《川產道地藥材生產技術規(guī)程 黃連（味連）》編制說明

124-《川產道地中藥材生產技術規(guī)程黃連》（征求意見稿）編制說明目錄TOC\o"1-1"\h\u一、 工作簡況 -2-二、 標準編制原則和主要內容 -5-三、 主要試驗(或驗證)的分析、綜述報告 -7-四、 采用國際標準和國外先進標準的程度 -33-五、 與有關的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性國家標準的關系； -34-六、 重大分歧意見的處理經過和依據(jù) -34-七、 作為強制性國家標準或推薦性標準的建議 -34-八、 實施標準的要求和措施建議 -34-九、 廢止現(xiàn)行有關標準的建議 -34-十、 其他應予說明的事項 -34-工作簡況（一）任務來源根據(jù)四川省市場監(jiān)督管理局2022年6月7日發(fā)出的《關于下達2022年度地方標準制修訂項目立項計劃的通知》（川市監(jiān)函〔2022〕295號），批準由西南交通大學牽頭起草地方標準《川產道地中藥材生產技術規(guī)程-黃連》。（二）目的意義黃連是四川著名的道地藥材之一，具有歷史悠久，質量及產量佳，目前，黃連優(yōu)質高產種植技術方法不盡相同，沒有統(tǒng)一的標準，在種植技術缺乏可操作性標準。并且由于缺乏規(guī)范化生產技術，目前通過人工種植(養(yǎng)殖)的藥材品種不到藥材總量的2%。由于栽培品種較少，栽培歷史不長，中藥材生產技術落后、栽培管理粗放，種植技術還停留在只求成活、不講產量與質量的低水平上，與一般的糧食作物和經濟作物相比，中藥材生產技術至少落后10-20年。另一方面，現(xiàn)有生產技術科技含量較低，不完善配套，規(guī)范化程度低，一些技術難點長期沒有突破。根據(jù)《中華人民共和國中醫(yī)藥法》和《四川省中醫(yī)藥條例》中指出，國家鼓勵發(fā)展中藥材規(guī)范化種植，鼓勵建立道地中藥材評價體系，扶持道地中藥材生產基地建設，保護道地中藥材，省人民政府有關部門應當建立川產道地藥材保護和質量體系，制定并發(fā)布川產道地藥材省級中藥材標準。同時，《四川省中藥材產業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2018-2025年）》指出以中藥材產業(yè)標準體系為抓手，以道地、大宗藥材產業(yè)發(fā)展為重點，推進我省中藥材產業(yè)高質量發(fā)展。故本標準從黃連高產關鍵問題入手，采取自主創(chuàng)新和積極引進并重的原則，結合黃連生產特點，針對企業(yè)人力資源、前提方案、關鍵過程控制、產品檢測等，根據(jù)中藥材安全、有效、高產的要求，旨在提高中藥材質量穩(wěn)定性和安全性，保障人民身體健康。工作過程成立起草小組2021年12月，標準起草工作小組向四川省質量技術監(jiān)督局遞交了《川產道地中藥材生產技術規(guī)程-黃連》的申報書，2022年06月獲批準立項。2021年12月成立了標準起草小組，標準起草工作組就標準的基本框架及內容進行了充分討論，研究了標準的編寫工作并對工作組成員分工、工作進度及時限要求作了具體安排。起草階段2022年01月-2022年02月，標準起草小組展開調研，對黃連高產栽培技術相關文獻進行研究并進行野外調查取樣。2022年03月-2022年05月，標準起草小組對各地道地與非道地藥材栽培技術進行比較。2022年06月-2022年07月，擬定標準編制提綱，起草標準。標準起草小組收集國內外有關標準文獻資料，進行分析比較，同時根據(jù)各地合作種植基地的試驗結果，確定標準的范圍及主要技術內容，提出標準編制提綱。根據(jù)GB/T1.1-2020《標準化工作導則第一部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》編制原則，編制標準初稿。征求意見階段2022年07月-2022年08月，形成征求意見稿。經過標準主要起草成員的充分討論及多次修改和完善，在主產區(qū)瓦屋山、峨眉山、樂山等地黃連生產合作社及種植戶、相關合作藥業(yè)單位以及重慶市中藥研究院等中廣泛征求意見，并獲得標準征求意見反饋建議，經過修改和完善，最終形成了《川產道地中藥材生產技術規(guī)程-黃連》（征求意見稿）。