天津大學(xué)生物化學(xué)04第四章課件蛋白質(zhì)化學(xué)

第四章

蛋白質(zhì)化學(xué)第一節(jié)

蛋白質(zhì)的分子組成第二節(jié)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)第三節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第四節(jié)氨基酸、蛋白質(zhì)的分離與鑒定蛋白質(zhì)化學(xué)1(分類）

蛋白質(zhì)功能

形狀球蛋白：球形、易溶解。組成溶解性

纖維蛋白：形似纖維、不溶于水。單純蛋白：只有α－氨基酸，多數(shù)蛋白。清蛋白（白蛋白）：溶于水。球蛋白：微溶于水，溶于稀鹽。醇蛋白：不溶于水，溶于乙醇。綴合蛋白：與非蛋白質(zhì)物質(zhì)結(jié)合，如核、糖、脂蛋白?；钚缘鞍祝喝缑浮⒓に?，受體、膜蛋白。非活性蛋白：膠原蛋白、角蛋白、彈性蛋白。一、蛋白質(zhì)的元素組成二、組成蛋白質(zhì)分子的基本單位—氨基酸三、肽鍵與肽第一節(jié)蛋白質(zhì)的分子組成多數(shù)蛋白質(zhì)含:

碳(C)50～56%氫(H)6～8%

氧(O)19～24%氮(N)13～19%

硫(S)0～4%有些蛋白質(zhì)含有磷少數(shù)含鐵、銅、錳、鋅、鈷、鉬等個(gè)別還含有碘一、蛋白質(zhì)的元素組成1凱氏(Kjedahl)定氮法一、蛋白質(zhì)的元素組成2

每克樣品含氮的克數(shù)×6.25×100=100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(克%)（一）蛋白質(zhì)的水解（二）氨基酸的分類（三）不常見的氨基酸（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)二、氨基酸（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)1．酸水解2．堿水解3．酶水解（一）蛋白質(zhì)的水解（一）蛋白質(zhì)的水解1（酸水解）

常用方法：硫酸或鹽酸處理濃度:鹽酸為6mol/L

硫酸為4mol/L

條件:回流煮沸20小時(shí)左右優(yōu)點(diǎn):不引起消旋作用，得到L-氨基酸缺點(diǎn):色氨酸完全被沸酸所破壞羥基氨基酸（絲,蘇）部分被水解天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下來。（一）蛋白質(zhì)的水解1（堿水解）常用方法：用氫氧化鈉處理濃度:5mol/L條件:共煮10~20h優(yōu)點(diǎn):色氨酸穩(wěn)定缺點(diǎn):多數(shù)氨基酸遭到不同程度的破壞，并且產(chǎn)生消旋現(xiàn)象；所得為D型和

L型混合氨基酸；堿水解引起精氨酸脫氨，生成鳥氨酸和尿素。（一）蛋白質(zhì)的水解1（酶水解1）優(yōu)點(diǎn):不產(chǎn)生消旋作用，也不破壞氨基酸。缺點(diǎn):需要幾種酶協(xié)同作用，酶水解所需時(shí)間較長。

（一）蛋白質(zhì)的水解1（酶水解2）（牛胰蛋白酶）胰蛋白酶1（一）蛋白質(zhì)的水解1（酶水解2）NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點(diǎn)R1：賴氨酸（Lys）精氨酸（Arg）特點(diǎn)：專一性較強(qiáng)，水解速度快胰蛋白酶2（一）蛋白質(zhì)的水解1（酶水解3）糜蛋白酶1（一）蛋白質(zhì)的水解1（酶水解3）糜蛋白酶2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點(diǎn)R1：苯丙氨酸(Phe)色氨酸（Trp）蘇氨酸(Thr)亮氨酸(Leu)特點(diǎn)：水解稍慢（一）蛋白質(zhì)的水解1（酶水解4）胃蛋白酶1（一）蛋白質(zhì)的水解1（酶水解4）胃蛋白酶2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位點(diǎn)R1、R2：苯丙氨酸(Phe)色氨酸（Trp）蘇氨酸(Thr)亮氨酸(Leu)特點(diǎn)：水解速度較快

氨基酸是含有氨基的酸CHRCOO－H3N+(甘油醛的D型、L型)D-甘油醛L-甘油醛透視式投影式氨基酸的構(gòu)型L－氨基酸D－氨基酸（二）氨基酸的分類1（三種分類法）1．根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)分為：

（1）脂肪族氨基酸（2）芳香族氨基酸（3）雜環(huán)氨基酸2．根據(jù)酸堿性質(zhì)

（1）酸性氨基酸（2）堿性氨基酸（3）中性氨基酸3．根據(jù)R基團(tuán)的極性

（1）非極性R基氨基酸（2）極性R基氨基酸（不帶電荷的、帶正電荷的、帶負(fù)電荷的）（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸1一氨基一羧基氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號代號甘氨酸氨基乙酸GlycineGly(G)甘（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸2一氨基一羧基氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號代號丙氨酸-氨基丙酸AlanineAla(A)丙（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸3一氨基一羧基氨基酸3普通名稱化學(xué)名英文名代號代號纈氨酸-氨基異戊酸ValineVal(V)纈（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸4一氨基一羧基氨基酸4普通名稱化學(xué)名英文名代號代號亮氨酸-氨基異己酸LeucineLeu(L)亮（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸5一氨基一羧基氨基酸5普通名稱化學(xué)名英文名代號代號異亮氨酸-氨基--甲基戊酸IleucineIle(I)異亮（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸6一氨基二羧基氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號代號天冬氨酸-氨基丁二酸AspartateAsp(D)天（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸7一氨基二羧基氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號代號谷氨酸-氨基戊二酸GlutamateGlu(E)谷（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸7含酰胺基氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號代號天冬酰胺AsparagineAsn(N)（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸9含酰胺基氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號代號谷氨酰胺GlutamineGln(Q)（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸10二氨基一羧基氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號代號精氨酸-氨基--胍基戊酸ArginineArg(R)精（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸11二氨基一羧基氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號代號鳥氨酸-二氨基戊酸OrnithineOrn鳥（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸12二氨基一羧基氨基酸3普通名稱化學(xué)名英文名代號代號賴氨酸，-二氨基己酸LysineLys(K)賴（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸13羥基氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號代號絲氨酸-氨基--羥基丙酸SerineSer(S)絲

（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸14羥基氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號代號蘇氨酸-氨基--羥基丁酸ThreonineThr(T)蘇（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸15含硫基氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號代號半胱氨酸-氨基--巰基丙酸CysteineCys(C)半胱（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸16含硫基氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號代號胱氨酸二(-氨基--巰基丙酸)CysteineCys-Cys胱（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)1）脂肪族氨基酸17含硫基氨基酸3普通名稱化學(xué)名英文名代號代號甲硫氨酸(蛋氨酸)-氨基--甲硫基丁酸MethionineMet(M)甲硫（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)2）芳香族氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號代號苯丙氨酸-氨基--苯基丙酸PhenylalaninePhe(F)苯丙（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)2）芳香族氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號代號酪氨酸-氨基--對羥苯基丙酸TyrosineTyr(Y)酪（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)3）雜環(huán)氨基酸1普通名稱化學(xué)名英文名代號代號組氨酸-氨基--咪唑基丙酸HistidineHis(H)組（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)3）雜環(huán)氨基酸2普通名稱化學(xué)名英文名代號代號色氨酸-氨基--吲哚基丙酸TryptophanTrp(W)色（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)3）雜環(huán)氨基酸3普通名稱化學(xué)名英文名代號代號脯氨酸四氫吡咯-2-羧酸ProlinePro(P)脯亞氨基酸（二）氨基酸的分類1（據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)3）雜環(huán)氨基酸4普通名稱化學(xué)名英文名代號代號羥脯氨酸4-羥基吡咯烷-2-羧酸HydroxprolineHyp羥（二）氨基酸的分類2（據(jù)酸堿性質(zhì)）酸性氨基酸天冬氨酸谷氨酸（二）氨基酸的分類2（據(jù)酸堿性質(zhì)）堿性氨基酸賴氨酸精氨酸組氨酸（二）氨基酸的分類2（據(jù)酸堿性質(zhì)）中性氨基酸

