蟾蜍骨骼肌興奮與收縮實(shí)驗(yàn)

蟾蜍骨骼肌興奮與收縮實(shí)驗(yàn)【摘要】：目的：研究不同刺激強(qiáng)度/頻率對(duì)肌肉收縮的影響，探究神經(jīng)-肌肉接頭興奮傳遞和骨骼肌興奮的電變化與收縮之間的時(shí)間關(guān)系和特點(diǎn)。方法：制備蟾賒坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本，利用RM6240多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)和張力換能器，記錄不同刺激強(qiáng)度、刺激頻率對(duì)肌肉收縮張力的影響，以及不同波間隔對(duì)神經(jīng)、肌膜動(dòng)作電位和肌肉收縮張力的影響。結(jié)果：在逐步增加刺激強(qiáng)度時(shí)，骨骼肌收縮的閾刺激和最大刺激強(qiáng)度分別是0.463±0.286V和0.611±0.389V，對(duì)應(yīng)的肌張力是1.172±0.958g和9.908±7.816g。改變刺激頻率時(shí)，產(chǎn)生完全強(qiáng)直收縮的頻率是18.2±3.9Hz，對(duì)應(yīng)的骨骼肌收縮張力分別是41.76±28.01g。用甘油任氏液處理后肌肉張力逐漸減弱至消失。結(jié)論：當(dāng)刺激強(qiáng)度在閾強(qiáng)度與最大刺激強(qiáng)度范圍內(nèi)時(shí)，隨著刺激強(qiáng)度的增加，骨骼肌收縮的幅度也是增大。隨著刺激頻率的增加，骨骼肌的反應(yīng)依次為單收縮、不完全強(qiáng)直收縮和完全強(qiáng)直收縮，骨骼肌收縮的幅度也是增大。同步觸發(fā)雙刺激不同波間隔引起收縮強(qiáng)度不同。甘油任氏液使肌肉失去收縮活力，但依舊有電位產(chǎn)生。【關(guān)鍵詞】：蟾賒坐骨神經(jīng)-腓腸肌電刺激刺激強(qiáng)度刺激頻率收縮張力1?引言骨骼肌的收縮功能對(duì)人體正常生命活動(dòng)具有重要意義，其主要作用是保持身體姿勢(shì)和產(chǎn)生隨意運(yùn)動(dòng)，另外還參與呼吸、咀嚼、吞咽、語(yǔ)言活動(dòng)及產(chǎn)熱等。骨骼肌屬于隨意肌，在中樞神經(jīng)控制下接受軀體運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的支配，神經(jīng)纖維傳出神經(jīng)沖動(dòng)，經(jīng)神經(jīng)-肌接頭把興奮傳遞給骨骼肌，引起骨骼肌的興奮，最終通過(guò)興奮-收縮耦聯(lián)機(jī)制引起骨骼肌的收縮［1］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究蟾賒坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本，觀察及測(cè)量不同刺激強(qiáng)度、頻率下腓腸肌張力變化，不同波間隔下神經(jīng)十電位、肌細(xì)胞電位、腓腸肌張力各自變化及其相互聯(lián)系，探究神經(jīng)-肌接頭的興奮傳遞特性和骨骼肌興奮-收縮耦聯(lián)的電生理特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)材料2.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象：蟾蜍（Toad）一只（浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）2.2實(shí)驗(yàn)儀器：RM6420BD型多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠）肌肉張力換能器JZJ01型（成都儀器廠）神經(jīng)-肌肉標(biāo)本盒探針、玻璃分針、鋅銅弓、手術(shù)剪刀2.3實(shí)驗(yàn)藥品和試劑：任氏液、甘油高滲任氏液實(shí)驗(yàn)方法3.1蟾蜍離體坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本制備雙毀髓法處死蟾蜍，針尖刺入顱腔毀腦時(shí)，針的傾斜角度必須很小.剝離出腓腸肌，然后按常規(guī)操作制備蛙和蟾蜍離體坐骨神經(jīng)——腓腸肌標(biāo)本，制備好的標(biāo)本放置在盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。3.2實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)連接將坐骨神經(jīng)——腓腸肌標(biāo)本固定在肌槽上，并將坐骨神經(jīng)搭在刺激電極上，刺激的輸出線與肌槽刺激電極連接。將張力換能器用雙凹夾固定于鐵支臺(tái)上，其換能器的輸出線插入計(jì)算機(jī)的信號(hào)輸人插口.將腓腸肌跟腱結(jié)扎線的一端與張力換能器的簧片相連，調(diào)節(jié)好扎線的張力，不可過(guò)松或過(guò)緊，此連線應(yīng)與桌面垂直（保證肌肉一旦收縮，即可牽動(dòng)張力傳感器的應(yīng)變梁），啟動(dòng)RM6240系統(tǒng)軟件，調(diào)節(jié)微距調(diào)節(jié)器，將前負(fù)荷調(diào)至1.8~2.2g。3.3刺激強(qiáng)度對(duì)骨骼肌收縮的影響刺激方式單次，刺激幅度0.1~0.3V可調(diào)，刺激波寬0.1ms.開始記錄，點(diǎn)擊“刺激”按鈕，刺激強(qiáng)度從0.1V逐漸增大，強(qiáng)度增量0.02~0.05V，連續(xù)記錄肌肉收縮曲線，記錄閾刺激和最大刺激值并測(cè)量每一刺激強(qiáng)度所對(duì)應(yīng)的肌肉收縮張力3.4刺激頻率對(duì)骨骼肌收縮的影響刺激頻率按1Hz、2Hz、3Hz、4Hz、5Hz、…、30Hz逐漸增加（或刺激間隔逐漸減?。?，連續(xù)記錄不同頻率時(shí)的肌肉收縮曲線，觀察不同頻率時(shí)的肌肉收縮形態(tài)和張力變化。RM6240系統(tǒng)在記錄結(jié)束后，在通道左側(cè)的“處理”下拉菜單中選擇“刺激參數(shù)標(biāo)注”，可顯示刺激頻率。觀察各刺激頻率所對(duì)應(yīng)的肌肉收縮最大張力。3.5坐骨神經(jīng)十不應(yīng)期的測(cè)定測(cè)定神經(jīng)十動(dòng)作電位、骨骼肌動(dòng)作電位，肌肉收縮的同步關(guān)系及骨骼肌的不應(yīng)期：保持刺激強(qiáng)度（最大刺激強(qiáng)度），刺激持續(xù)時(shí)間（0.1ms），刺激頻率（20ms）一定，采用雙刺激，測(cè)量不同波間隔下三者的收縮曲線（波間隔分別為0.5ms，2ms，10ms），記錄收縮曲線和相應(yīng)的骨骼肌收縮張力大小。3.6觀察甘油高滲任氏液處理對(duì)骨骼肌收縮的影響用浸潤(rùn)20%-30%甘油高滲任氏液的棉花包裹腓腸肌，每隔30s用單刺激刺激標(biāo)本一次，記錄出現(xiàn)動(dòng)作電位而腓腸肌不收縮的時(shí)間。3.7統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果以X±S表示，Student’st-test檢驗(yàn)與方差分析。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1用鋅銅弓刺激：刺激神經(jīng)時(shí)腓腸肌收縮，刺激肌肉時(shí)腓腸肌收縮。4.2不同刺激強(qiáng)度刺激坐骨神經(jīng)對(duì)腓腸肌收縮張力的影響：數(shù)據(jù)記錄見下表閾刺激最大刺激樣本強(qiáng)度（V）收縮張力（g）強(qiáng)度（V）收縮張力（g）10.2201.6290.28013.21120.2102.0500.27021.93030.6500.5001.2008.70040.6000.9160.7501.92450.2503.3100.31022.240