主要起草單位及人員分工主要起草單位單位名稱牽頭/協(xié)作單位主要工作任務西南交通大學牽頭單位總負責和組織，標準起草與完善重慶市中藥研究院協(xié)作單位標準起草及完善瓦屋山藥業(yè)協(xié)作單位標準起草、黃連生產與試驗沙灣合作社協(xié)作單位標準起草、黃連生產與試驗眉山市彭山區(qū)衛(wèi)生局協(xié)作單位標準起草、黃連生產與試驗樂山市犍為縣衛(wèi)生計生局協(xié)作單位標準起草、黃連生產與試驗樂山市犍為縣中醫(yī)院協(xié)作單位標準起草、黃連生產與試驗主要起草人員姓名工作單位任務分工備注譚睿西南交通大學統(tǒng)籌協(xié)調、制定標準制訂方案瞿顯友重慶市中藥研究院資源參與標準起草、檢索、編制及資料復核任瑤瑤西南交通大學參與標準起草劉洋西南交通大學參與標準起草冷沁潔西南交通大學參與標準起草吳曉青西南交通大學參與標準起草顧健西南民族大學參與標準起草嚴光玉洪雅縣瓦屋山藥業(yè)參與標準起草楊鈺樂山市沙灣區(qū)沙灣鎮(zhèn)農場村經濟合作社參與標準起草標準編制原則和主要內容（一）編制原則本標準的編制遵循以下原則：科學性原則本標準的制定應充分考慮特色栽培及加工技術與道地藥材生物學特性、產地環(huán)境與的內在關系，注意揭示所提煉特色技術的科學內涵。實用性原則本標準的制定應根據(jù)道地藥材產區(qū)實際生產情況確定標準中相關技術及技術方法，防止脫離實際，標準的制定應具有用于指導道地藥材生產加工的針對性、實用性和應用價值。先進性原則本標準的制定應在突出傳統(tǒng)特色技術同時，積極推薦具有道地產區(qū)已經在應用的現(xiàn)代技術。（二）主要內容標準主要內容如下：1.標準規(guī)定了川黃連道地藥材高產栽培技術的術語和定義、產地環(huán)境、栽培、采收加工、標識、包裝、貯存、病蟲害防治等技術要求。2.通過在本標準中引用而構成為本標準中的條款。凡注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本文件。3.標準中黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連CoptisdeltoideaC.Y.ChengetHsiao或云連CoptisteetaWall.的干燥根莖。以上三種分別習稱“味連”、“雅連"、“云連”。本標準中涉及的為味連。黃連（味連）具有喜濕潤忌干旱，怕強光喜弱光忌高溫，在霜雪下葉片能保持常綠不枯，在零下18℃的低溫條件下，可正常越冬的生物遺傳學特性。4.標準規(guī)定栽培黃連（味連）的產地環(huán)境，如生態(tài)環(huán)境，包括海拔、無霜期、平均氣溫、光照、水分、土壤、地形地勢，產地環(huán)境質量等技術參數(shù)。5.標準的選地原則是在栽培黃連（味連）的生態(tài)環(huán)境基礎上，結合現(xiàn)代栽培技術對種植地的具體要求，是川黃連道地藥材的主要成因之一。6.整地：包括熏土、翻土、開溝作廂等。7.大田搭棚與移栽定植其中搭棚是黃連（味連）栽培生產中避免陽光直射植株，保證生長旺盛，發(fā)育均一的關鍵技術之一，也是栽培黃連（味連）維系道地藥材質量的成因之一，標準規(guī)定了搭棚技術參數(shù)、移栽定植時間、行株距等技術參數(shù)。8.田間管理：培土與施肥是黃連（味連）栽培生產中關鍵技術之一，培土促進植株側芽和根莖的發(fā)育，施肥保障植株生長旺盛，是增加產量和保證質量的，本標準規(guī)定了補苗、除草、培土與施肥、蔭棚管理等技術參數(shù)。9.病蟲害防治:規(guī)定了黃連（味連）主要病蟲害的農業(yè)防治與化學防治方法。主要試驗(或驗證)的分析、綜述報告（一）不同產地的黃連的生態(tài)分析1.1黃連樣點空間分布格局分析根據(jù)數(shù)據(jù)庫、文獻及本課題組的實際調查發(fā)現(xiàn)，黃連生長最適宜區(qū)主要分布在四川洪雅、重慶石柱、武隆、巫溪、湖北利川、恩施等地。海拔、9月降水量以及2月降水量等7個生態(tài)因子是影響黃連生長的主要生態(tài)因子，相關分析結果顯示，在一定范圍內，降水量與海拔的升高有利于黃連中總生物堿含量的積累。本研究采用高效液相色譜法同時對三種黃連藥材中7種生物堿成分進行了含量測定研究;以各生物堿及總生物堿的含量為指標按省份分組進行統(tǒng)計分析,初步確定了最優(yōu)黃連產區(qū)為四川洪雅、湖北恩施、利川以及重慶等地。