含一氨基一羧基的氨基酸，包括兩種酸性氨基酸產(chǎn)生的酰胺（谷氨酰胺和天冬酰胺）。（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基因極性）非極性氨基酸1苯丙氨酸胱氨酸蛋氨酸甘氨酸丙氨酸纈氨酸亮氨酸異亮氨酸脯氨酸色氨酸（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基團(tuán)極性）非極性氨基酸2

甘氨酸按理屬于極性的，但因其α-碳上的氫受到易解離的α-氨基和α-羧基的影響，因此不體現(xiàn)極性。（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基團(tuán)極性）極性氨基酸1不帶電荷的酪氨酸半胱氨酸絲氨酸蘇氨酸天冬酰胺谷氨酰胺（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基團(tuán)極性）極性氨基酸2帶正電荷的(堿性氨基酸)賴氨酸精氨酸組氨酸（二）氨基酸的分類3（據(jù)R基團(tuán)極性）極性氨基酸3帶負(fù)電荷的(酸性氨基酸)天冬氨酸谷氨酸（三）不常見的氨基酸-丙氨酸-氨基丁酸其他見：南大P75

工科P45表4-2H2N-CH2-CH2-COOHH2N-CH2-CH2-CH2-COOH（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)1物理性質(zhì)物理性狀：無色結(jié)晶物。熔點(diǎn)：熔點(diǎn)高，一般在200℃以上。溶解性：通常能溶于極性溶劑,而不溶于非極性溶劑;各種氨基酸在水中的溶解度差別很大，并能溶解于稀酸或稀堿中。（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)1

氨基酸在溶液中主要以兼性離子形式存在CHRCOO－H3N+（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)2加酸時(shí)CHRCOOHH3N+H+H+總電荷“+”（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)3加堿時(shí)CHRCOO-H2N總電荷“－”O(jiān)H－OH－（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)5

當(dāng)溶液為某一pH值，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-數(shù)目正好相等時(shí)(凈電荷為0),這一pH值即為氨基酸的等電點(diǎn)，簡稱pI。在等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸既不向正極也不向負(fù)極移動，即氨基酸處于兩性離子狀態(tài)。（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)4COO－CHH3N+R+OH－+H+COO－CHH2NR+OH－+H+在酸性溶液中（pH＜pI）在晶體狀態(tài)或水溶液中（pH=pI）在堿性溶液中（pH＞pI）（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)7丙氨酸pI的計(jì)算COO－CH+H+H3N+CH3K1COOHCHH3N+CH3COO－CHH2NCH3K2Ala+Ala±Ala－K1=[Ala±][H+]/[Ala+][Ala+]=[Ala±][H+]/K1K2=[Ala－][H+]/[Ala±][Ala－]=[Ala±]K2/[H+]到達(dá)等電點(diǎn)時(shí)，[Ala+]=[Ala－]∴[Ala±][H+]/K1=[Ala±]K2/[H+]，即：K1K2=[H+]2兩邊取負(fù)對數(shù)：－lg[H+]2=－lgK1－lgK2∵－lg[H+]

=pH－lgK1=pK1－

lgK1=pK2∴2pH=pK1＋pK2令pI為等電點(diǎn)時(shí)的pH，則：pI＝（pK1＋pK2）/2（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)8天冬氨酸pI的計(jì)算Asp+Asp±Asp－COOHCHH3N+CH2COOHCOO－CHH3N+CH2COOHCOO－CHH2NCH2COOHK1KRK2Asp=COO－CHH2NCH2COO－等電點(diǎn)時(shí)為Asp±∴pI＝（pK1＋pKR）/2（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)9賴氨酸pI的計(jì)算Lys++Lys+Lys±COOHCHH3N+(CH2)4NH3+COO－CHH3N+(CH2)4NH3+COO－CHH2N(CH2)4NH3+K1K2KRLys－COO－CHH2NCH2NH2等電點(diǎn)時(shí)為Lys±∴pI＝（pK2＋pKR）/2（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)2兩性解離和等電點(diǎn)6側(cè)鏈不含解離基團(tuán)的中性氨基酸，其等電點(diǎn)是它的pK’1和pK’2的算術(shù)平均值：pI=(pK’1+pK’2)/2同樣，對于側(cè)鏈含有可解離基團(tuán)的氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊的pK’值的算術(shù)平均值。酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’R)/2堿性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R)/2

（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)3芳香族氨基酸的紫外吸收光譜1構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝275nm苯丙氨酸的max＝257nm色氨酸的max＝280nm（四）氨基酸的一般理化性質(zhì)3芳香族氨基酸的紫外吸收光譜2（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)α-氨基參加的反應(yīng)：亞硝酸反應(yīng)、2，4-二硝基氟苯反應(yīng)等。α-羧基參加的反應(yīng)：疊氮、脫羧、成鹽、成酯反應(yīng)。α-氨基和α-羧基共同參加的反應(yīng)：茚三酮反應(yīng)及成肽反應(yīng)。側(cè)鏈R基參加的反應(yīng)：（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)1α│氨基參加的反應(yīng)1與亞硝酸反應(yīng)原理：自由氨基能與亞硝酸反應(yīng)釋放出氮?dú)猓靠朔肿拥淖杂砂被缮梢豢朔肿拥獨(dú)?。在生產(chǎn)上常用此法來測定蛋白質(zhì)的水解程度。RCHCOOHNH2+HNO2RCHCOOHOH+N2↑+H2O（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)2α│氨基參加的反應(yīng)2

