高效液相色譜外標法

高效液相色譜外標法3月26日藥典四部60頁1111高效液相色譜法:系采納高壓輸液泵將規(guī)定的滾動相泵入裝有填充劑的色譜柱,對供試品進行分開測定的色譜方法。

注入的供試品,由滾動相帶入色譜柱內(nèi),各組分在柱內(nèi)被分開,并進入檢測器檢測,由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。

、進樣器、色譜柱、檢測器、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。

~,填充劑粒徑為3~10μ。

超高液相色譜儀:是適應小粒徑約2μ填充劑的耐超高壓、小進樣量、低死體積、高靈敏度檢測的高效液相色譜儀。

1色譜柱反相色譜柱:以鍵和非極性基團的載體為填充劑填充而成的色譜柱。

常見的載體有硅膠、聚合物復合硅膠和聚合物等;常用的填充劑優(yōu)十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基鍵合硅膠等。

正相色譜柱:本文格式為版,下載可任意編輯—3—用硅膠填充劑,或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱。

常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和***基鍵合硅膠等。

氨基鍵合硅膠和***基鍵合硅膠也可用作反向色譜。

離子交換色譜柱:用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。

有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。

手性分開色譜柱:用手性填充劑填充而成的色譜柱。

色譜柱的內(nèi)徑和長度,填充劑的形狀、粒徑與粒徑分布、孔徑、外觀積、鍵合基團的外觀覆蓋度、載體外觀基團殘留量,填充的致密與平勻程度等均影響色譜柱的性能,應依據(jù)被分開物質(zhì)的性質(zhì)來選擇適合的色譜柱。

溫度會影響分開效果,品種正文中未指明色譜柱溫度時系指室溫,應留神室溫變化的影響。

為改善分開效果可適當提高色譜柱的溫度,但一般不宜超過60℃。

剩余硅羥基未封閉的硅膠色譜柱,滾動相的值一般應在2~8之間。

剩余硅羥基已封閉的硅膠、聚合物復合硅膠或聚合物色譜柱可耐受更廣泛值的滾動相,適合于值小于2或大于8的滾動相。

2檢測器最常用的檢測器為紫外-可見分光檢測器,包括二極管陣列檢測器,其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質(zhì)譜檢測器等。

紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器為選擇性檢測器,其響應值不僅與被測物質(zhì)的量有關,還與其布局有關;本文格式為版,下載可任意編輯—3—蒸發(fā)光散射檢測器和示差折光檢測器為通用型檢測器,對全體物質(zhì)均有響應,布局似乎的物質(zhì)在蒸發(fā)光散射檢測器的響應值幾乎僅與被測物質(zhì)的量有關。

紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器和示差折光檢測器的響應值與被測物質(zhì)的量在肯定范圍內(nèi)呈線性關系,但蒸發(fā)光散射檢測器的響應值與被測物質(zhì)的量通常呈指數(shù)關系,一般需經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換。

不同的檢測器,對滾動相的要求不同。

紫外-可見分光檢測器所用滾動相應符合紫外-可見分光光度法通那么0401項下對溶劑的要求;采納低波長檢測時,還應考慮有機溶劑的截止使用波長,并選用色譜級有機溶劑。

蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器不得使用含不揮發(fā)性鹽的滾動相。

3滾動相反相色譜系統(tǒng)的滾動相常用甲醇-水系統(tǒng)和乙***-水系統(tǒng),用紫外末端波長檢測時,宜選用乙***-水系統(tǒng),滾動相中應盡可能不用緩沖鹽,如需用時,應盡可能使用低濃度緩沖鹽。

本文格式為版,下載可任意編輯—4—用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時,滾動相中有機溶劑一般不低于5%,否那么導致柱效下降、色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。

正相色譜系統(tǒng)的滾動相:常用兩種或兩種以上的有機溶劑,如二***甲烷和正己烷等。

品種正文項下規(guī)定的條件除填充劑種類、滾動相組分、檢測器類型不得變更外,其余如色譜柱內(nèi)徑與長度、填充劑粒徑、滾動相流速、滾動相組分比例、柱溫、進樣量、檢測器靈敏度等,均可適當變更,以達成系統(tǒng)適應性試驗的要求。

調(diào)整滾動相組分比例時,當小比例組分的百分比例小于等于33%時,~;當大于33%時,允許變更范圍為-10%~+10%。

若需使用小粒徑約2μ填充劑,輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等務必與之匹配;如有必要,色譜條件也應作適當?shù)恼{(diào)整。