同時在生態(tài)位模型理論的指導下,利用最大信息熵模型對黃連進行適生性的研究,結合統(tǒng)計學理論知識對采樣點的生境適宜度值進行分等,并以ArcGIS軟件輸出黃連生長適宜性等級圖,結果表明,生境適宜度范圍為[0-1],值大于0.7798的區(qū)域為黃連的最適宜生長區(qū)域,從數(shù)據(jù)以及圖形中可以看出,這些區(qū)域包括四川洪雅、湖北恩施、利川等。生態(tài)因子常常影響著藥材有效成分的積累,本研究在利用最大信息熵模型進行適生區(qū)域研究的同時,將獲取的影響黃連生長的主要生態(tài)因子與黃連的質量信息進行了相關性分析,明確了黃連總生物堿與生態(tài)因子之間的關系,并從中選取了海拔、2月降水量、9月降水量、等溫性4個關鍵因子做品質等級劃分,并利用軟件進行品質影響分析,得到每個因子的品質等級圖和因子等級疊加圖以及最終三種黃連品質區(qū)劃等級圖。1.2生態(tài)因子分析雅連分布的生態(tài)因子范圍：年有效積溫3419.6℃，最冷季均溫為-3.3-15.6℃，最熱季均溫為22.5-38.7℃，年均溫為8-10℃，年均降水量為1000-1800mm，年均日照為1161h，土壤類型主要為富含腐殖質的黃棕壤、紅壤，土壤質地宜為輕壤土或壤土等。結合分布點的生態(tài)因子及氣候劃分來說，主要分布于亞熱帶濕潤氣候，氣候溫和，雨量充沛，四季分明，雨熱同季，夏無酷熱，冬無嚴寒。味連分布的生態(tài)因子范圍：年有效積溫3419.6℃，最冷季均溫為-3.6-16.6℃，最熱季均溫為21.5-37.7℃，年均溫為14.4℃，年均降水量為2000mm，年均日照為1140h左右，土壤類型主要為富含腐殖質的黃棕壤、紅壤，土壤質地宜為輕壤土或壤土等。結合分布點的生態(tài)因子及氣候劃分來說，主要分布于亞熱帶濕潤氣候，氣候溫和，雨量充沛，四季分明，雨熱同季，夏無酷熱，冬無嚴寒。從各項生態(tài)因子來看，味連、雅連各生態(tài)因子差異不顯著，水平分布上無明顯的分界。從生態(tài)因子變異系數(shù)來看，味連和雅連中的生物堿成分與氣候及土壤等生態(tài)因子之間存在較好的相關性。與各生物堿相關的主要氣候因子是日照時數(shù)、極端最高溫、極端最低溫；主要土壤因子是水解性氮、有機質、速效磷及海拔高度。1.3全球最大生態(tài)相似度區(qū)域分析黃連為著名的四川道地藥材，目前黃連的主產區(qū)為四川省的峨眉山市、洪雅縣、彭州市、崇州市、重慶石柱及湖北利川等地，并且其周圍縣市也有種植。1.4與生物堿相關的生態(tài)因子分析黃連中的化學成分與其生長的環(huán)境的日照時數(shù)、海拔高度、氣溫、年降雨量及土壤的有機質、水解性氮、速效磷、速效鉀、pH等生態(tài)因子之間存在較好的相關性，他們不同程度的影響著黃連中化學成分的積累，其中，與藥根堿相關的生態(tài)因子主要是日照時數(shù)、極端最高最低溫、水解性氮及海拔高度與速效磷;與非洲防己堿相關的主要是日照時數(shù)、最高溫、有機質及海拔高度。與表小聚堿相關的主要是日照時數(shù)、有機質、極端最低最高溫及海拔高度。與黃連堿相關的主要是日照時數(shù)、年均溫、最高溫、及海拔高度。與巴馬汀相關的主要是日照時數(shù)、最高溫、有機質。與小璧堿相關的主要是日照時數(shù)、極端最高最低溫、海拔高度。與六種生物堿總和相關的主要是日照時數(shù)、有機質、極端最高最低溫及海拔高度與水解性氮。（二）黃連種苗分等標準研究表2.1黃連種苗各指標測量編號株高(cm)葉數(shù)葉柄長(cm)葉長(cm)葉寬(cm)葉重(g)總重(g)根莖及須根重(g)1141.082.40.76217.8710.57.061.082.290.5831496.75.450.972.280.93412.5118.25.363.436.512.12510.567.833.21.594.512.36612.3137.1450.561.290.4771397.6651.263.161.15812.588.6540.772.040.8914.2691.480.471013.101023.072.13119.7065.13.440.411.381.3129.00144.33.330.681.291.211310.100.461.241.141412.2076.844.80.631.461.18159.201062.982.091697544.20.351.130.91711.67654.20.731.871.64187.8125.843.80.782.191.91911.542.071.92均值11.7898.6846.8424.5264.4470.9572.3491.318方差2.3982.4511.5901.0130.7930.6711.3220.613從表2.1可以看出種苗以株高及葉數(shù)的方差較大，說明這二者指標變異范圍大。