AADNFB+多肽蛋白+HF

DNP-AADNP-多肽

DNP-蛋白原理：在弱堿性溶液中，氨基酸的α-氨基很容易與DNFB作用，生成穩(wěn)定的黃色DNP-氨基酸（2，4一二硝基苯氨基酸）,多肽或蛋白質(zhì)N-末端氨基酸的α-氨基也能與DNFB反應(yīng)用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)NH2末端氨基酸,亦稱Sanger反應(yīng)。2，4一二硝基氟苯反應(yīng)1（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)2α│氨基參加的反應(yīng)22，4一二硝基氟苯反應(yīng)2RCHNH2+HF+NO2FNO2COOHRCHNCOOHHpH8~9NO2NO2DNP-氨基酸（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)2α│氨基參加的反應(yīng)22，4一二硝基氟苯反應(yīng)35—二甲氨基萘磺酰氯（丹磺酰氯）可以來代替DNFB。因?yàn)樗哂袕?qiáng)烈的熒光，可用熒光光度計(jì)快速檢出，靈敏度高。O=S=OClCH3NCH3（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)2α│氨基參加的反應(yīng)2丹磺酰氯反應(yīng)（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)2α│氨基參加的反應(yīng)3異硫氰酸苯脂反應(yīng)1用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)NH2末端氨基酸,亦稱Edman反應(yīng)。弱堿AAPITC+多肽蛋白AAPTC—多肽蛋白HFPTH-AA+少一個(gè)AA的多肽或蛋白異硫氰酸苯酯苯氨基硫甲酰--苯硫乙酰脲（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)2α│氨基參加的反應(yīng)3異硫氰酸苯脂反應(yīng)2NH2CHCOR2NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNCOCHNHSCR1PTH-氨基酸PTC-氨基酸HFpH8.3（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)3α│氨基參加的反應(yīng)1甲醛反應(yīng)RCHNH3+COO－HCHORCHNH3+NHCH2OHHCHORCHNH3+N(CH2OH)2羥甲基氨基酸二羥甲基氨基酸用途：進(jìn)行氨基酸的酸鹼滴定（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)3α│羧基參加的反應(yīng)疊氮反應(yīng)YNHCHCOOHRNH2NH2+2H2OYNHCHCONHNHRHNO2YNHCHCON3R用途：可活化羧基，常用于人工合成肽過程。?；被狨；被岬碾卵苌秕；被岑B氮（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)4α-氨基與α-羧基共同參加的反應(yīng)1茚三酮水合茚三酮茚三酮反應(yīng)1（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)4α-氨基與α-羧基共同參加的反應(yīng)1用途：常用于氨基酸的定性或定量分析茚三酮反應(yīng)2還原茚三酮茚三酮藍(lán)紫色物質(zhì)（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)4α-氨基與α-羧基共同參加的反應(yīng)1茚三酮反應(yīng)3脯氨酸及羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)產(chǎn)物N+黃色化合物（五）氨基酸的化學(xué)反應(yīng)4α-氨基與α-羧基共同參加的反應(yīng)2成肽反應(yīng)用途：是多肽和蛋白質(zhì)生物合成的基本反應(yīng)三、肽鍵與肽1CH3CHNH2COOH+CH2OHCHNH2COOHH2OCH3CHNH2COCH2OHCHNHCOOH(酰氨鍵)－N端－C端CNOH肽鍵三、肽鍵與肽2肽鍵

肽鍵就是由氨基酸的α-羧基與相鄰的氨基酸的α-氨基脫水縮合起來的鍵。三、肽鍵與肽3肽肽:氨基酸通過肽鍵連結(jié)起來的化合物。二肽:兩個(gè)氨基酸形成的肽。三肽:三個(gè)氨基酸形成的肽。多肽:許多氨基酸形成的肽。蛋白質(zhì):多是組成氨基酸超過100個(gè)的多肽。氨基酸殘基:氨基酸由于形成肽鍵而失去了一分子水，因此表現(xiàn)出其分子的不完整。末端氨基和末端羧基：縮合后的氨基酸，只在肽的兩端有自由的α-氨基和α-羧基，簡稱N-端和C-端。三、肽鍵與肽4肽鏈的命名肽鏈的命名：根據(jù)組成的氨基酸殘基來確定。規(guī)定從肽鏈的N-端殘基開始，依次稱為某氨基酰、氨基酰……某氨基酸。如：絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸NH2SerGlyTryAlaLeuCOOHNH2

SerGlyTryAlaLeuCOOH三、肽鍵與肽5二硫鍵1二硫鍵：是由二個(gè)半胱氨酸殘基的側(cè)鏈之間形成的。即胱氨酸的殘基中的二硫鍵。二硫鍵類型：可以使兩條單獨(dú)的肽鏈共價(jià)交聯(lián)起來（鏈間二硫鍵）；也可以使一條鏈的某一部分形成環(huán)（鏈內(nèi)二硫鍵）。三、肽鍵與肽5二硫鍵2二硫鍵半胱氨酸

胱氨酸H2半胱氨酸CHNH2COOHCH2SCHNH2COOHCH2S三、肽鍵與肽5二硫鍵3鏈間二硫鍵NHCHCONHCHCONHCHCOR1R2CH2SSCH2NHCHCONHCHCONHCHCOR3R4二硫鍵HSCH2CHCOO－NH3+半胱氨酸三、肽鍵與肽5二硫鍵2鏈內(nèi)二硫鍵第二節(jié)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的研究方法三、肽的人工合成原理一、蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)四、蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象一、蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)1☆一級結(jié)構(gòu)是氨基酸按一定的排列順序構(gòu)成的蛋白質(zhì)肽鏈骨架。☆多肽鏈的氨基酸順序。☆多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)是由數(shù)條多肽鏈組成。一級結(jié)構(gòu)(Primarystructure)的含義一、蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)2一、蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)3胰牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)1一、蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)3我國1965年在世界上第一個(gè)用化學(xué)方法人工合成的蛋白質(zhì)就是這種牛胰島素。胰牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)2二、一級結(jié)構(gòu)的研究方法11.樣品必需純（>97%以上）。2.知道蛋白質(zhì)的分子量。3.知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成。4.測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。5.測定水解液中的氨量，計(jì)算酰胺的含量。測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的要求二、一級結(jié)構(gòu)的研究方法2（一）測定氨基酸的組成（二）蛋白質(zhì)的N-末端和C-末端的測定（三）二硫鍵的拆開和肽鏈的分離（四）肽鏈的部分水解和肽段的分離（五）肽段的氨基酸順序的測定（六）二硫鍵位置的確定（二）蛋白質(zhì)N-末端和C-末端測定1N-末端殘基的分析1二硝基氟苯（DNFB）法（α-氨基反應(yīng)）Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。（二）蛋白質(zhì)N-末端和C-末端測定1N-末端殘基的分析2二甲基氨基萘磺酰氯（稱丹磺酰氯）法在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達(dá)到110-9mol。（二）蛋白質(zhì)N-末端和C-末端測定1N-末端殘基的分析3異硫氰酸苯酯（PITC）法此法最大優(yōu)點(diǎn)是除去N末端氨基酸后剩下的肽鏈部分仍是完整的。因此，可以用來一步步地測定多肽鏈N末端的氨基酸順序。氨基酸分析儀就是根據(jù)此原理制成的。NH2CHCOR2NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNCOCHNHSCR1（二）蛋白質(zhì)N-末端和C-末端測定1N-末端殘基的分析4氨肽酶法氨肽酶是從胰腺中提取是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個(gè)的向里水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。（二）蛋白質(zhì)N-末端和C-末端測定2C-末端殘基的分析1硼氫化鋰還原法(α-羧基反應(yīng))RCHCOOHNH2LiBH4還原RCHCH2OHNH2α-氨基醇可以用層析法加以鑒定（二）蛋白質(zhì)N-末端和C-末端測定2C-末端殘基的分析2肼解法(α-羧基反應(yīng))多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。（二）蛋白質(zhì)N-末端和C-末端測定2C-末端殘基的分析3羧肽酶法1羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個(gè)的水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y。A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。但實(shí)際有時(shí)相連的氨基酸以相近的速度釋放，結(jié)果不好分析。（二）蛋白質(zhì)N-末端和C-末端測定2C-末端殘基的分析3羧肽酶法2氨基酸的釋放量（摩爾數(shù)）反應(yīng)時(shí)間GlySerVal判斷序列-Val-Ser-Gly-COOH（三）二硫鍵的拆開和肽鏈的分離1如果肽鏈之間是以二硫鍵交連的，或者雖然蛋白質(zhì)分子由一條肽鏈構(gòu)成，有鏈內(nèi)的二硫鍵，則必須采取一些方法將二硫鍵拆開。最普遍的方法是用過量的巰基乙醇處理，然后用碘乙酸保護(hù)還原時(shí)生成的半胱氨酸巰基，以防它重新被氧化。二硫鍵拆開后形成的個(gè)別肽鏈，可能用紙層析、離子交換柱層析、逆流分溶、區(qū)帶電泳等方法進(jìn)行分離。（三）二硫鍵的拆開和肽鏈的分離2SH+SHSSHOCH2CH2SHICH2COOH

