厭氧菌的藥敏方法介紹課件

厭氧菌的藥敏方法介紹（瓊脂稀釋法）熊德鑫北京100037厭氧菌的藥敏方法介紹（瓊脂稀釋法）熊德鑫1一、受試菌的準(zhǔn)備二、抗生素的稀釋和準(zhǔn)備三、培養(yǎng)基的準(zhǔn)備四、抗生素的MIC試驗(yàn)五、結(jié)果觀察厭氧菌的藥敏方法介紹一、受試菌的準(zhǔn)備二、抗生素的稀釋和準(zhǔn)備三、培養(yǎng)基的準(zhǔn)備四、抗2一、受試菌的準(zhǔn)備1.將受試菌純菌接種在厭氧菌血平皿上（一般使用GAM、BHI等），厭氧培養(yǎng)48h（厭氧手套箱中）,厭氧罐中72h。2.取一定量(3-5個(gè)菌落)混懸在不抑制厭氧菌生長的透明肉湯中如硫乙醇酸納肉湯或布氏菌肉湯等。一、受試菌的準(zhǔn)備1.將受試菌純菌接種在厭氧菌血平皿上（一般使33.調(diào)節(jié)濃度到0.5號(hào)McFaland管中(相當(dāng)于1.5×108CFu/ml),若用試管稀釋法測(cè)MIC,則上述管應(yīng)10倍稀釋2次,終濃度為106CFu/ml即可使用,若為瓊脂稀釋法則不宜稀釋,因?yàn)辄c(diǎn)種菌一般為1-3l,其濃度仍為1.5×105CFu/ml左右。4.也可將菌的混懸液經(jīng)厭氧培養(yǎng)4-6h（生長緩慢菌應(yīng)培養(yǎng)12h），這時(shí)應(yīng)注意菌的濃度，如仍在0.5號(hào)MF管內(nèi)就不作處理,超過此濃度宜作稀釋后再使用。3.調(diào)節(jié)濃度到0.5號(hào)McFaland管中(相當(dāng)于1.5×45.每次藥敏試驗(yàn)受試菌中應(yīng)注意加入標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控.①B.fragilis脆弱類桿菌(ATCC25285或NCTC9343)②B.thetaiotaomicron多形類桿菌(ATCC29741)③C.perfringens產(chǎn)氣莢膜梭菌(AATCC13124)④E.lentum遲緩真桿菌(ATCC43055)6.瓊脂稀釋法中質(zhì)控菌株MIC值(g/ml)允許范圍（表1）5.每次藥敏試驗(yàn)受試菌中應(yīng)注意加入標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控.①B.f5表1質(zhì)控菌株MIC允許范圍(ug/ml青霉素u/ml) 抗生素*脆弱類桿菌*ATCC25285多形類桿菌*ATCC29741遲緩真桿菌*ATCC43055產(chǎn)氣莢膜梭菌**ATCC13124羧芐青霉素（carbinicillin）

16-64

16-64

8-16

0.25-1頭孢哌硐（cefoperazone）

32-64(128)32-128

32-128

0.125-0.5頭孢氨噻肟（cefotaxime）

8-3216-64

64-256

0.6363-0.25氯霉素(chlorampheninol)2-8

4-16

NO

2-8

氯林可霉素（clindamycin）0.5-0.2

2-8

0.06-0.25

0.031-0.125甲哨唑（metronidazole）

0.25-10.5-2

0.5-2

0.125-0.5青霉素G（penicilling）

16-64(8-32)

16-64(8-32)

NO

0.063-0.25阿莫西林/棒酸（Amoxicillin/Clavulanicacid)

0.25-1

0.5-2

NO

0.25-1表1質(zhì)控菌株MIC允許范圍(ug/ml青霉素u/ml) 6 抗生素脆弱類桿菌ATCC25285多形類桿菌ATCC29741遲緩真桿菌ATCC43055產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124氨芐青霉素(Aminopenicillins)

16-64

16-64NO

NO氨芐西林/青霉烷砜(Aminopenicillih/sulbactam)(2:1)

0.5-2.0

5-2.0

2-4

0.25-2吡哌西林（piperacillin）

2-8

8-328-32

2-16吡哌西林/他唑巴坦（piperacillin/Tazobactan）

0.12-4

1.25-41-4

1.25-2替卡西林（Ticarcillin）16-64

16-64

16-64

0.5-1.0替卡西林/棒酸(Ticarcillin/Clavulanicacid)

NO0.5-2

16-64

1-4頭孢美唑（cefmetazole）

16-64

8-32

8-32

2-16頭孢西叮（cefoxitin）

4-16

8-32

4-16

2-8續(xù)表1質(zhì)控菌株MIC充許范圍(μg/ml青霉素u/ml) 抗生素脆弱類桿菌多形類桿菌遲緩真桿菌產(chǎn)氣莢膜梭菌氨芐青霉7 抗生素脆弱類桿菌ATCC25285多形類桿菌ATCC29741遲緩真桿菌ATCC43055產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124頭孢替坦（cefotetan）