表2.2黃連種苗根莖及須根與其它指標相關性相關系數(shù)株高葉數(shù)葉柄長葉長葉寬葉重總重根莖及須根p值株高1-0.28140.81830.78570.71840.23470.1386-0.45690.0493葉數(shù)1-0.3329-0.1330-0.10050.15010.08730.06250.7994葉柄長10.67230.61820.39880.3475-0.22710.3499葉長10.71280.30110.2218-0.34000.1543葉寬10.45180.2994-0.24790.3062葉重10.95000.43790.0608總重10.61070.0055從表2.2可以看出，黃連須根及根莖與總重和葉重呈正相關，與株高、葉柄長負相關，說明種苗不是越高越好。種苗與總重的相關性顯著，與株高呈顯著性的負相關。而葉重與葉寬、葉柄長、葉長、株高、葉數(shù)成正相關。表2.3黃連種苗的基本統(tǒng)計數(shù)據(jù)指標樣本數(shù)最小值最大值均值標準差株高8191.120.512.649452.332021葉數(shù)8193256.9462762.38004葉柄8054821.275526葉長8705741.056671葉寬81926.83.5371180.755673由表2.3可以看出，種苗株高均在12cm以上，葉數(shù)為6片以上。表2.4種苗動態(tài)聚類結果分組樣本數(shù)株高葉數(shù)葉柄長葉長葉寬所占比例第1組169個14.30595.71017.42785.85443.72642.2%第2組157個10.68415.92365.79554.53183.204539.3%第3組74個13.41359.71626.5775.21083.797318.5%由表2.4可以看出，總體上種苗聚類成三類，第三組可定為Ⅰ級苗，第三組為Ⅱ級苗，第三組為Ⅲ級苗，所占的比例也較為合適。表2.5黃連種苗分級標準分項Ⅰ級Ⅱ級Ⅲ級指標葉數(shù)株高葉數(shù)株高葉數(shù)株高均值9.71621613.413515.92356710.684085.71005914.30592方差1.689921.3346241.0539391.0485211.0838151.212224臨界值8.04.613.1調整8126946由以上數(shù)據(jù)可得出種苗分級的初步標準，Ⅰ級種苗：葉數(shù)≥8片，株高≥12cm；Ⅱ級種苗：葉數(shù)≥5片，株高≥9cm；Ⅲ級種苗與Ⅱ級苗的葉數(shù)相近，在生產中難以區(qū)分，因而把Ⅱ級種苗的葉數(shù)調整為6，Ⅲ級葉數(shù)降為4，株高降為6，Ⅲ級種苗：葉數(shù)≥4，株高≥6cm。等外級以下種苗需留床培育。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，種苗分級不能單從葉片數(shù)目及株高兩方面進行劃分，后續(xù)還需對更多的因素進行考察，以完善種苗分級標準。（三）黃連種植生產研究3.1種植資源研究3.1.1研究方法黃連為著名的四川道地藥材，目前黃連的主產區(qū)為四川省的洪雅縣、大邑、彭州市、汶川縣、安縣等地，并且其周圍縣市也有種植。洪雅縣地處四川盆地西南邊緣，地理坐標為東經102°49'-103°32'，北緯29°24'-30°00'，位于成都、樂山、雅安三角地帶，東接夾江縣、峨眉山市，南靠漢源縣、金口河區(qū)，西臨雅安雨城區(qū)、滎經縣，北界名山縣、丹棱縣，距成都147公里、樂山55公里、眉山50公里、雅安62公里。幅員面積1896.49平方公里。洪雅縣屬中亞熱帶濕潤氣候，年降雨量1435.5毫米，日照1006.1小時，年無霜期307天，年平均氣溫16.6℃，屬中亞熱帶濕潤氣候。洪雅縣地形由西南向東北高低梯次變化形成高山、深丘、淺丘、臺地、河谷、壩，地貌以山地丘陵為主，河谷平壩分布在青衣江、花溪河兩岸，素有"七山二水一分田"之稱。