涉及反應(yīng)pH8.0~9.0,室溫SCH2COO（四）肽鏈部分水解和肽段分離此步驟是測定氨基酸順序工作中的一個(gè)關(guān)鍵步驟。通常是選擇了專一性很強(qiáng)的蛋白酶來完成的。最理想的酶是胰蛋白酶，它很容易得到結(jié)晶純品。胰蛋白酶專門水解由堿性氨基酸（賴氨酸或精氨酸）的羧基參加形成肽鍵。所以水解后的產(chǎn)物C-端為賴氨酸或精氨酸。經(jīng)常使用的還有糜蛋白酶、胃蛋白酶及專一性較差的嗜熱菌蛋白酶、溴化氰等。各種酶的作用位點(diǎn)參見北大P122。多肽鏈經(jīng)部分水解后，即降解成長短不一的較小肽段，這些肽段可以應(yīng)用層析和電泳加以分離和提純。（五）肽段的氨基酸順序的測定1

測定多肽鏈中分離出來的各個(gè)小肽段，可以應(yīng)用化學(xué)方法或酶學(xué)方法測出其中的氨基酸順序。然后比較用不同方法獲得的幾套肽段的氨基酸順序，根據(jù)它們彼此有重疊的部分，確定每個(gè)肽段的適當(dāng)位置。拼湊出整個(gè)肽鏈的氨基酸順序。

（五）肽段的氨基酸順序的測定2肽順序A1B1A2B2

A3B3

A4Ala.Phe(丙-苯丙)Ala.Phe.Gly.Lys(甘-賴)Gly.Lys.Asn.Tyr(-天冬酰-酪)Asn.Tyr.Arg(-精)Arg.Tyr(-酪)Tyr.His(-組)His.Val(-纈)十肽順序Ala.Phe.Gly.Lys.Asn.Tyr.Arg.Tyr.His.Val（六）二硫鍵位置的確定1一般可用蛋白酶或酸直接水解原來的蛋白質(zhì)，從部分水解產(chǎn)物中分離出含有二硫鍵的肽段，所得到的肽段混合物可用Brown及Harltay的對角線電泳技術(shù)進(jìn)行分離，確定二硫鍵位置。確定二硫鍵位置一般用胃蛋白酶水解原來的含二硫鏈的蛋白質(zhì)。因?yàn)槲傅鞍酌笇Ｒ恍暂^低，切點(diǎn)多，這樣生成的肽段（包括含有二硫橋的肽段）都比較小，后面的分離、鑒定工作均比較容易進(jìn)行。其次是胃蛋白酶的pH在酸性范圍（～2），有利于防止二硫鍵發(fā)生交換反應(yīng)而造成麻煩。（六）二硫鍵位置的確定2Brown和Hartlay對角線電泳圖解+-+-第二向第一向abpH6.5圖中a、b兩個(gè)斑點(diǎn)是由一個(gè)二硫鍵斷裂產(chǎn)生的肽段三、肽的人工合成原理1（總合成步驟）1．加保護(hù)基Y，保護(hù)氨基酸甲的自由氨基（-NH2）。2．加保護(hù)基Z，保護(hù)氨基酸乙的自由羧基(-COOH)(此反應(yīng)同時(shí)活化了氨基）。3．加活化基X，使加保護(hù)基Y的氨基酸甲的羧基活化。4．使-NH2被保護(hù)羧基被活化的氨基酸甲，同羧基被保護(hù)氨基被活化的氨基酸乙結(jié)合成肽。5．脫保護(hù)基Y和Z。

三、肽的人工合成原理2（分合成步驟）

1．加保護(hù)基Y來保護(hù)氨基酸甲的自由氨基（-NH2）。R1CHCOO－＋YNH3＋R1CHCOO－Y.NH三、肽的人工合成原理2（分合成步驟）

2．加保護(hù)基Z來保護(hù)氨基酸乙的自由羧基(-COOH)(此反應(yīng)同時(shí)活化了氨基）。R1CHCOO－＋ZNH3＋R1CHCOOZNH2三、肽的人工合成原理2（分合成步驟）

3．加活化基X使加保護(hù)基Y的氨基酸甲的羧基活化。R2CHCOO－+XY.NHR2CHCOXY.NH三、肽的人工合成原理2（分合成步驟）

4．使-NH2被保護(hù)羧基被活化了的氨基酸甲,同羧基被保護(hù)氨基被活化了的氨基酸乙結(jié)合成肽。R2CHCOOZNH2R1CHCOX＋Y.NHR1CHCOY.NHR2CHCOOZ＋HXNH三、肽的人工合成原理2（分合成步驟）

5．脫保護(hù)基Y和Z。R1CHCOY.NHR2CHCOOZ＋HXNH

脫保護(hù)基劑R1CHCONH3+R2CHCOO－NH三、肽的人工合成原理3（肽鏈的延長)如果欲再延長肽鏈，可將保護(hù)基Y或Z去掉一個(gè)，所得含自由氨基或自由羧基的肽，按照上述3,4步進(jìn)行即可。三、肽的人工合成原理4（常用X,Y,Z)常見的氨基保護(hù)基Y：對甲苯磺酰基（tosyl或Tos基）、芐氧羰基(C6H5CH2O—CO-，CbZ基)。叔丁氧羰基(CCH3)3CO-CO-，Boc基）或三苯甲基（C6H5）3-C即lrityl基。羧基活化基X：可用PCl5使氨基酸酰氯化，即將羧基變?yōu)椤狢OCl基。也可用聯(lián)氨和HNO2使羧基疊氮化成-CON3。羧基保護(hù)基Z：可用酯化或皂化使羧基變?yōu)?COOC2H5或-COONa，此反應(yīng)同時(shí)亦活化了氨基。三、肽的人工合成原理5（合成方法)液相合成法：合成在溶液中進(jìn)行，這種方法費(fèi)力，目前不被采用。固相合成法：采用固相支持物，反應(yīng)在支持物上進(jìn)行。常用的支持物如：苯乙烯與二乙烯基苯的共聚物，再經(jīng)氯甲基化而成，簡稱氯甲基聚乙烯樹脂。（利用樹脂合成肽的流程見南大P100）。多肽的合成1多肽的合成2四、蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象1(目錄）(一)研究構(gòu)象的方法(二)蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)(三)蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)

(四)蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)四、蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象2(定義）蛋白質(zhì)分子的三維構(gòu)象也稱空間結(jié)構(gòu)或高級結(jié)構(gòu)。指的是蛋白質(zhì)分子中原子基團(tuán)在三維空間上的排列、分布及肽鏈的走向。

