細(xì)胞生物學(xué)研究方法考研細(xì)胞生物學(xué)輔導(dǎo)講義

學(xué)習(xí)重點(diǎn)：1.光學(xué)顯微技術(shù)中要把握幾種常用顯微鏡成像的根本原理,一般雙筒顯微鏡、熒光顯微鏡、相差顯微鏡、暗視野顯微鏡、倒置顯微鏡。把握電子顯微鏡的原理和樣品制備方法，以及和光學(xué)顯微鏡的差異．２.把握酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、細(xì)胞分選技３.了解細(xì)胞培育和細(xì)胞融合、細(xì)胞生物反響器、染色體轉(zhuǎn)移、細(xì)胞器移植、基因轉(zhuǎn)移、細(xì)胞及組織培育4.離心分別技術(shù)這一章每年都有真題消滅，大局部以填空，選擇和推斷的越來(lái)越看重，07、08年就近30分的考題一、顯微成像技術(shù)1.構(gòu)成：

〔一〕一般光學(xué)顯微鏡

3.區(qū)分力：指區(qū)分物體最小間隔的力量。R=0.61λ/N．A．①照明系統(tǒng)②光學(xué)放大系統(tǒng)③機(jī)械裝置2.原理：經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像，經(jīng)目鏡放大成虛像。2〔1〕一般雙筒顯微鏡 有較強(qiáng)的立體感。〔2〕熒光顯微鏡：爭(zhēng)論細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸取、運(yùn)輸、及化學(xué)物質(zhì)的分布及定位以紫外為光源?！?〕相差顯微鏡，觀看無(wú)色、透亮、活細(xì)胞中的〔未經(jīng)染色的活細(xì)胞〕產(chǎn)生明暗差異〔4〕暗視野顯微鏡：觀看未經(jīng)染色的活體或膠體粒子適合觀看細(xì)胞核、線粒體、細(xì)菌、霉菌等?！?〕倒置顯微鏡培育細(xì)胞觀看03年選擇題

其中λ為入射光線波長(zhǎng)；N．A．為鏡口率＝ｎsinα/2；n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角〔樣品對(duì)物鏡鏡口的張角〕倒置顯微鏡inversemicroscope物鏡與照明系統(tǒng)顛倒；用于觀看培育的活細(xì)胞，通常具有相差或物鏡，有的還具有熒光裝置。133.1樣品的固定(fixation)：醛類3.2包埋和切片(embeddingandsectioning)切0um3.3染色(staining):有機(jī)染料3.4放射自顯影技術(shù)原理以電子束作光源，電磁場(chǎng)作透鏡。電子束波長(zhǎng)與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比；由

4由三大局部組成∶電子光學(xué)系統(tǒng)(鏡筒)、真空系統(tǒng)、電子學(xué)系統(tǒng)(供電系統(tǒng))。觀看的是亞顯微構(gòu)造電子顯微鏡的樣品也需固定、包埋、切片〔超薄切片，切片放在載網(wǎng)上〕、染色等。負(fù)染色：只染背景不染樣品透射電子顯微鏡，掃描電子顯微鏡TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE ，TEM電辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬(wàn)倍；用于觀看超微構(gòu)造〔小于0.2μm〕。照明系統(tǒng)透鏡成像超薄切片系

制樣技術(shù)統(tǒng)切片厚度僅50nm左右，用超薄切片機(jī)真通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級(jí)脫水，空環(huán)氧包52負(fù)染技術(shù)

freeze-etching電鏡觀看需要有足夠的反差。用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色；吸去染料枯燥樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而消滅負(fù)染效果，區(qū)分力可達(dá)1.5nm左右。斷面的三種處理方法：蝕刻〔

aineArchaebact

亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫掉，把鉑和碳的膜剝下來(lái)，此膜即為復(fù)膜〔replica〕。培育細(xì)胞內(nèi)面的深度蝕刻電鏡照片，示Clathrin衣被etchin tipcellwith etching.g蝕刻〔 〔二〕掃描電子顯微鏡n世紀(jì)60年月問(wèn)世，用來(lái)觀看標(biāo)本外表構(gòu)造；e辨力為6~10nm，因人眼的區(qū)分力〔區(qū)分熒光屏

Scanningelectronmicroscope〔SEM〕t〕為0.2mm，掃描電鏡的hi效放大倍率為0.2mm/10nm=20230X。ng3工作原理：是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品外表度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。為了使標(biāo)本外表放射出次級(jí)電子，標(biāo)本在固定、脫水后，子信號(hào)。光學(xué)和電子顯微鏡成像原理照明系統(tǒng)的波長(zhǎng)是顯微鏡成像的一個(gè)重要因素，由于波長(zhǎng)打算能被檢測(cè)樣品的最小極限電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的根本區(qū)分lwyotysbaicstutue