全縣呈南北兩端寬，中間狹窄，形狀如啞鈴。南北長64km，北部寬46km，中間僅15km，境內有瓦屋山、玉屏山、金舟山、八面山、九龍山、隱蒙山等。洪雅縣有大小河流330條。青衣江洪雅段總長58.3公里。漢王湖屬青衣江水系一支流--香樟河。漢王湖集雨面積達28平方公里，水域面2067700平方米，湖長15公里，水均深17.1米，主湖灣有10條，長約7公里。湖中有170余座青山環(huán)抱，有九灣18坳之稱。洪雅縣有桫欏、珙桐、銀杏、箭竹、紅豆木、楨楠等植物近4000種，其中一類植物有桫欏、珙桐;有大熊貓、扭角羚、小熊貓、麝鹿、金錢豹、紅腹角雉等野生動物400余種，其中一類保護動物有大熊貓、扭角羚、金錢豹。中草藥種類達2000余種，常用的有280余種，其中杜仲、黃連、厚樸、紅豆杉、薯蕷等規(guī)模較大。該縣氣候溫和濕潤,環(huán)境無污染,發(fā)展無公害農業(yè)特別是藥材種植具有得天獨厚的條件，同時當?shù)鼐用窬哂薪?0年的黃連種植經驗。2018年，總人口35.2萬，其中：農村人口25.3萬、城鎮(zhèn)人口9.9萬。是典型的山區(qū)農業(yè)縣,農民收入主要來源于種、養(yǎng)殖業(yè)和務工收入。樂山市沙灣區(qū)范店鄉(xiāng)四川省樂山市沙灣區(qū)一個典型的山區(qū)鄉(xiāng)。面積54.377平方公里。轄10個村委會，60個村民小組和1個社區(qū)?？倯魯?shù)1473戶4745人。東臨龔嘴沙灣兩鎮(zhèn)，南面與峨邊縣五渡鎮(zhèn)隔河相望，西靠峨嵋山市龍門鄉(xiāng)，北連峨嵋山市和沙灣鎮(zhèn)。2006年已通過省級中藥材基地驗收。是遠近聞名的中藥材之鄉(xiāng)。耕地面積4780.62畝。地理坐標介于東經103°25′13″至103°30′15″和北緯29°17′25″至29°23′20″之間。境域輪廓呈鍋邊形，周邊相鄰3個縣(市、區(qū))，平均海拔1094米，最高點為畜豐村3組筍子山，海拔1740米。鄉(xiāng)人民政府駐地海拔530米左右，距沙灣城區(qū)18.38公里。范店鄉(xiāng)屬中亞熱帶濕潤季風氣候，為低山溫和中高山秋冬季霧照區(qū)。年日照為1010小時左右，日照百分率為20%--30%。最高氣溫為35℃，最低氣溫-3.5℃，全年無霜期天數(shù)為300--315天，常年降雨量1500--1700毫米。最高海拔1740米，最低海拔528米。范店鄉(xiāng)黨委政府以黃連、白術、林竹、干果、茶葉為支柱產業(yè)，走出了一條有范店特色的農業(yè)產業(yè)化道路，全鄉(xiāng)黃連、白術等中藥材種植面積已達到一萬畝，林竹發(fā)展已初具規(guī)模，現(xiàn)擁有林竹面積5.5萬畝，木材蓄積量達15萬立方米。綜合環(huán)境因素調查分析表明,洪雅縣和樂山市沙灣區(qū)范店鄉(xiāng)中高山地帶生態(tài)環(huán)境特別有利于川黃連生長。中藥材種植業(yè)的發(fā)展有利于合理利用時間、空間和土地資源,有效保護洪雅道地藥材的種質資源,對鞏固退耕還林成果,增加農民收入,致富一方農民具有極為重要的作用。近年來,縣委、縣政府立足資源優(yōu)勢,切實加強對中藥材種植業(yè)的經費支持,縣農業(yè)技術部門制定了切實可行的發(fā)展規(guī)劃、實施方案和具體措施,并不斷加強中藥材種植技術的培訓推廣,各中藥材發(fā)展的主要鄉(xiāng)鎮(zhèn),也紛紛提出了切合各鄉(xiāng)鎮(zhèn)實際的發(fā)展措施,最終確認洪雅縣和樂山市沙灣區(qū)范店鄉(xiāng)為黃連種植示范區(qū)。3.1.2研究過程黃連種植主要是采取林間套作、零散種植、規(guī)?；邪N模式，保留優(yōu)良種植模式不變，提升合理密植。在雅安洪雅地區(qū)，由于雅連為無性繁殖，且生長海拔將高，栽培極為困難，課題組聯(lián)合企業(yè)，克服重重困難，將雅連種植面積由50畝增加至200畝。在樂山市沙灣區(qū)范店鄉(xiāng)，味連種植面積達到一萬畝以上。建立黃連GAP藥源基地及制訂生產SOP從源頭上保障臨床有關于黃連基本藥物品種的質量與產量制定生產SOP，加強黃連藥材的生產建設，提高產量，從而實現(xiàn)資源的可持續(xù)性發(fā)展由于世界對中醫(yī)藥的逐漸接受和任可的原因，我國過去那種以不規(guī)范的藥材種植老路已經行不通了，為了規(guī)范黃連種植加工，使黃連生產達到優(yōu)質高產無公害的標準，與國際接軌，使中藥走向世界。