四、蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象3(示例1蛋白酶抑制劑）四、蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象3(示例2蝦紅素）四、蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象3(示例3木瓜及組織蛋白酶）四、蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象3(示例4雞半胱氨酸抑制劑）四、蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象3(示例5）(一)研究構(gòu)象的方法1其原理與光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡的原理基本相似，但光源波長很短。

λ=0.154nm，為一衍射波，得到一張衍射圖。經(jīng)數(shù)學(xué)方法重組，繪出電子密度圖，從中構(gòu)建出三維分子圖象——分子結(jié)構(gòu)模型。

1．X-射線衍射法：(一)研究構(gòu)象的方法22．重氫交換法和旋光色散法：測定蛋白質(zhì)分子中α-螺旋體的含量。3．核磁共振光譜法：測定蛋白質(zhì)分子中哪個(gè)氨基酸殘基發(fā)生構(gòu)象變化。4．園二色法：測定α-螺旋和β-折疊片的含量。5．熒光、熒光偏振法等

（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)1定義：蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈（一級結(jié)構(gòu)）本身的折疊和盤繞的方式。類型：天然蛋白質(zhì)一般均含有α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)。

（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵1（1）氫鍵：一個(gè)氫原子連接兩個(gè)電負(fù)性強(qiáng)的原子（如氧、氮等）。其中一個(gè)為共價(jià)鍵，另一個(gè)即為氫鍵。在α-螺旋和β-折疊中占有極重要的地位，對蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象的維護(hù)也很重要。（2）靜電引力：正負(fù)帶電基團(tuán)之間的吸引力，如NH4+與COO-。靜電引力較強(qiáng)，但對蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象的穩(wěn)定貢獻(xiàn)不是很大，有時(shí)也稱為離子鍵或鹽鍵。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵2（3）范德華力：是分子間的吸引力，是原子團(tuán)相互接近時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的。它變化多樣，對維持蛋白質(zhì)活性中心的構(gòu)象影響很大。（4）疏水相互作用：是非極性基團(tuán)為了避開水相而群集在一起的作用力。疏水作用是維持蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的重要因素。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵3（5）二硫鍵（二硫橋）：兩個(gè)硫原子之間形成的共價(jià)鍵。此鍵作用很強(qiáng)，可把不同肽鏈或同一條肽鏈的不同部分連在一起，對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象起重要作用。大多數(shù)蛋白質(zhì)分子由于二硫鍵的斷裂其生物學(xué)活性隨即喪失。維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵主要是次級鍵（氫鍵、離子鍵、疏水作用和范德華力）。這些次級鍵是非共價(jià)鍵。肽鍵、二硫鍵、酯鍵等被稱之為共價(jià)鍵。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型1（1）-螺旋最常見的二級結(jié)構(gòu)形式。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型1（1）-螺旋特點(diǎn)1①每隔3.6個(gè)氨基酸殘基，螺旋上升一圈。上升一圈相當(dāng)于向上平移0.54nm，即每個(gè)氨基酸殘基上升0.15nm，每個(gè)殘基沿軸旋轉(zhuǎn)1000。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型1（1）-螺旋特點(diǎn)2②氨基酸殘基側(cè)鏈伸向外側(cè)，相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵。氫鍵是由每個(gè)氨基酸殘基的N-H與前面隔三個(gè)氨基酸殘基的C=0形成的。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型1（1）-螺旋特點(diǎn)3③一般為右手螺旋。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型1（1）-螺旋特點(diǎn)4④鏈中如有脯氨酸，則螺旋被中斷，產(chǎn)生一個(gè)“結(jié)節(jié)”，這是因?yàn)楦彼岬膩啺被系臍鋮⑴c肽鍵形成后沒有多余的氫原子形成氫鍵，這樣肽鏈拐彎不再形成α-螺旋。脯氨酸（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型1（1）-螺旋特點(diǎn)5⑤另外，甘氨酸由于沒有側(cè)鏈的約束，難以形成α-螺旋所需的二面角。其次，如肽鏈中連續(xù)存在帶相同電荷的氨基酸，由于同性電荷相斥也會影響α-螺旋不穩(wěn)定。甘氨酸（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型1（1）-螺旋（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型2（2）β-折疊結(jié)構(gòu)

當(dāng)將α-角蛋白（α-螺旋）用熱水和稀堿等方法處理或用力拉直，α-角蛋白就變成

β-角蛋白，此時(shí)α-螺旋被伸展，氫鍵被破壞，而形成β-折疊。

（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型2（2）β-折疊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型2（2）β-折疊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)2在-折疊中，-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團(tuán)處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個(gè)氨基酸之間的軸心距為0.35nm。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型2（2）β-折疊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)3

-折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型2（2）β-折疊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)4

平行式反平行式所有肽鏈的N-端都在同一邊相鄰兩條肽鏈的方向相反（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型2（2）β-折疊結(jié)構(gòu)

側(cè)面觀（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型3（3）β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)1這類結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中。-轉(zhuǎn)角部分，由四個(gè)氨基酸殘基組成彎曲處的第一個(gè)氨基酸殘基的-C=O和第四個(gè)殘基的–N-H之間形成氫鍵，形成一個(gè)不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型3（3）β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)2

β-轉(zhuǎn)角（二）蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)2二級結(jié)構(gòu)的類型3

α螺旋β折疊片β轉(zhuǎn)角自由回轉(zhuǎn)（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)1

定義：蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(TertiaryStructure)是蛋白質(zhì)在各種二級結(jié)構(gòu)單元的基礎(chǔ)上，還能進(jìn)一步盤曲而成特定格式的三級結(jié)構(gòu)。維系力：主要有氫鍵、疏水鍵、離子鍵和范德華力等。尤其是疏水鍵，在蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中起著重要作用。（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)2三級結(jié)構(gòu)的維系因素決定多肽鏈盤曲方式（高級結(jié)構(gòu)）的因素，首先是氨基酸殘基的序列（一級結(jié)構(gòu)）。鹽鍵:殘基上氨基酸有的帶正電（賴、精），與帶負(fù)電的氨基酸（谷、天冬）的相互吸引。范德華力：因基團(tuán)之間的緊密靠近而產(chǎn)生。氫鍵：側(cè)鏈之間可形成氫鍵。二硫鍵:可把兩條肽段連起來，是維持蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)的重要因素。多肽鏈經(jīng)過如此盤曲后，在分子表面形成了某些發(fā)揮生物學(xué)功能的特定區(qū)域（微環(huán)境），如酶的活性中心等。（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)3維持三級結(jié)構(gòu)的作用力1（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)3維持三級結(jié)構(gòu)的作用力2無三級結(jié)構(gòu)形成三級結(jié)構(gòu)（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)3維持三級結(jié)構(gòu)的作用力3

肽鍵

二硫鍵離子鍵

氫鍵疏水鍵

范德華力

90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol這四種鍵能遠(yuǎn)小于共價(jià)鍵，稱次級鍵。次級鍵微弱但卻是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中主要的作用力,原因是因?yàn)槠鋽?shù)量巨大。（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)4

（三）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)5

肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)（四）蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)1