4-1632-128

32-128

2-4頭孢唑肟（ceftizoxime）NO

4-1616-64

1.0-2.5頭孢曲松（ceftriaxone）

32-128

64-256

NO2-4

頭孢孟多（cefamandole）

32-12832-128

NO

0.025-1亞胺培南(Imipenen)

0.003-0.120.06-0.25

0.25-1.0

0.25-0.5拉氧頭孢(latamoxef)

0.25-1

4-16

64-26560.5-8

美羅培南(melopenen)0.06-0.25

0.125-0.5

0.125-0.5

0.5-1.0續(xù)表1質(zhì)控菌株MIC充許范圍(μg/ml青霉素u/ml)*此表引自美國實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)對(duì)厭氧菌藥敏規(guī)定介紹1996.12**實(shí)用抗菌藥物學(xué)第二版戴自英等主編上?？茖W(xué)出版社，1997 抗生素脆弱類桿菌多形類桿菌遲緩真桿菌產(chǎn)氣莢膜梭菌頭孢替坦8二、抗生素的稀釋和準(zhǔn)備1.準(zhǔn)確稱取抗生素(我們一般稱取2.56g,加DW或其它液體4ml)，以對(duì)倍稀釋法稀釋成系列濃度2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5?？股亓康倪x擇可據(jù)上表敏感范圍作中點(diǎn)向上、向下各稀釋5個(gè)濃度。2.用于稀釋抗生素的常用液體的選擇列于表2(其它未標(biāo)明的抗生素均可用無菌水溶解)二、抗生素的稀釋和準(zhǔn)備1.準(zhǔn)確稱取抗生素(我們一般稱取2.59抗生素名稀釋液配制保存氯霉素用少量無水乙醇溶解后加PH6.0磷酸鹽緩沖液4℃長期保存紅霉素用少量無水乙醇溶解后加PH6.0磷酸鹽緩沖液-20℃3m,4℃2周林可霉素pH7.8磷酸鹽緩沖液儲(chǔ)存于-70℃冰箱中氯林可霉素pH7.8磷酸鹽緩沖液溶化后立即使用青霉素GpH6.0磷酸鹽緩沖液不再凍存四環(huán)素pH4.5磷酸鹽緩沖液同上甲哨唑無菌蒸餾水微熱或加0.1%吐溫-80同上利福平先用少量甲醇溶解再加pH7.8磷酸鹽緩沖液同上萬古霉素?zé)o菌蒸餾水同上阿莫西林、替卡西林、棒酸磷酸鹽緩沖液pH6.00.1mol/L同上氨芐青霉素、青霉烷磷酸鹽緩沖液pH8.00.1mol/L同上頭孢他坦無菌蒸餾水同上亞胺培南磷酸鹽緩沖液pH6.00.1mol/L同上拉氧頭孢2胺鹽先用0.04mol/LHCL,再加pH6.10.1mol/L磷酸鹽緩沖液靜置1.5-2h使R.S異聚體各半其它頭孢霉素磷酸鹽緩沖液pH6.00.1mol/L

表2稀釋抗生素常用液體抗生素名稀釋液配制保存氯霉素用少量無水乙醇溶解后加PH6.0103.一般宜選擇表1中1-2種抗生素作為質(zhì)控抗生素使用。4.抗生素稀釋前最好換算成標(biāo)準(zhǔn)濃度單位,按化學(xué)純品的活性度進(jìn)行,并要除去非抗生素成份.3.一般宜選擇表1中1-2種抗生素作為質(zhì)控抗生素使用。4.抗11三、培養(yǎng)基的準(zhǔn)備1.使用布氏瓊脂或GAM培養(yǎng)基