當對其測定結果產(chǎn)生爭議時,應以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結果為準。

當務必使用特定牌號的色譜柱方能得志分開要求時,可在該品種正文項下注明。

:通常包括理論板數(shù)、分開度、靈敏度、拖尾因子和重復性等五個參數(shù)。

色譜系統(tǒng)的適用性試驗定義:本文格式為版,下載可任意編輯—6—按各品種正文項下要求對色譜系統(tǒng)進行適用性試驗即用規(guī)定的對比品溶液或系統(tǒng)適用性試驗溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進行試驗,必要時,可對色譜系統(tǒng)進行適當調(diào)整,以符合要求。

1色譜柱的理論板數(shù)用于評價色譜柱的分開效能。

由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同,采納理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標時,應指明測定物質(zhì),一般為待測物質(zhì)或內(nèi)標物質(zhì)的理論板數(shù)。

在規(guī)定的色譜條件下,注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標物質(zhì)溶液,記錄色譜圖,量出供試品主成分色譜峰或內(nèi)標物質(zhì)色譜峰的留存時間和峰寬或半顛峰寬2,按下式計算色譜柱的理論板數(shù):=162或=22、、2可用時間或長度計下同,但應取全都單位。

2分開度用于評價待測物質(zhì)與被分開物質(zhì)之間的分開程度,是衡量色譜系統(tǒng)分開效能的關鍵指標。

可以通過測定待測物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分開度,對色譜系統(tǒng)分開效能進行評價與與調(diào)整。

也可以通過測定待測物質(zhì)與某一降解產(chǎn)物的分開度,無論是定性鑒別還是定量測定,均要求待測物質(zhì)色譜峰與內(nèi)標物質(zhì)色譜峰或特定的雜質(zhì)對比色譜峰及其他色譜峰之間有較好的分開度。

本文格式為版,下載可任意編輯—6—除另有規(guī)定外,。

分開度的計算公式為:式中2為相鄰兩色譜峰中后一峰的留存時間1為相鄰兩色譜峰中前一峰的留存時間1、2及1,2、2,2分別為此相鄰兩色譜峰的峰寬及半顛峰寬如圖。

當對測定結果有異議時,色譜柱的理論板數(shù)和分開度均以峰寬的計算結果為準。

3靈敏度用于評價色譜系統(tǒng)檢測微量物質(zhì)的才能,通常以信噪比來表示。

通過測定一系列不同濃度的供試品或?qū)Ρ绕啡芤簛頊y定信噪比。

定量測定時,信噪比應不小于10;定性測定時,信噪比應不小于3。

系統(tǒng)適用性試驗中可以設置靈敏度測驗溶液來評價色譜系統(tǒng)的檢測才能。

4拖尾因子用于評價色譜峰的對稱性。

拖尾因子計算公式為:%峰高處的峰寬;本文格式為版,下載可任意編輯—7—1為峰頂在5%峰高處橫坐標平行線的投影點至峰前沿與此平行線交點的距離如圖。

以峰高作定量參數(shù)時,除另有規(guī)定外,~。

以峰面積作定量參數(shù)時,一般的峰拖尾或前伸不會影響峰面積積分,但嚴峻拖尾會影響基線和色譜峰起止的推斷和峰面積積分的切實性,此時應在各品種正文項下對拖尾因子作出規(guī)定。

5重復性用于評價色譜系統(tǒng)連續(xù)進樣時響應值的重復性能。

采納外標法時,通常取各品種項下的對比品溶液,連續(xù)進樣5次,除另有規(guī)定外,%;采納內(nèi)標法時,通常配制相當于80%、100%和120%的對比品溶液,參加規(guī)定量的內(nèi)標溶液,配成3種不同濃度的溶液,分別至少進樣2次,計算平均校正因子,%。

1內(nèi)標法按各品種正文項下的規(guī)定,細致稱量取對比品和內(nèi)標物質(zhì),分別配成溶液,各細致量取適量,混合配成校正因子測定用的對比溶液。

取確定量進樣,記錄色譜圖。

本文格式為版,下載可任意編輯—9—測量對比品和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高,按下式計算校正因子:式中為內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高;為對比品的峰面積或峰高;為內(nèi)標物質(zhì)的濃度;為對比品的濃度。

再取各品種項下含有內(nèi)標物質(zhì)的供試品溶液,進樣,記錄色譜圖,測量供試品中待測成分和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高,按下式計算含量:式中為供試品的峰面積或峰高;為供試品的濃度;為內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高;為內(nèi)標物質(zhì)的濃度;為內(nèi)標法校正因子。

采納內(nèi)標法,可制止因供試品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響。

本文格式為版,下載可任意編輯—9—2外標法按各品種項下的規(guī)定,細致稱量取對比品和供試品,配制成溶液,分別細致取確定量,進樣,記錄色譜圖,測量對比品溶液和供試品溶液中待測物質(zhì)的峰面積或峰高,按下式計算含量:式中各符號意義同上。

由于微量注射