很多蛋白質(zhì)分子是由兩個(gè)或兩個(gè)以上獨(dú)立的、具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈組成的。這些多肽鏈之間并沒有共價(jià)鍵的聯(lián)系，只是借次級鍵締合在一起，這就形成了四級結(jié)構(gòu)。一般分子量超過幾十～一百萬的蛋白質(zhì)均有四級結(jié)構(gòu)。在四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子中，每個(gè)具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈單位稱為亞基，亞基多無生物學(xué)活性，具有完整四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子才有生物活性。（四）蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)2

（四）蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)3

血紅蛋白中四亞基兩兩相同，分別稱為α1、α2、β1、β2血紅細(xì)胞（四）蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)4血紅蛋白中的二聚體之一α2與β2第三節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的分子量二、兩性游離和等電點(diǎn)三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)五、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)一、蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的分子量一般在1萬—100萬道爾頓由于是生物大分子，因此在溶液中極不穩(wěn)定，不能用測定小分子物質(zhì)的方法（如冰點(diǎn)降低、沸點(diǎn)升高）來測定一般以滲透壓法、凝膠過濾、聚丙烯酰胺凝膠電泳及超離心法來測定其分子量。超離心法較準(zhǔn)確，但實(shí)驗(yàn)條件要求很高二、兩性游離和等電點(diǎn)1+OH－+H++OH－+H+COOHPrH3N+COO－PrH3N+COO－PrH2NpH＜

pI4＜7pH=pI7=7pH＞

pI9＞7由于蛋白質(zhì)是由氨基酸組成，氨基酸所具有的兩性游離性質(zhì)，蛋白質(zhì)也同樣具有二、兩性游離和等電點(diǎn)2肽與氨基酸都有α－COOH，α－NH2，但肽還含有側(cè)鏈R基上的可解離基團(tuán)，且其為主要解離基團(tuán)。肽鏈中的α－COOH與α－NH2相距較遠(yuǎn)，因此它們之間的靜電引力較弱，可離子化程度較低。大的肽比小肽的離子化程度低，即大肽完全質(zhì)子化所需pH比小肽低。N端α－NH2的pK，值比游離氨基酸的小，C－端的α－COOH的pK，值比游離氨基酸的大，側(cè)鏈R基的pK，值在兩者之間。蛋白質(zhì)兩性游離的特點(diǎn)二、兩性游離和等電點(diǎn)3在同一pH溶液中，由于各種蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量以及分子大小不同，因此它們在電場中的移動速度也有差別，可以利用這種性質(zhì)來分離和分析蛋白質(zhì)，稱為蛋白質(zhì)電泳分析法。常用的有紙上電泳、醋酸纖維膜電泳、聚丙烯纖維的凝膠電泳蛋白質(zhì)兩性游離的應(yīng)用1二、兩性游離和等電點(diǎn)3蛋白質(zhì)兩性游離的應(yīng)用2電泳三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)1由于蛋白質(zhì)分子大，且球狀蛋白質(zhì)分子中親水的氨基酸殘基多位于顆粒表面，故在水溶液中能與水起水合作用。因此，蛋白質(zhì)的水溶液具有親水膠體的性質(zhì)為什么蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)2蛋白質(zhì)所形成的親水膠體顆粒具有二個(gè)穩(wěn)定因素，即顆粒表面的水化層和電荷。若無外力條件作用，不致互相凝集。如除掉這兩個(gè)穩(wěn)定因素，蛋白質(zhì)便容易凝集析出。因此，可用此原理提取蛋白質(zhì)，如常用中性鹽硫酸胺來競爭水而使水化膜破裂，產(chǎn)生沉淀。蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的原因三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)3蛋白質(zhì)具有許多高分子溶液的性質(zhì)。如擴(kuò)散、粘度大、不能透過半透膜。利用不能透過半透膜的性質(zhì)可以將蛋白質(zhì)和其他一些小分子分開，常用方法有滲析和超濾。三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)4滲析血液透析小分子溶出小分子被帶出透析機(jī)透析液血液加壓三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)4超濾四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)1(概述)定義:使蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象。原理:蛋白質(zhì)穩(wěn)定因素有水化層和帶電層,水化層是蛋白質(zhì)分子表面的許多親水基團(tuán)與水分子結(jié)合形成的一層水膜，它使蛋白質(zhì)顆粒不能相互接觸聚集成大顆粒；帶電層是蛋白質(zhì)分子表面的可解離基團(tuán)在一定pH環(huán)境下解離產(chǎn)生的。由于帶同性電荷的蛋白質(zhì)顆粒相互排斥，也使蛋白質(zhì)顆粒不能聚集，當(dāng)改變這些穩(wěn)定因素，蛋白質(zhì)分子相聚集而從溶液中析出。

特點(diǎn):一般沉淀出的蛋白質(zhì)是變性的。如果控制實(shí)驗(yàn)條件（如低溫、溫和沉淀劑），便可得到不變性的蛋白質(zhì)。四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2(方式1)定義:加入大量中性鹽(硫酸胺)以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)而使蛋白質(zhì)從水溶液沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(溶解度最小，易沉淀)則效果最好。各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣。因此，調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)的溶液中的中性鹽的濃度，可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。1．鹽析1四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2(方式1)1．鹽析2蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多水分子，鹽濃度高時(shí)，它們被鹽抽出，暴露出的疏水區(qū)域相互結(jié)合，沉淀四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2(方式2)pH稍大于等電點(diǎn)為宜，因?yàn)榇藭r(shí)蛋白質(zhì)帶負(fù)電，易與金屬離子結(jié)合成鹽。通常這種沉淀為變性的，如控制溫度（低溫）并控制重金屬離子濃度，則可用于分離制備不變性的蛋白質(zhì)。