60.2600.5860.3402.53070.5200.1470.6402.14080.2901.4300.60014.84090.2600.4580.3707.180101.1000.6961.3504.380average0.4361.1720.6119.908SD0.2860.9580.3897.816下圖為一次強(qiáng)度刺激實(shí)驗(yàn)的記錄波形(縱坐標(biāo)收縮張力與橫坐標(biāo)刺激強(qiáng)度)可見骨骼肌收縮的閾刺激和最大刺激強(qiáng)度分別是0.463±0.286V和0.611土0.389V，對(duì)應(yīng)的肌張力是1.172±0.958g和9.908±7.816g。兩者進(jìn)行t檢驗(yàn)，有顯性差異(p<0.05),說(shuō)明閾刺激強(qiáng)度時(shí)的肌肉收縮力顯著低于最大刺激強(qiáng)度時(shí)的肌肉收縮力。當(dāng)刺激小于閾值時(shí)，骨骼肌沒有收縮，在閾刺激與最大刺激強(qiáng)度之間，腓腸肌的收縮力隨著刺激強(qiáng)度的增大而增大大，刺激強(qiáng)度大于最大刺激強(qiáng)度，腓腸肌的收縮力不再增大。4.3不同頻率刺激刺激坐骨神經(jīng)對(duì)腓腸肌收縮張力的影響：數(shù)據(jù)記錄見下表單收縮不完全強(qiáng)直收縮完全強(qiáng)直收縮樣本頻率(Hz)張力(g)頻率(Hz)張力(g)頻率(Hz)張力(g)1110.26519.6020.048.542122.16527.4722.096.17316.78512.6415.041.22

411.4551.9112.06.125121.16527.2819.075.49611.9854.7621.032.98710.1950.7319.04.408116.08524.6917.034.22917.14510.0824.046.351013.8558.7913.032.06average19.10513.7918.241.76SD08.11010.303.928.01下圖為一次頻率刺激實(shí)驗(yàn)的記錄波形（縱坐標(biāo)收縮張力，橫坐標(biāo)刺激頻率）刺激頻率為1Hz時(shí)刺激頻率肌肉表現(xiàn)為單收縮，5Hz時(shí)表現(xiàn)為不完全強(qiáng)直收縮，最低頻率為18.2±3.9Hz。不完全強(qiáng)直最大收縮力和完全強(qiáng)直最大收縮力顯著高于單收縮的最大收縮力（p1<0.05；p2<0.05）。由此可見在逐漸增加刺激頻率時(shí)，收縮形式依次出現(xiàn)單收縮、不完全強(qiáng)直收縮和完全強(qiáng)直收縮，隨著頻率刺激的逐漸增大，腓腸肌的收縮力不斷增加，到完全強(qiáng)直收縮后，再增加刺激頻率，腓腸肌的收縮力增大趨緩直至不再變化。4.4不同刺激波間隔對(duì)肌肉收縮的影響：

