋板折流涌向液面，均勻分布于整個(gè)發(fā)酵罐。

無(wú)需空氣壓縮機(jī)供氧，動(dòng)力消耗小于通用式發(fā)酵罐，進(jìn)罐空氣處于負(fù)壓，染菌機(jī)會(huì)增加；攪拌轉(zhuǎn)速高，菌絲被切斷，影響菌體正常生長(zhǎng)。自吸式發(fā)酵罐自吸式發(fā)酵罐轉(zhuǎn)子結(jié)構(gòu)自吸式發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)2、通風(fēng)攪拌式發(fā)酵罐

無(wú)機(jī)械性攪拌裝置，利用通入發(fā)酵罐的空氣，供給微生物所需要的氧并且代替攪拌器使發(fā)酵液均勻混合。1）通風(fēng)（空氣帶升環(huán)流式或帶升式）發(fā)酵罐利用空氣的動(dòng)力（空氣噴嘴的作用）使液體在循環(huán)管中上升，罐內(nèi)液體下降，并沿此路線反復(fù)循環(huán)，代替攪拌器將發(fā)酵液均勻混合。分為內(nèi)循環(huán)式和外循環(huán)式兩種。循環(huán)式通風(fēng)發(fā)酵罐高位塔式發(fā)酵罐a、內(nèi)循環(huán)式b、外循環(huán)式（7.空氣噴嘴）帶升式發(fā)酵罐2）高位塔式發(fā)酵罐

類似于塔式反應(yīng)器，高徑比約為7左右，罐內(nèi)裝有若干塊篩板，壓縮空氣由罐底導(dǎo)入，經(jīng)過(guò)篩板逐漸上升，并帶動(dòng)發(fā)酵液同時(shí)上升，上升后的發(fā)酵液又通過(guò)篩板上帶有液封作用的降液管下降而循環(huán)。以培養(yǎng)飼料蛋白時(shí)使用的大規(guī)模氣升式發(fā)酵罐為典型。大規(guī)模氣升式發(fā)酵罐高位塔式發(fā)酵罐3、厭氧發(fā)酵罐

不需供氧，設(shè)備和工藝都較簡(jiǎn)單。排除發(fā)酵罐中的氧，應(yīng)盡量裝滿發(fā)酵液，以便減少上層氣相的影響，有時(shí)還需充入無(wú)氧氣體。需使用大劑量接種(一般接種量為總操作體積的10％-20％)，使菌體迅速生長(zhǎng)，減少其對(duì)外部氧滲入的敏感性。酒精、丙酮、丁醇、乳酸和啤酒等都是采用液體厭氧發(fā)酵工藝生產(chǎn)的。具有代表性的厭氧發(fā)酵設(shè)備如酒精發(fā)酵罐和用于啤酒生產(chǎn)的錐底立式發(fā)酵罐。有冷卻裝置，無(wú)通風(fēng)設(shè)備酒精發(fā)酵罐錐底立式發(fā)酵罐——啤酒生產(chǎn)（四）產(chǎn)物分離提純（下游加工過(guò)程）從發(fā)酵液（含細(xì)胞、代謝產(chǎn)物和剩余培養(yǎng)基）中分離、精制有關(guān)發(fā)酵產(chǎn)品的過(guò)程稱為發(fā)酵生產(chǎn)的下游加工過(guò)程，包括發(fā)酵液預(yù)處理和固液分離、提取、精制以及成品加工四個(gè)階段。

發(fā)酵產(chǎn)物不同，分離提純的方法會(huì)有所不同，產(chǎn)物分離、提純的一般方法是：

a.代謝產(chǎn)物：蒸餾、萃取、離子交換、超濾等

b.菌體本身：過(guò)濾、沉淀，如單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)。下游加工過(guò)程的一般流程（沉淀、吸附、萃取、超濾、結(jié)晶）發(fā)酵液初步純化細(xì)胞碎片分離細(xì)胞破碎細(xì)胞分離高度純化成品加工預(yù)處理胞外產(chǎn)物（加熱、調(diào)pH、絮凝）（過(guò)濾、離心分離、膜分離)（勻漿、研磨、酶解）（離心分離、雙水相萃取、膜分離）（重結(jié)晶、離子交換、色譜分離、膜分離）（濃縮、無(wú)菌過(guò)濾、干燥、成型）胞外產(chǎn)物精制——產(chǎn)品的收得率和質(zhì)量控制。提取處理目的：

改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)（黏度、顆粒、顆粒穩(wěn)定性等），固液分離速度，分離器分離效率；目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移其中一相（多數(shù)為液相）；去雜質(zhì)離子（Ca2+、Mg2+、Fe3+等）；除蛋白。

預(yù)處理方法：加熱、調(diào)pH值、凝聚處理完成后用板框壓濾機(jī)，使菌絲與濾液分開(kāi)，便于進(jìn)一步提取。（1）懸浮液的預(yù)處理（2）提取

對(duì)存在于濾液或離心上清液中的活性物質(zhì)進(jìn)行濃縮，減小溶液體積，提高濃度。目前常用的提取方法有吸附法、超濾法、萃取法、離子交換法和沉淀法等。（3）精制提高濃縮液中活性物質(zhì)純度，可用沉淀、超濾、層析（大分子蛋白）、結(jié)晶（小分子物質(zhì)）。

（4）成品加工經(jīng)提取和精制后，有些產(chǎn)品還需要濃縮、無(wú)菌過(guò)濾和去熱原、干燥、加穩(wěn)定劑等加工步驟。濃縮可采用升膜或降膜式的薄膜蒸發(fā)或者采用膜過(guò)濾的方法。對(duì)熱敏性物質(zhì)可用離心薄膜蒸發(fā)進(jìn)行濃縮；使用超濾膜過(guò)濾時(shí)，可同時(shí)達(dá)到除熱原和除菌的目的。干燥是固體產(chǎn)品加工的最后一道工序，方法根據(jù)物料性質(zhì)、物料狀況及當(dāng)?shù)鼐唧w條件而定，可選用真空干燥、紅外線干燥、沸騰干燥、氣流干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等方法。四、固體發(fā)酵

生長(zhǎng)需水很少的微生物，可利用疏松而含有必要營(yíng)養(yǎng)的固體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，稱為固體發(fā)酵（淺層和厚層發(fā)酵）。以經(jīng)濟(jì)易得、富含營(yíng)養(yǎng)的工農(nóng)業(yè)中的副、廢產(chǎn)品為原料。如麩皮、高粱等。

進(jìn)行開(kāi)放式發(fā)酵，無(wú)菌要求不高，傳統(tǒng)的釀酒、制醬、蘑菇的生產(chǎn)、奶酪制作及動(dòng)植物廢料的堆肥等。具有節(jié)水、節(jié)能的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，屬于清潔生產(chǎn)技術(shù)，現(xiàn)已逐步得到重視但還未解決不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的問(wèn)題。五、典型產(chǎn)品的發(fā)酵生產(chǎn)1、抗生素發(fā)酵生產(chǎn)——青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)抗生素是微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，低濃度下抑制或殺滅活細(xì)胞，選擇性強(qiáng)。目前發(fā)現(xiàn)的6000多種抗生素中，約60％來(lái)自放線菌。青霉素是最早發(fā)現(xiàn)并用于臨床的一種抗生素。它于1928年為英國(guó)人Fleming發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)40年代投入工業(yè)生產(chǎn)，它能有效地控制傷口的細(xì)菌感染，在二戰(zhàn)期間挽救了