2．重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2(方式3)某些生物堿試劑（如苦味酸、鎢酸、鞣酸、碘化鉀等）及某些酸（三氯乙酸、水楊磺酸、硝酸等）與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性的鹽沉淀。沉淀?xiàng)l件應(yīng)當(dāng)是pH小于等于電點(diǎn)，這樣蛋白質(zhì)帶正電，易與酸根負(fù)離子結(jié)合成鹽。3．生物堿試劑與某些酸類沉淀蛋白質(zhì)四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2(方式4)可與水混合的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等能破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)而使蛋白質(zhì)沉淀。如酒精的消毒作用。在低溫條件下，變性進(jìn)行較緩慢，可以用來制備蛋白質(zhì)。其優(yōu)點(diǎn)在于：不像鹽析那樣存在有大量鹽類，必須經(jīng)透析除去，而且有機(jī)溶劑很易通過稀釋透析及蒸發(fā)等方法除去。4．有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)四、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)2(方式5)將接近于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)溶液加熱可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固而沉下。雞蛋煮熟后，本來流動的蛋清、蛋黃都變成固體樣的東西了。這是蛋白質(zhì)凝固作用應(yīng)用于食品加工的典型例子。5．加熱凝固五、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性（變性1）定義:以某些物理或化學(xué)因素的作用，使蛋白質(zhì)嚴(yán)格的空間構(gòu)象破壞（不包括肽鍵的斷裂），而引起蛋白質(zhì)若干理化和生物學(xué)性質(zhì)的改變。影響蛋白質(zhì)變性的因素:紫外線照射、加熱煮沸、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽和有機(jī)溶劑處理等。原理:維持蛋白質(zhì)二級、三級和四級結(jié)構(gòu)的嚴(yán)格構(gòu)象的力只是一些弱的次級鍵，它們很容易被破壞。特點(diǎn):天然構(gòu)象被破壞，蛋白質(zhì)失去了生物學(xué)活性。五、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性（變性2）五、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性（變性3）五、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性（復(fù)性）復(fù)性:某些變性蛋白質(zhì)，再除去變性因素后，可以重新獲得其天然結(jié)構(gòu)和生物活性，稱為蛋白質(zhì)的“復(fù)性”。如有一些球蛋白被熱或極端pH變性后，若緩慢冷卻或緩慢恢復(fù)到正常pH時(shí)，將重新獲得其天然結(jié)構(gòu)和生物活性。這種復(fù)性現(xiàn)象，即蛋白質(zhì)折疊研究中的所謂“折疊”。六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)11.雙縮脲反應(yīng)1原理:蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應(yīng)，形成紅紫色混合物。應(yīng)用:可以用此反應(yīng)來定性測定蛋白質(zhì)；也可在540nm處比色，定量測定蛋白質(zhì)。六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)12H2N－C－NH2H2N－C－N－C－NH2＋NH3↑1320COOHO尿素雙縮脲雙縮脲CuSO4+NaOH紫紅色物質(zhì)1.雙縮脲反應(yīng)2六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)22.酚試劑（福林試劑）反應(yīng)原理:蛋白質(zhì)分子一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能將福林試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍(lán)色化合物（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）應(yīng)用:常用此反應(yīng)來定量測定蛋白質(zhì)含量。最近普遍使用的Brodford法,（考馬思亮蘭G-250法）將會在以后的實(shí)驗(yàn)接觸。六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)3含有芳香族氨基酸，特別是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白質(zhì)所特有的呈色反應(yīng)。蛋白質(zhì)溶液遇硝酸后先產(chǎn)生白色沉淀，加鹽則白色沉淀變成黃色，再加堿呈橙黃色。因?yàn)橄跛釋⒌鞍踪|(zhì)分子中的苯環(huán)硝化，產(chǎn)生了黃色硝基苯衍生物3．蛋白質(zhì)的黃色反應(yīng)1六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)33．蛋白質(zhì)的黃色反應(yīng)2硝基酚（黃色）鄰硝醌酸鈉（橙黃色）六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)44．米倫化反應(yīng)米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合液。當(dāng)?shù)鞍兹芤褐屑尤朊讉愒噭┖蠹串a(chǎn)生白色沉淀，加熱后沉淀變成紅色。由于酚類化合物有此反應(yīng)，酪氨酸含有酚基，故有此反應(yīng)。六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)5．乙醛酸反應(yīng)1在蛋白質(zhì)溶液中加入乙醛酸，并沿試管壁慢慢注入濃硫酸，在兩液層之間就會出現(xiàn)紫色環(huán)。凡含有吲哚基的化合物都有此反應(yīng)，由于色氨酸含有類似結(jié)構(gòu)，因此含有色氨酸或含色氨酸的蛋白質(zhì)都有此反應(yīng)。六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)5．乙醛酸反應(yīng)2六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)66．坂口反應(yīng)1原理:精氨酸分子中的胍基，能與次氯酸鈉、或次溴酸鈉及α－萘酚在氫氧化鈉溶液中產(chǎn)生紅色產(chǎn)物。應(yīng)用:此反應(yīng)可以用來鑒定含有精氨酸的蛋白質(zhì)，也可用來測定精氨酸的含量。六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)66．坂口反應(yīng)2紅色六、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)66．坂口反應(yīng)3第四節(jié)氨基酸及蛋白質(zhì)分離提純1無論是對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究，或是生產(chǎn)人們所需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，都涉及蛋白質(zhì)的分離純化。目前對蛋白質(zhì)的制備，主要是從生物組織中提取分離。一般的程序?yàn)椋呵疤幚恚航M織、細(xì)胞破碎等。粗分級：鹽析、沉淀等。細(xì)分級：層析、電泳等。第四節(jié)氨基酸及蛋白質(zhì)分離提純2一、氨基酸的分析分離

二、蛋白質(zhì)混合物的分離方法

三、蛋白質(zhì)的鑒定

一、氨基酸的分析分離1類型：分配層析法(包括柱層析、紙層析和薄層層析)基本原理：所有的層析系統(tǒng)通常都由兩個(gè)相組成，一個(gè)為固定相的或靜相；一個(gè)為流動相或動相。一、氨基酸的分析分離2分配系數(shù)Kd：混合物在層析系統(tǒng)中的分離，決定于該混合物的組分在兩相中的分配情況，即分配系數(shù)：

Kd=CA/CBCA，CB分別代表某一物質(zhì)在互不相溶的兩相A，B中的濃度。一、氨基酸的分析分離2分配系數(shù)Keff：某一物質(zhì)在層析系統(tǒng)中的行為并不直接決定于它們的分配系數(shù)Kd,而是取決于有效分配系數(shù)Keff。Keff＝某物質(zhì)在A相中的總量/某物質(zhì)在B相中的總量對于液相-液相層析系統(tǒng)來說,Keff＝(CA×VA)/(CB×VB)＝Kd×RV這里的VA,VB分別為A相和B相的體積，RV為A，B兩相的體積比。由此可見，Keff是RV的函數(shù)，溶質(zhì)的有效分配系數(shù)可以調(diào)整兩相的體積比而加以改變。一、氨基酸的分析分離3

利用層析法分離混合物（例如氨基酸混合物），其先決條件是各種氨基酸成分的分配系數(shù)要有差異，哪怕是很小的差異，一般差異越大，越容易分開。

一、氨基酸的分析分離41．分配柱層析2．濾紙層析3．薄層分析4．離子交換層析5．氣相色譜6．高效液相色譜（HPLC）1．分配柱層析1柱層析中的填充物或稱支持劑，都是一些具有親水性的不溶物質(zhì)，如纖維素、淀粉、硅膠等。以它們作為固定相（靜相）。用各種緩沖液（流動相）來溶出。在柱上端加上氨基酸混合物樣品，那么此樣品就會在兩相之間發(fā)生連續(xù)分配,混合物中具有不同分配系數(shù)的各種成分沿柱以不同的速度向下移動。分步收集柱下端的洗出液，用茚三酮顯色定量。以氨基酸對洗出液體積作圖，得洗脫曲線，曲線中的每個(gè)峰相當(dāng)于某一種氨基酸。1．分配柱層析2洗脫劑樣品填充物玻璃柱分步收集設(shè)想的板層S=固定相M=流動相1．分配柱層析3ABCDE321616816841241228812212345階段1．分配柱層析4分溶曲線與轉(zhuǎn)移次數(shù)（理論板數(shù)）n的依賴關(guān)系00.250.50.751.0相對濃度n=6n=100n=10002．濾紙層析1濾紙上，水被吸附在纖維素的纖維之間，形成固定相，展層用的溶劑是流動相。層析時(shí)，混合氨基酸在這兩相中不斷分配，使它們分布在濾紙的不同位置，然后用茚三酮顯色。此層析可以進(jìn)行二向?qū)游?。第一向?qū)游鐾瓿珊螅娓蔀V紙?jiān)儆昧硪蝗軇游觯ㄅc第一向?qū)游鱿啻怪保?。這種方法不僅可用于氨基酸分析，還可用于糖的分析和核苷酸的分析，是一個(gè)非常有用的方法。2．濾紙層析2AA1AA2AA3AA4abc標(biāo)準(zhǔn)樣品原點(diǎn)原點(diǎn)（2）酚－甲酸－水（1）丁醇－醋酸氨基酸單向紙層析圖譜氨基酸雙向紙層析圖譜DADS2．濾紙層析3氨基酸在紙上移動的速度稱比移值或遷移率，以符號Rf代表。也就是原點(diǎn)到溶劑前沿的距離（Ds）同原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)（即原色點(diǎn)）中心的距離(DA)的比值Rf＝DA/DS同一氨基酸對一定溶劑系統(tǒng)的Rf值是常數(shù)，因而可用來鑒別氨基酸。3．薄層分析這是近十幾年發(fā)展起來的一種微量而快速的層析法。不僅適于氨基酸的分離鑒定，而且可用于許多其他的天然物質(zhì)的定性、定量測定以及小量樣品的分離提純。大體步驟：把支持劑（硅膠粉、纖維素粉）涂布于玻璃板上，使之成一個(gè)薄層；把要分析的樣品，滴加在薄層的一端，然后用合適的溶劑進(jìn)行展層，使樣品中各個(gè)成分分離；最后進(jìn)行鑒定和定量測定。