通過對黃連產區(qū)的種植歷史、生態(tài)環(huán)境、種質資源、良種選育、黃連指標性成分及活性成分的檢測。最終改善產區(qū)傳統(tǒng)生產中存在的不足，形成黃連規(guī)范化種植規(guī)程種子采收及育苗——栽培管理——田間管理——病蟲害防治——采收加工——運輸儲存，完善的黃連現(xiàn)代農業(yè)下SOP制定。通過規(guī)范化種植生產出來的黃連具有優(yōu)良的品質，保證從源頭做到標準化、現(xiàn)代化。為中藥黃連品質從源頭把關。3.1.3實地考察圖3.1洪雅縣黃連種植項目組成員多次到洪雅進行實地考察，考察不同季節(jié)，不同生長年限的黃連生長情況，加工采收情況。圖3.2味連種植基地圖3.3雅連種植基地項目組成員多次到樂山市沙灣區(qū)范店鄉(xiāng)進行實地考察，考察不同季節(jié)，不同生長年限的黃連生長情況，加工采收情況。圖3.4范店鄉(xiāng)味連種植基地項目組成員多次到大邑進行實地考察，考察不同季節(jié)，不同生長年限的黃連生長情況，加工采收情況。圖3.5大邑黃連春夏圖3.6大邑黃連秋冬項目組成員多次到安縣高川鄉(xiāng)黃連進行實地考察，考察不同季節(jié)，不同生長年限的黃連生長情況，加工采收情況。圖3.7安縣高川鄉(xiāng)黃連（四）黃連生物堿成分含量測定色譜條件研究中國黃連C.chinensis根莖中含小檗堿(berberine)、黃連堿(coptisine)、表小檗堿(epiberberine)、甲基黃連堿(worenine)、掌葉防己堿（巴馬?。?palmatine)、藥根堿(jatrorrhizine)、非洲防己堿(columbamine)、小檗紅堿(berberrubine)、木蘭花堿(magnoflorine)、groenlandicine等。三角葉黃連C.deltoidea的根莖中也含小檗堿、黃連堿、掌葉防己堿（巴馬?。?、表小檗堿、甲基黃連堿、藥根堿、groenlandicine、木蘭花堿等。李佳川等通過建立胰島素抵抗細胞模型，觀察黃連“藥材－部位－生物堿”成分對胰島素抵抗模型細胞培養(yǎng)液中葡萄糖消耗的影響。結果發(fā)現(xiàn)黃連生物堿能明顯改善胰島素抵抗，這對防治與胰島素抵抗相關的代謝綜合癥或并發(fā)癥具有一定臨床意義。同時也說明了黃連生物堿部位為黃連發(fā)揮降糖作用的主要部位，因此本研究建立了黃連中7種小檗型生物堿的含量測定方法，通過主要的7種異喹啉類主要生物堿含量的差異來評價不同種川黃連的品質，為研究其降糖藥效差異奠定基礎。4.1儀器與材料Angilent1260-II型高效液相色譜儀；BS-110S電子分析天平（北京賽多利斯電子天平有限公司）；超聲波清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）。groenlandicine、表小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀購于成都普思生物生物科技有限公司（批號分別為PS161130-03、PS161130-01、PS161124-01、PS161201-01、PS161130-02，含量≥98%）非洲防己堿購于成都曼斯特生物科技有限公司（批號為MUST-14072213，含量≥98%）、鹽酸小檗堿購于中檢院（批號為110713-200911，含量≥98%）。甲醇、乙腈（色譜純，sigma）；三乙胺、磷酸、十二烷基苯磺酸鈉、磷酸二氫鉀均為分析純。4.2藥材來源本研究收集黃連藥材15批，包括味連6批，雅連6批，鳳尾連3批，均由西南交通大學生命科學與工程學院宋良科教授鑒定。詳細產地及編號見表4-1。表4.1黃連產地及編號編號品種產地1味連四川省洪雅縣瓦屋山藥業(yè)2味連四川省洪雅縣瓦屋山藥業(yè)3味連四川省洪雅縣瓦屋山黃連種植基地4味連四川省荷花池藥材市場5味連四川省樂山市麻子壩6味連四川省樂山市麻子壩7雅連四川省洪雅縣瓦屋山藥業(yè)8雅連四川省洪雅縣瓦屋山藥業(yè)9雅連四川省洪雅縣瓦屋山藥業(yè)10雅連四川省洪雅縣瓦屋山黃連種植基地11雅連四川省洪雅縣瓦屋山黃連種植基地12雅連四川省峨眉山黃灣鄉(xiāng)13鳳尾連四川省洪雅縣瓦屋山14鳳尾連四川省洪雅縣瓦屋山15鳳尾連四川省洪雅縣瓦屋山4.3色譜條件4.3.1波長選擇groenlandicine、表小檗堿、非洲防己堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿紫外吸收圖譜如圖4.1所示。