布氏瓊脂(胰酪胨10g、動(dòng)物組織蛋白酶消化物10g、酵母粉2g、葡萄糖1g、氯化納5g、亞硫酸納（NaHSO3)0.1g、0.5%氯化血紅素1ml、1%vitk10.1ml、DW1000ml.pH7.0-7.2121℃15min高壓滅菌。2.取上述稀釋各濃度抗生素2ml至平皿中,再加入約50℃上述培養(yǎng)基18ml,倒平板時(shí)宜搖勻,這樣抗生素濃度被稀釋10倍,分別為:256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.253.試驗(yàn)時(shí)必需加入2塊不加抗生素的平板,一塊厭氧培養(yǎng),一塊做需氧對(duì)照。三、培養(yǎng)基的準(zhǔn)備1.使用布氏瓊脂或GAM培養(yǎng)基2.取上述稀釋12四、抗生素的MIC試驗(yàn)1.取上述準(zhǔn)備好的受試菌液0.5ml，加入滅菌瓷板槽孔中,按順序并作標(biāo)記。2.用30-50點(diǎn)種針在上述各孔中沾取菌液,用手工或機(jī)械手點(diǎn)種到已準(zhǔn)備好的抗生素平板面上(每點(diǎn)1l-3l)3.被點(diǎn)種平板做好標(biāo)記并記錄好順序,同時(shí)點(diǎn)種兩塊不含抗生素平板，留一塊作需氧對(duì)照,其余全部進(jìn)入?yún)捬跏痔紫渲?一般37℃厭氧培養(yǎng)48h。四、抗生素的MIC試驗(yàn)1.取上述準(zhǔn)備好的受試菌液0.5ml，13五、結(jié)果觀察1.兩塊無抗生素平板，需氧平板無菌生長,而厭氧平板受試菌株全部生長。2.標(biāo)準(zhǔn)菌株及已知抗生素平板上生長在表1范圍內(nèi)說明本次試驗(yàn)符合要求。3.從抗生素高濃度平板向低濃度觀察生長情況,未生長濃度(一般連續(xù)3個(gè)濃度)為此受試菌株的MIC,現(xiàn)在一般以mg/L(或μg/ml)表示。五、結(jié)果觀察1.兩塊無抗生素平板，需氧平板無菌生長,而厭氧144.從上述未生長MIC處向上和向下各取一個(gè)濃度(包括未生長MIC點(diǎn))，用接種環(huán)在菌原接種點(diǎn)上涂抹后再接種至布氏或GAM血平板上,無菌生長點(diǎn)為MBC。5.同一種受試菌10株以上MIC值統(tǒng)計(jì)學(xué)處理求MIC50、MIC90。6.藥物敏感的判斷列于表3中。4.從上述未生長MIC處向上和向下各取一個(gè)濃度(包括未生長M15表3MIC法解釋標(biāo)準(zhǔn)（瓊脂稀釋法）抗生素MIC(μg/ml或mg/L)敏感中介耐藥阿莫西林/克拉維酸≤2～44～8≥8～16氨芐青霉素≤2(b)4(b)≥8(b)氨芐西林/青霉烷砜≤4～88～16≥16～32羧芐青霉素≤64128≥256青霉素G≤2(b)4(b)≥8(b)吡哌西林≤3264128吡哌西林/他唑巴坦≤4～324～64≥4～128替卡西林≤

3264≥128替卡西林/克拉維酸≤2～324～64≥2～128表3MIC法解釋標(biāo)準(zhǔn)（瓊脂稀釋法）抗生素MIC(μ16續(xù)表3MIC法解釋標(biāo)準(zhǔn)（瓊脂稀釋法）抗生素MIC(μg/ml或mg/L)敏感中介耐藥頭孢美唑≤

1632≥64頭孢西?！?632≥64頭孢哌酮≤1632≥64頭孢噻肟≤1632≥64頭孢替坦≤1632≥64頭孢唑肟≤32（c）64（c）≥128（c）頭孢曲松≤1632≥64頭孢孟多≤816≥32亞胺培南≤48≥16續(xù)表3MIC法解釋標(biāo)準(zhǔn)（瓊脂稀釋法）抗生素MIC(17續(xù)表3MIC法解釋標(biāo)準(zhǔn)（瓊脂稀釋法）抗生素MIC(μg/ml或mg/L)敏感中介耐藥抗氧頭孢≤16（d）32（d）≥64（d）氯霉素≤816≥32氯林可霉素≤24≥8四環(huán)素≤48≥16甲哨唑≤816≥32注:A.血液中藥物水平可以相當(dāng)高，所以，不產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶菌株感染，MIC值低時(shí)療效好。B.只適用于瓊脂稀釋法，若為肉湯稀釋法，判定值要低一級(jí)（≤16，32，≥64）。C.若每日藥量為4g時(shí)，判定值可低一級(jí)。續(xù)表3MIC法解釋標(biāo)準(zhǔn)（瓊脂稀釋法）抗生素MI18關(guān)檢厭氧菌藥敏的K-B（紙片法）說明：厭氧菌的藥敏試驗(yàn)一般不宜使用K-B法做敏感試驗(yàn)，提倡使用試管或瓊脂稀釋法做藥敏，有時(shí)為了臨床需要也做K-B法,提供臨床參考。關(guān)檢厭氧菌藥敏的K-B（紙片法）說明：厭氧菌的藥敏試驗(yàn)一般不19方法1.紙片的制備：選用國產(chǎn)新華Ⅰ號(hào)濾紙，使用打孔機(jī)制備成為6mm紙片。2.紙片干熱滅菌（120℃）2h滅菌。3.按表4配好各種抗生素濃度。方法1.紙片的制備：選用國產(chǎn)新華Ⅰ號(hào)濾紙，2.紙片干熱20表4紙片法各種抗生素配制及判定標(biāo)準(zhǔn)（引自國內(nèi)1993發(fā)表資料綜合）抗生素抑菌環(huán)