〔三〕激光共聚焦掃描顯微境Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描；能顯示細(xì)胞樣品的立體構(gòu)造；區(qū)分力是一般光學(xué)顯微鏡的3倍；用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。1┌────酶的細(xì)胞化學(xué)反響─────┐│酶+條件初級(jí) 捕獲劑 │反響產(chǎn)物──→最終反響產(chǎn)物〔酶反響〕 〔捕獲反響〕2〔免疫熒光技術(shù)和免疫電〕3細(xì)胞的分選染色體的分選1細(xì)10分〕B

為了將培育中的單層表皮細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸浮液，通常要單細(xì)胞懸液

EDTA或EGTA，以胰蛋白酶，請(qǐng)問(wèn)添加這些試劑作用是什么？〔5分〕*代培育〔二者區(qū)分？？〕*2clineadcltan)7.3動(dòng)物細(xì)胞培育方法7貼壁培育培浮培育tissueculture)〔〕真題再現(xiàn)2023年用流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞和染色體，從生物學(xué)角度來(lái)看，應(yīng)當(dāng)留意的三個(gè)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)(比較難).5植物原生質(zhì)體培育pripmary養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的 4分〕2、細(xì)胞融合與單克隆抗體技術(shù)2.1細(xì)胞融合(cellfusion)滅活的仙臺(tái)病毒：促進(jìn)融合的緣由聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)：促進(jìn)融合的緣由2.3顯微操作術(shù)細(xì)胞核移植、基因注入、染色體微切和胚胎切割等手術(shù)一、離心技術(shù)是分別細(xì)胞器及各種大分子根本手段。轉(zhuǎn)速10~25kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。轉(zhuǎn)速>25kr/min，離心力>89Kg者稱為超速離心機(jī)。超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100000r/min，離心力超過(guò)500kg。

2.2單克隆抗體技術(shù)(monoclonalantibodytechnique)篩選用的HAT培育基是選擇性培育基在HAT培育基中，只有腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞才能生存，而未融合的腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞及非腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞融合形成的細(xì)胞都會(huì)死亡單個(gè)細(xì)胞融合方法：有限稀釋法1速度離心和等密度離心1.1速度離心分別細(xì)胞器和大分子差速離心移動(dòng)區(qū)帶離心1.2等密度離心蔗糖、甘油和氯化銫都是密度離心分別中的介質(zhì)〔一〕Differentialcentrifugation特點(diǎn)：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級(jí)離心。用途：分別大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降將細(xì)胞器初步分別，常需進(jìn)一步通過(guò)密度梯離心再行分順純化。序：核5Differentialcentrifugation HighspeedLowspeed〔三〕密度梯度離心用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)離心力場(chǎng)的作用使和細(xì)胞成分分層、分別。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分別活細(xì)胞的介質(zhì)要求：1〕能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；2〕PH中性或易調(diào)為中性；3〕濃度大時(shí)滲透壓不大；4〕對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。2.等密度沉降isopycnicsedimentation用途：分別密度不等的顆粒。特點(diǎn)：介質(zhì)密度高，陡度大，介質(zhì)最高密度大于被分別組分的最大密度。力場(chǎng)比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速離心。原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過(guò)肯定時(shí)間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里到達(dá)平衡，從而將不同密度的成分分別。

常用的是蔗糖密度梯度離心1.velocitysedimentation用途：分別密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分別生物顆粒的最小密度。原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分別物按各自的沉降系以不同的速度沉降而到達(dá)分別。介質(zhì)蔗糖，甘油〔1.3g/cm3〕氯化銫(大于1.3g/cm3) 浮力密度離心6Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation1、基因工程技術(shù)：分，切，連，轉(zhuǎn)，選〔基因克隆〕2PCR技術(shù)polymerasechainreactionPCR即：polymerasechainreaction。DN；②引物〔prir〕，約1-20個(gè)核苷酸；③4；DNA聚合酶，來(lái)自于嗜熱水生菌Theusaquacs，最適作用溫度75~80℃，短時(shí)間在95℃下不失活。⑤緩沖體系和Mg2+。反響過(guò)程：①變性：約90-95℃；②復(fù)性：約60℃左右；③延長(zhǎng)：70-75℃；④重復(fù)“變性——復(fù)性——延長(zhǎng)”過(guò)程20-30次