7種黃連生物堿的紫外吸收在270、345nm附近出較為接近，因此根據(jù)文獻選擇345nm作為檢測波長。圖4.17種生物堿紫外吸收圖4.3.2流動相pH的選擇以乙腈-0.4%的磷酸二氫鉀（含0.4%SDS，分別用磷酸、三乙胺調節(jié)pH2.03.0、4.0、6.0、9.0）34：66為流動相，流速：1ml/min，柱溫：35℃，檢測波長：345nm，分別進樣，測得的色譜圖如圖4.2所示。pH2.0pH4.0pH2.0pH4.0pH6.0pH9.0pH6.0pH9.0圖4.2不同pH選擇的色譜圖從結果可以看出，在pH2.0時，表小檗堿和藥根堿峰完全重合；在pH4.0時，表小檗堿和藥根堿略有分開；在pH6.0時，表小檗堿和藥根堿的分離度分別為0.94和1.34。在pH9.0時，表小檗堿和藥根堿的分離度分別為11.59、4.63。所以選擇磷酸二氫鉀調節(jié)pH9.0。4.3.3緩沖鹽的選擇分別以乙腈-0.05mmol/L磷酸二氫鉀（含有0.4%SDS，pH9.0）（34:66）、乙腈-0.05mmol/L醋酸銨（含有0.4%SDS，pH9.0）（34:66）、乙腈-0.05mmol/L碳酸氫銨（含有0.4%SDS，pH9.0）（34:66）為流動相，流速：1.0ml/min，柱溫：35℃，檢測波長：345nm，分別進樣，測得的色譜圖如圖4.3所示。圖4.3不同緩沖鹽選擇的色譜圖從結果可以看出，以醋酸銨和碳酸氫銨為流動相，groenlandicine、表小檗堿、非洲防己堿、藥根堿等峰均出現(xiàn)特別嚴重的拖尾和變形，峰形不佳。而以磷酸二氫鉀為流動相，groenlandicine、表小檗堿、非洲防己堿各峰稍有拖尾，峰形較佳，因此選擇磷酸鹽緩沖液為流動相。4.3.4流動相比例的選擇分別以乙腈-0.05mmol/L磷酸二氫鉀（含有0.4%SDS，pH9.0）（34:66）、（32:68）、（30:70）為流動相，流速：1.0ml/min，柱溫：35℃，檢測波長：345nm，分別進樣，測得的色譜圖如圖4.4所示。圖4.4不同流動相比例色譜圖從結果可以看出，流動相比例30:70，整個分析周期時間為75min；流動相比例32:68，整個分析周期時間為55min；流動相比例（34:66），整個分析周期時間為45min。因此選擇流動相比例為34:66。4.3.5色譜條件色譜柱AngilentEclipseXDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈-0.4%磷酸二氫鉀（含有0.4%SDS，0.6%三乙胺，磷酸調節(jié)PH9.0）（34:66），流速1.0mL·min-1，柱溫35℃，檢測波長345nm，進樣量10μL。4.3.6對照品溶液的制備分別精密稱定7種對照品適量，鹽酸甲醇（1:100）溶解制得每1mL含有1mg的對照品儲備液。精密吸取各對照品儲備液適量，配制成每1mL分別含groenlandicine、表小檗堿、非洲防己堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿、為0.026、0.043、0.030、0.031、0.019、0.029、0.067mg/mL的混合對照品溶液。4.3.7供試品溶液的制備取黃連粉末約0.1g(過三號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25mL鹽酸甲醇（1：100），密塞，稱定重量，超聲提取45min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，放置，取上清液，過0.45μm微孔濾膜，即得供試品溶液。（五）不同地區(qū)的味連、雅連、鳳尾連生物堿成分的含量我們研究測定了6批味連、6批雅連、3批鳳尾連的生物堿含量。結果顯示，總生物堿含量：味連>鳳尾連>雅連，小檗堿含量：味連>鳳尾連>雅連，巴馬汀含量：味連>雅連>鳳尾連，黃連堿：味連>鳳尾連>雅連，表小檗堿含量：味連>雅連>鳳尾連，非洲防己堿含量：味連>鳳尾連>雅連，藥根堿含量：雅連>鳳尾連>味連；groenlandicine含量：雅連>鳳尾連>味連。