40.902.783.68513.9015.4032.8061.085.595.3174.219.819.8983.048.578.8799.647.9111.28102.9311.1011.91average5.068.7213.25SD4.593.998.52以下三圖分別為一次試驗(yàn)中記錄下的間隔分別為0.5ms,2ms,10ms時(shí)的波形

刺激間隔為0.5ms肌收縮張力5.06±13.73g,2ms肌收縮張力8.72±22.9g,10ms肌收縮張力13.25±35.37g。。實(shí)驗(yàn)得出不同波間隔的神經(jīng)十動(dòng)作電位與肌膜動(dòng)作電位曲線有所不同。4.5甘油高滲任氏液處理對(duì)骨骼肌收縮的影響：用甘油高滲任氏液處理后的骨骼肌收縮張力逐漸減小至消失，而肌電位和神經(jīng)電位依舊存在。以下兩圖是一次實(shí)驗(yàn)中用甘油高滲任氏液處理后一分鐘和4.5分鐘后的波形

可見在處理后一分鐘時(shí)仍有一定張力存在，而4.5分鐘時(shí)則基本消失。而肌電位和神經(jīng)電位依舊存在。5.討論：5.1閾刺激與最大刺激：腓腸肌大多數(shù)是快顫搐型肌纖維［1］，支配腓腸肌收縮的神經(jīng)是Aa纖維，Aa纖維的直徑有很大差異，其閾值也有較大差異［1，2］。單十恒定時(shí)間的方波電壓刺激坐骨神經(jīng)干，電壓低于閾值的強(qiáng)度刺激，坐骨神經(jīng)十支配腓腸肌的神經(jīng)纖維不發(fā)生興奮，其所支配的肌細(xì)胞也不會(huì)發(fā)生興奮和收縮。刺激電壓達(dá)到閾強(qiáng)度時(shí)，坐骨神經(jīng)十中閾值最低的神經(jīng)開始興奮，其所支配的運(yùn)動(dòng)單位的肌纖維興奮并發(fā)生收縮，刺激強(qiáng)度逐漸增大，坐骨神經(jīng)十中興奮的神經(jīng)纖維增加，興奮和收縮的運(yùn)動(dòng)單位增加，其所募集的收縮張力也增加。刺激電壓達(dá)到使支配腓腸肌的Aa纖維全部興奮，腓腸肌全部的運(yùn)動(dòng)單位增加都興奮并收縮，收縮張力達(dá)單收縮最大值。5.2單收縮、不完全強(qiáng)直收縮、完全強(qiáng)直收縮：以最大刺激電壓的連續(xù)脈沖刺激坐骨神經(jīng)干，剌激波的間隔時(shí)間大于單收縮的持續(xù)時(shí)間，肌肉收縮波呈現(xiàn)與刺激頻率相同的單收縮波；刺激波間隔小于單收縮的持續(xù)時(shí)間，肌肉收縮波發(fā)生融合（總和），融合發(fā)生于舒張期，出現(xiàn)不完全強(qiáng)直收縮；融合發(fā)生于收縮期，出現(xiàn)完全強(qiáng)直收縮波，但神經(jīng)十動(dòng)作電位不發(fā)生融合。隨著刺激波間隔的減小，腓腸肌收縮張力也逐漸增大，強(qiáng)直收縮產(chǎn)生的張力顯著大于單收縮。肌肉單收縮時(shí)，胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高的持續(xù)時(shí)間太短，被激活的收縮蛋白尚未產(chǎn)生最大張力時(shí)，胞漿Ca2+濃度即已開始下降，單收縮產(chǎn)生的張力不能達(dá)到胞漿內(nèi)Ca2+濃度相應(yīng)的最大張力。強(qiáng)直收縮時(shí)，肌細(xì)胞連續(xù)興奮，引起終池中的鈣連續(xù)釋放胞漿內(nèi)的Ca2+濃度持續(xù)升高，使肌肉未完全舒張或未舒張時(shí)進(jìn)一步收縮，使收縮張力逐漸增大，完全強(qiáng)直收縮時(shí)收縮張力達(dá)到了一個(gè)穩(wěn)定的最大值［3］。5.3不應(yīng)期：刺激波間隔小于0.5ms時(shí)，神經(jīng)干的第2個(gè)動(dòng)作電位消失，肌肉的收縮顯著降低。刺激波間隔小于神經(jīng)十不應(yīng)期，第二個(gè)刺激落在神經(jīng)十的絕對(duì)不應(yīng)期內(nèi)，神經(jīng)纖維不發(fā)生