河南科技大學(xué)微生物工程學(xué)課件第二章菌種2、3節(jié)

第二節(jié)菌種來源Chapter1continued一、分離與篩選的設(shè)計要求1.在篩選所需菌株時應(yīng)考慮以下一些重要指標(biāo)：1、菌的營養(yǎng)特征一般要求采用廉價的培養(yǎng)基或使用來源豐富的原料2、菌的生長溫度(較高溫)3、菌的穩(wěn)定性(連續(xù)幾代)4、菌的產(chǎn)物得率和產(chǎn)物在培養(yǎng)液中的濃度5、菌對所采用的設(shè)備和生產(chǎn)過程的適應(yīng)性6、容易從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物3-6是用來衡量菌種的生產(chǎn)性能，如能滿足這幾條，便有希望成為效益高的生產(chǎn)菌株1.菌種分離的一般過程(引入選擇壓力)樣品的采取→

預(yù)處理→

富集培養(yǎng)→

菌落的選擇→產(chǎn)品的鑒定目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物二、菌種分離與篩選工作程序2.培養(yǎng)分離中要解決的問題“分離什么和從哪里分離出?”必須充分考慮所分離微生物的生產(chǎn)能力、生長速度、生物群體培養(yǎng)和產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及其提純的難易和費用，工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中穩(wěn)定性及遺傳操作的難易程度等。選擇適宜的培養(yǎng)分離方法和檢測方法。三、含微生物樣品的采集較復(fù)雜；應(yīng)根據(jù)分離目的靈活掌握土壤（豐富、5-25cm、土質(zhì)、酸堿度、植被狀況、地理條件、季節(jié)）食品、海水、動物、植物、極端環(huán)境根據(jù)微生物的營養(yǎng)類型采樣森林土中有相當(dāng)多枯枝落葉和腐爛的木頭，富含纖維素，適合利用纖維素作碳源的纖維素酶產(chǎn)生菌生長。肉類加工廠附近、飯店排污溝，易分離到蛋白酶和脂肪酶產(chǎn)生菌。面粉加工廠等場所易分離到產(chǎn)淀粉酶、糖化酶的菌根據(jù)微生物的生理特性采樣篩選高溫酶產(chǎn)生菌通常從溫泉、火山爆發(fā)處、堆肥等采樣；篩選產(chǎn)低溫酶的微生物，可從冰窖、南極、深海等采樣分離耐高滲透壓酵母菌，可到甜果、蜜餞、甘蔗渣堆積處采樣楊尺蠖赤松毛蟲側(cè)柏毛蟲四、含微生物樣品的富集培養(yǎng)富集(enrichment)培養(yǎng)

是在目的微生物含量較少時，根據(jù)微生物的生理特點，設(shè)計一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長條件，使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長繁殖，數(shù)量增加，由原來自然條件下的劣勢種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢種，以利分離到所需的菌株。其要領(lǐng)是提供一些有利于所需菌株生長或不利于其他菌型生長的條件，例如，供給特殊的基質(zhì)或加入某些抑制劑?？刂蒲蹩蓪⒑醚跷⑸锖蛥捬跷⑸锓珠_；高溫下培養(yǎng)可將嗜熱微生物和非嗜熱微生物分開；控制pH可分離嗜酸或嗜堿微生物；高糖或高鹽培養(yǎng)基可分離耐高滲透壓微生物；在分離培養(yǎng)中加入抗生素或某試劑可增加選擇性

如分離真菌可在土豆培養(yǎng)基中加入鏈霉素；分離細(xì)菌或放線菌可在培養(yǎng)基中加入制霉菌素等重復(fù)移植幾次后接種少量已富集的培養(yǎng)物到固體培養(yǎng)基上。移植時間是關(guān)鍵，應(yīng)在所需菌種確已占優(yōu)勢的情況下進(jìn)行。五、利用固體平板的生化反應(yīng)進(jìn)行分離（方法之一）

利用特殊的分離培養(yǎng)對大量混雜微生物進(jìn)行初步分離的方法。

分離培養(yǎng)基是根據(jù)目的微生物特殊的生理特性或利用某些代謝產(chǎn)物生化反應(yīng)來設(shè)計的。

可顯著提高分離效率透明圈法變色圈法生長圈法抑菌圈法1、透明圈法

分離水解酶產(chǎn)生菌時較多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；

在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁；

能分解底物的微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應(yīng)菌株利用底物的能力。土壤經(jīng)巴氏消毒，以減少不產(chǎn)芽孢的微生物；然后鋪在pH8-9的瓊脂培養(yǎng)基（含有均勻的不溶性蛋白質(zhì)－酪蛋白）表面；堿性蛋白酶產(chǎn)生菌能消化平板上的不溶性蛋白質(zhì)，產(chǎn)生一透明圈。例如用此法分離產(chǎn)生堿性蛋白酶的芽孢桿菌