雅連、味連和鳳尾連中含量最高的都是小檗堿，其7種生物堿分別的含量大小具有一定的規(guī)律性。味連：小檗堿>黃連堿>巴馬汀>表小檗堿>藥根堿>非洲防己堿>groenlandicine，不同批次間之間差異較小；雅連：小檗堿>黃連堿>巴馬汀>藥根堿>groenlandicine>表小檗堿>非洲防己堿，不同批次之間差別較??；鳳尾連：小檗堿>黃連堿>藥根堿>巴馬汀>groenlandicine>非洲防己堿>表小檗堿，批次之間藥根堿和巴馬汀含量差別較大不穩(wěn)定，其他差別較小。因此，推測3種黃連7種生物堿的大小順序具有一定穩(wěn)定性和規(guī)律性，且3種黃連7種生物堿的大小順序不同，可以運用7種生物堿含量大小順序來鑒定不同種的黃連。為黃連質量標準的修訂提供依據(jù)。精密稱取過二號篩的黃連粉末0.1g，按2.5項方法制備供試品溶液，將供試品溶液和對照品溶液各10μL進樣分析，分別測定3批不同品種黃連的生物堿含量，6批味連（S1-S6，S0為黃連生物堿混合對照品）的含量測定色譜圖如圖5.1所示，6批雅連（S7-S12，S0為黃連生物堿混合對照品）的含量測定色譜圖如圖5.2所示，3批鳳尾連（S13-S15，S0為黃連生物堿混合對照品）的含量測定色譜圖如圖5.3所示。1.groenlandicine2.jatrorrhizine3.columbamine4.epberberine5.coptisine6.palmatine7.berberine圖5.16批味藥材生物堿含量測定色譜疊加圖1.groenlandicine2.jatrorrhizine3.columbamine4.epberberine5.coptisine6.palmatine7.berberine圖5.26批雅連藥材生物堿含量測定色譜疊加圖1.groenlandicine2.jatrorrhizine3.columbamine4.epberberine5.coptisine6.palmatine7.berberine圖5.33批鳳尾連藥材生物堿含量測定色譜疊加圖（五）黃連的采收與加工研究5.1黃連的采收研究結果黃連通常在移栽后第五年收獲。據(jù)試驗，黃連栽后生長滿5年收獲的，較4年收獲的單產增加54.61%；第六年收獲的，一般比第五年收獲可增產10%～15%。因此不宜提前收獲，但也不宜超過6年，因過分延長生長期則黃連生長勢減弱，根莖易腐爛，品質差，產量下降。黃連收獲一般于10-11月進行，收獲過早，根莖水分多，不充實，折干率低，但又不宜過遲，如遲至翌年春季雪化后收獲，植株已抽薹開花，養(yǎng)分被消耗，根莖中空，產量降低，品質差。黃連宜選晴天先拆除蔭棚，然后用二齒耙挖出全株，敲落根部附土，齊根基部剪去須根，齊芽苞剪去葉片，即得鮮黃連。分別收集根莖、須根及葉片，運回加工。5.2黃連的加工研究結果5.2.1產地加工研究結果性狀味連多集聚成簇，常彎曲，形如雞爪，單枝根莖長3～6cm，直徑0.3～0.8cm。表面灰黃色或黃褐色，粗糙，有不規(guī)則結節(jié)狀隆起、須根及須根殘基，有的節(jié)間表面平滑如莖稈，習稱“過橋”。上部多殘留褐色鱗葉，頂端常留有殘余的莖或葉柄。質硬，斷面不整齊，皮部橙紅色或暗棕色，木部鮮黃色或橙黃色，呈放射狀排列，髓部有的中空。氣微，味極苦。雅連多為單枝，略呈圓柱形，微彎曲，長4～8cm，直徑0.5～lcm?！斑^橋”較長。頂端有少許殘莖。黃連分級標準一等品：根條粗壯肥實，以根條無“過橋”，外表無糊黑焦爛、折斷、須根，根莖頭部無“青樁”（即葉柄殘基），斷面內心金黃色。二等品：根條稍細小，兩端或一端有“過江枝”，肉身較枯瘦，有少數(shù)青樁，須根未完全去凈，干燥。三等品：根莖細小，枯瘦和短小，并有“青樁”存在，有須根及“過江枝”摻雜。5.2.2炮制加工研究結果味連(1)凈制：取原藥材，除去雜質，搶水洗凈，潤透，切薄片，晾干?；蛴脮r搗碎。(2)酒黃連：取黃連片，用黃酒拌勻，悶潤至酒被吸盡，置炒藥鍋內，用文火加熱，炒干，取出放涼。黃連片每100千克用黃酒12.5千克(3)姜黃連：取黃連片，用姜汁拌勻，悶潤至姜汁被吸盡，置炒藥鍋內，用文火加熱，炒干，取出放涼。黃連片每100千克，用生姜12.5千克搗汁或干姜4千克煎汁。(4)萸黃連：取凈吳茱萸，加水適量，煎煮半小時，去渣取汁拌入黃連片中，悶潤至吳茱萸汁被吸盡，置炒藥鍋內，用文火加熱，炒干，取出放涼。黃連片每100千克用吳茱萸1