4．離子交換層析1就是用離子交換樹脂作支持劑的一種層析法。離子交換樹脂是具有酸性或堿性基團(tuán)的人工合成聚苯乙烯酸等不溶性高分子化合物。4．離子交換層析2陽離子交換樹脂含有的酸性基團(tuán)如－S03H(強(qiáng)酸型)或－COOH（弱酸型）可解離出H+，當(dāng)溶液中含有其他陽離子時(shí)，例如在酸性環(huán)境中的氨基酸陽離子，它們可以和H+發(fā)生交換而“結(jié)合”在樹脂；相反，陰離子交換樹脂，可解離出OH－，能和溶液里的陰離子（如堿性環(huán)境中的帶負(fù)電的氨基酸）發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。為了使氨基酸從樹脂柱上洗脫下來，需要降低氨基酸與樹脂間的親和力（靜電吸引及氨基酸側(cè)鏈與樹脂基質(zhì)聚苯乙烯之間的疏水相互作用）。有效的方法是逐步提高洗脫劑的pH和鹽濃度（離子強(qiáng)度），這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來。4．離子交換層析3RCHCOOHNH3++M1A+RCHCOOHNH3M1+A+

氨基酸（在酸性溶液中）陽離子交換劑

氨基酸鹽RCHCOO－NH2+M2B－RCHCOOM2NH2+B－

氨基酸（在堿性溶液中）陰離子交換劑

氨基酸鹽M1為酸性基團(tuán)，M2為堿性基團(tuán)5．氣相色譜定義：層析系統(tǒng)的流動相為氣體，固定相為涂漬在固體顆粒表面的液體，因此也叫氣－液色譜。優(yōu)點(diǎn)：氣相色譜法具有微量快速的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)：但在分析生物成分方面存在一個(gè)限制，它要求樣品能氣化，且對熱的穩(wěn)定性高。而氨基酸由于含有各種極性基團(tuán)，氣化十分困難，必須把它轉(zhuǎn)變成容易揮發(fā)的化合物才能進(jìn)行氣相層析。6．高效液相色譜（HPLC）這是近十幾年內(nèi)發(fā)展起來的一項(xiàng)快速、靈敏、高效的分析分離技術(shù)。其特點(diǎn)是使用的固定相支持劑顆粒很細(xì)，因而表面積很大。溶劑系統(tǒng)采取高壓，因此洗脫速度增大。許多層析如離子交換層析、吸附層析及凝膠過濾層析等多種類型的柱層析都可用HPLC來代替。

二、蛋白質(zhì)混合物的分離方法1．根據(jù)分子大小不同的分離方法2．根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法3．根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性的分離方法4．根據(jù)配體特異性的分離方法—親和層析法

1．根據(jù)分子大小不同的分離方法（1）透析和超濾（2）密度梯度（區(qū)帶）離心（3）凝膠過濾（分子篩層析）（1）透析和超濾1

利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽、單糖、水等分開。常用的半透膜是玻璃紙、火棉紙和其他合成材料。（1）透析和超濾2小分子溶出小分子被帶出透析（1）透析和超濾3

超濾（2）密度梯度（區(qū)帶）離心1蛋白質(zhì)顆粒和沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度，常用的密度梯度為蔗糖梯度。蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)梯度時(shí)，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成各自獨(dú)立的區(qū)帶。（2）密度梯度（區(qū)帶）離心2蔗糖濃度％4％8％12％16％20％塑料離心管滴加樣品（3）凝膠過濾（分子篩層析）1這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。凝膠珠是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，凝膠的交聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大?。Q定了凝膠的分級范圍，即能被該凝膠分離開來的蛋白質(zhì)混合物的分子量范圍。（3）凝膠過濾（分子篩層析）2主要原理：當(dāng)不同分子大小的蛋白質(zhì)混合物流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而被排阻在凝膠珠外，隨著溶液在凝膠珠之間的孔隙向下移動，并最先流出柱外；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度地自由出入凝膠珠的內(nèi)外，這樣由于不同大小的分子所經(jīng)的路徑不同而得到分離。大分子物質(zhì)先被洗脫出來，小分子物質(zhì)后被洗脫出來。常用的凝膠:葡聚糖凝膠（sephadex）、瓊脂糖凝膠(sepharose)聚丙烯酰胺凝膠（Biogel）（3）凝膠過濾（分子篩層析）3蛋白質(zhì)混合樣2．據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法（1）蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析（2）等電點(diǎn)沉淀法（3）低溫有機(jī)溶劑沉淀法蛋白質(zhì)溶解度的主要影響因素：1，溶液的pH；2，離子強(qiáng)度；3，介電常數(shù)；4，溫度（1）蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析1(鹽溶1)鹽溶：中性鹽對球狀蛋白質(zhì)的溶解度有顯著的影響。低濃度時(shí)，中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。機(jī)理：主要是蛋白質(zhì)吸附某種鹽類離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而且蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用加強(qiáng)，因而溶解度提高。在透析過程中，球蛋白分子沉淀析出，是因?yàn)槌チ他}離子，使蛋白質(zhì)之間相互吸引，引起蛋白質(zhì)聚集。（1）蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析1(鹽溶2)等電點(diǎn)時(shí)，疏水基團(tuán)相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種疏水作用力，使分子分散，溶于水中（1）蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析2(鹽析1)鹽析：一般鹽濃度增大時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度趨于減低，當(dāng)鹽濃度足夠大時(shí)，蛋白質(zhì)可從溶液中完全沉淀出來，稱為鹽析。以硫酸銨（中性鹽）最常應(yīng)用。因其溶解度大，且不易傷害蛋白質(zhì)。另外常用的鹽還有硫酸鈉、硫酸鎂及氯化鈉等。（1）蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析2(鹽析2)蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多水分子，鹽濃度高時(shí)，它們被鹽抽出，暴露出的疏水區(qū)域相互結(jié)合、沉淀。（2）等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)在等電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最?。?）等電點(diǎn)沉淀法溶解度mgN/mlpH4.85.05.25.45.612305mM1mM10mM20mMpH和鹽濃度對β－乳球蛋白溶解度的曲線

曲線上的數(shù)值為NaCl的濃度（3）低溫有機(jī)溶劑沉淀法加入與水可混