分離某種產(chǎn)生有機酸的菌株時，也通常采用透明圈法初篩

在選擇培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板呈混濁狀，產(chǎn)酸菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈2、變色圈法

對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使目的微生物菌落周圍呈現(xiàn)變色圈，從而能被快速鑒別出來；用含0.2%果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基平板，對含微生物樣品進(jìn)行分離，待菌落長成后，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現(xiàn)絳紅色水解圈。如篩選果膠酶產(chǎn)生菌甘油三丁酸酯為底物羅丹明B為指示劑熒光圈又如分離解脂微生物豆油作底物中性紅（紅～黃.6.8～8.0.）指示菌落周圍呈紅色圈3、生長圈法

通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌將待檢菌涂布于高濃度工具菌并缺少所需營養(yǎng)物的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍便會形成一個混濁的生長圈

工具菌（指示菌）是一些相對應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株如嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌4、抑菌圈法

常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選據(jù)估計，篩選1萬個菌株才能得到1株有用的抗生素產(chǎn)生菌；因此，設(shè)計一個準(zhǔn)確、快速的篩選模型十分重要。抑菌圈法是常用的初篩方法

工具菌采用抗生素的敏感菌若被檢菌能分泌某些抑制菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈

透明圈的大小不能完全作為選擇高產(chǎn)菌的依據(jù)，因為在深層培養(yǎng)中的產(chǎn)酶單位與平板上圈的大小之間并不完全成正比。

但作為初篩的手段是有意義的第三節(jié)菌種選育菌種選育

應(yīng)用微生物遺傳和變異理論，用人工方法(或自然)造成變異，再經(jīng)過篩選以得到人們所需菌種的過程。

菌種選育的目的是為了不斷提高發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，增加新產(chǎn)品和適應(yīng)工藝改革的要求。菌種選育的方向是選育“吃粗糧”、耐高溫、生長快、代謝旺、產(chǎn)量高、質(zhì)量好、無毒性的優(yōu)良菌株。自然選育誘變育種雜交育種(有性、準(zhǔn)性)原生質(zhì)體融合育種基因工程育種一、自然選育

在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的過程叫自然選育。

自發(fā)突變(spontaneousmutation)，也稱自然突變，指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變，但這決不意味著這種突變是沒有原因的。

一般認(rèn)為引起自然突變有兩個原因：即多因素低劑量的誘變效應(yīng)和互變異構(gòu)效應(yīng)。

多因素低劑量的誘變效應(yīng)是指自然突變實際上是由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素引起的長期綜合效應(yīng)，例如充滿宇宙空間的各種短波輻射、自然界中普遍存在的一些低濃度誘變物質(zhì)（基站、地板磚）自身代謝活動中所產(chǎn)生的一些誘變物質(zhì)（如過氧化氫等）自然突變兩種情況：生產(chǎn)上所不希望的：菌種的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量下降對生產(chǎn)有益的：生產(chǎn)性能提高制備單孢子（單細(xì)胞）懸液適當(dāng)稀釋在固體平板上分離挑取部分單菌落進(jìn)行生產(chǎn)能力測定經(jīng)反復(fù)篩選以確定生產(chǎn)能力更高的菌株替代原來的菌株自然選育的一般程序：

自然選育簡單易行，可以達(dá)到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量等目的。（逆水行舟，不進(jìn)則退）自然選育的最大缺點是效率低、進(jìn)展慢，很難使生產(chǎn)水平大幅度提高。二、誘變育種

誘變育種就是人為地利用物理或化學(xué)等因素，使誘變對象細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，引起突變，并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。

誘變育種不僅可以提高菌種的生產(chǎn)能力，且可改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量、擴大品種和簡化生產(chǎn)工藝。

目前發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用的生產(chǎn)菌株大部分是誘變育種得來的。以青霉素為例，1943年開始生產(chǎn)時的效價僅為20U/ml，通過多次誘變育種現(xiàn)已達(dá)50000-100000U/ml。雖然遺傳工程等新的育種方法迅速發(fā)展，但誘變育種仍是目前廣泛使用的育種手段。一）誘變育種的一般步驟原始菌株（出發(fā)菌株）細(xì)胞或孢子懸液制備活細(xì)胞計數(shù)誘變劑處理活細(xì)胞計數(shù)中間培養(yǎng)突變株分離初篩復(fù)篩生產(chǎn)性能試驗誘變預(yù)備處理誘變育種的工作程序1、出發(fā)菌株的選擇選擇時注意以下幾點：1）選擇對誘變劑敏感性強、變異幅度大的菌株作為出發(fā)菌株。2）最好選用已經(jīng)過選育的自發(fā)突變菌株。3）采用具有有利性狀的菌株作為親本，如生長速度快，營養(yǎng)要求低等。4）由于有些菌株在發(fā)生某一變異后會對其它誘變因素的敏感性提高，故有時可考慮選擇已發(fā)生其它變異的菌株作為出發(fā)菌株。例如，在金霉素生產(chǎn)菌的誘變中，失去（黃色）色素的變異菌株作為出發(fā)菌株則產(chǎn)量會不斷提高。2、單細(xì)胞（或單孢子）懸液制備一般均采用生理狀態(tài)一致的單細(xì)胞或單孢子懸液進(jìn)行誘變處理。因為

