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多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第1頁,課件共13頁,創(chuàng)作于2023年2月一、實(shí)驗(yàn)原理:PCR又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是一種體外酶促合成特異DNA片段的方法,主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成:即在高溫下,待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板;而后在低溫情況下,兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合,形成部分雙鏈;在Taq酶的最適溫度(72℃)下,以引物3’端為合成的起點(diǎn),以單核苷酸為原料,Mg2+存在下,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新鏈。這樣,每一雙鏈的DNA模板,經(jīng)過一次解鏈、退火、延伸三個(gè)步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復(fù)進(jìn)行,每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板,每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍,PCR產(chǎn)物得以指數(shù)形式迅速擴(kuò)增,經(jīng)過25~30個(gè)循環(huán)后,理論上可使基因擴(kuò)增數(shù)百萬倍。第2頁,課件共13頁,創(chuàng)作于2023年2月1.DNA模板:反應(yīng)中DNA量在50ng~200ng左右。且DNA純度較高,以增加反應(yīng)特異性。2.dNTP:反應(yīng)體系中達(dá)100μM~200μM。3.Mg2+:Mg2+是Taq酶的輔基濃度在2.0mM左右,濃度太低Taq酶活力降低;太高反應(yīng)特異性降低。4.引物:根據(jù)目的基因兩側(cè)特定序列設(shè)計(jì)。引物約20堿基左右;G+C含量在40%-70%之間;引物內(nèi)部不能有回該序列;引物3’端不能互補(bǔ)。5.Taq酶:它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性DNA聚合酶,在95℃時(shí)30分鐘還有50%活力。說明第3頁,課件共13頁,創(chuàng)作于2023年2月PCR過程示意圖第4頁,課件共13頁,創(chuàng)作于2023年2月

二、實(shí)驗(yàn)所需器材和試劑器材:臺(tái)式高速離心機(jī),恒溫水浴鍋,PCR擴(kuò)增儀,瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng),凝膠成像系統(tǒng),Eppendorf離心管,PCR小管

第5頁,課件共13頁,創(chuàng)作于2023年2月試劑:

引物1,引物2,dNTPmix,10XPCRBuffer,TaqDNA聚合酶,EB,上樣緩沖液,marker,瓊脂糖,TBE緩沖液第6頁,課件共13頁,創(chuàng)作于2023年2月三、實(shí)驗(yàn)步驟1:加樣按次序在PCR小管中加入下列試劑(50ul體系):

5ul10XPCRBuffer4uldNTPmix2ul引物12ul引物23ul模板

1ulTaqDNApolymerase

加水到總體積50ul第7頁,課件共13頁,創(chuàng)作于2023年2月第8頁,課件共13頁,創(chuàng)作于2023年2月注意事項(xiàng):同時(shí)設(shè)立對(duì)照組(對(duì)照組不加模板DNA)第9頁,課件共13頁,創(chuàng)作于2023年2月2、按以下參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(對(duì)于不同的PCR反應(yīng)應(yīng)設(shè)置不同的反應(yīng)條件)94℃4分鐘94℃30秒51℃30秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)72℃30秒72℃5分鐘4℃

第10頁,課件共13頁,創(chuàng)作于2023年2月將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組放入PCR儀,按設(shè)定好的條件進(jìn)行擴(kuò)增第11頁,課件共13頁,創(chuàng)作于2023年2月3、擴(kuò)增結(jié)束后,取5ul產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以觀察結(jié)果PCR結(jié)果示意圖第

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