1）分散狀態(tài)的細(xì)胞可均勻地接觸誘變劑

2）可避免長出不純的菌落。霉菌的菌絲一般是多核的，所以對霉菌的處理一般應(yīng)采用孢子懸浮液。3、誘變劑及使用劑量的選擇凡能引起生物體遺傳物質(zhì)發(fā)生變異的因素，統(tǒng)稱誘變劑。如紫外線、X-射線、Co60、-射線、快中子、超聲波，等離子等硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍

(NTG)、亞硝酸(NA)、氮芥(NM)、羥胺、ICR類等誘變劑物理誘變劑化學(xué)誘變劑紫外線(Uv)

使用歷史較久、廉價、危險性小、效果好，應(yīng)用較廣

對誘變最有效的波長是260nm左右(253-265nm)

作用機制主要是形成胸腺嘧啶二聚體以改變DNA生物活性,造成菌體變異甚至死亡.快中子

中子是不帶電荷的粒子，可由回旋加速器、靜電減速器或原子反應(yīng)堆產(chǎn)生。中子不直接產(chǎn)生電離，但能使吸收中子的物質(zhì)的原子核射出質(zhì)子，因而快中子的生物學(xué)效應(yīng)幾乎完全是由質(zhì)子造成的。中子分為快中子和慢中子。快中子的能量為0.2-10百萬電子伏特，慢中子能量為1/4至100電子伏特。慢中子的效應(yīng)同射線、射線和電子等照射時引起的基本相同，快中子較X射線、射線具有較大的電離密度，因而能更多地引起點突變和染色體畸變。氮芥

氮芥為極易揮發(fā)的油狀物，它的鹽酸鹽是白色粉末，一般使用的是其鹽酸鹽。

應(yīng)用時先使氮芥鹽酸鹽與碳酸氫鈉其作用，釋放出氮芥子氣，再與細(xì)胞起作用而造成變異。氮芥的誘變機制是它能引起染色體畸變。是被使用得最早的一種誘變劑。亞硝酸

常用的有效誘變劑，其誘變作用主要是脫去堿基中的氨基。

亞硝酸A——H（次黃嘌呤）C——UG——X（黃嘌呤）

亞硝酸很不穩(wěn)定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐繼續(xù)分解放出NO和NO2。所以，可在臨用前將亞硝酸鈉放在pH4.5的醋酸緩沖液中，使先生成亞硝酸然后再使用。亞硝基胍(NTG)

是亞硝基烷基類化合物，可誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變，不經(jīng)淘汰便可直接得到12%至80%的營養(yǎng)缺陷型菌株，有超級誘變劑之稱。在緩沖液中較難溶解，而在甲酰胺中溶解度較大，因此用甲酰胺溶解，可以提高處理濃度。通常在濃度為30ug/ml、溫度為28oC和時間為60min的條件下進(jìn)行處理，容易得到高產(chǎn)菌株。劑量確定誘變劑后，誘變劑劑量的選擇也是育種工作的一個關(guān)鍵問題。對一般微生物而言，誘變率往往隨誘變劑劑量的增高而增高，但達(dá)到一定程度后，再提高劑量，反而會使誘變率下降。目前的處理劑量已從以前采用的死亡率90-99.9%降低到70-80%，甚至更低的劑量，特別是對于經(jīng)過一再誘變的高產(chǎn)菌株。

凡既能增加變異幅度，又能促使變異向正變范圍移動的劑量就是合適劑量。處理方法單一誘變劑處理復(fù)合處理1）兩種或多種誘變劑先后使用2）同一誘變劑重復(fù)處理3）兩種或多種誘變劑同時使用菌種單獨處理誘變劑突變率（%）復(fù)合處理誘變劑突變率（%）土曲霉紫外線X-射線21.319.7紫外線+X-射線42.8土曲霉氮芥（0.1%）紫外線不明顯4.7氮芥+紫外線11.0鏈霉菌紫外線-射線31.035.0紫外線+-射線43.6金色鏈霉菌二乙烯三胺硫酸二乙酯紫外線6.061.7812.5二乙烯三胺+紫外線硫酸二乙酯+紫外線26.635.9誘變劑的復(fù)合處理及其協(xié)同效應(yīng)4、誘變處理后的后培養(yǎng)表型遲延現(xiàn)象

生理性分離性遺傳物質(zhì)經(jīng)誘變處理后發(fā)生的突變，必須經(jīng)復(fù)制才能表現(xiàn)出來。研究表明，誘變后的一小時內(nèi)必須進(jìn)行新的蛋白質(zhì)合成，這個變異才有效。因此必須在完全培養(yǎng)基中