實(shí)驗(yàn)五-離子交換柱層析法分離氨基酸課件

目的要求（1）學(xué)習(xí)采用離子交換樹(shù)脂分離氨基酸的基本原理。（2）掌握離子交換柱層析法的基本操作技術(shù)。目的要求1一、原理

離子交換層析是用離子交換劑（具有離子交換性能的物質(zhì)）作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來(lái)分離離子型化合物的層析方法。?

即溶液中的離子同離子交換劑上功能基團(tuán)交換反應(yīng)的過(guò)程。一、原理

離子交換層析是用離子交換劑（具有離子交換性能的物質(zhì)2實(shí)驗(yàn)五-離子交換柱層析法分離氨基酸課件3實(shí)驗(yàn)五-離子交換柱層析法分離氨基酸課件4

帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來(lái)，帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來(lái)。帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來(lái)，帶電5離子交換過(guò)程示意：起始吸附解吸完成

x+:起始緩沖離子

y+：待分離離子

z+：待分離離子

離子交換過(guò)程示意：6二、離子交換劑的種類(lèi)

在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即離子交換劑。（一）按活性功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同陽(yáng)離子交換劑—帶負(fù)電荷，與陽(yáng)離子交換陰離子交換劑

—帶正電荷，與陰離子交換二、離子交換劑的種類(lèi)

在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即7（二）按載體種類(lèi)不同1.離子交換樹(shù)脂：主要有聚苯乙烯樹(shù)脂苯乙烯+二乙烯苯

聚苯乙烯（單體）（交聯(lián)劑）二乙烯苯交聯(lián)度

=————————×100%

苯乙烯+二乙烯苯（二）按載體種類(lèi)不同8交聯(lián)度大，網(wǎng)孔變小，大分子量的離子不能進(jìn)入樹(shù)脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換。在不影響分離的情況下，以采用交聯(lián)度較高的樹(shù)脂為好，這樣可以提高樹(shù)脂對(duì)離子的選擇性。交聯(lián)度大，網(wǎng)孔變小，大分子量的離子不能進(jìn)入樹(shù)脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子9目數(shù)：離子交換樹(shù)脂的顆粒直徑大小Dowex50為20-50目Dowex20840m50297m100149m

（代表二乙烯苯的百分含量）目數(shù)：離子交換樹(shù)脂的顆粒直徑大小10樹(shù)脂resin（據(jù)所含交換基團(tuán)的性質(zhì)分）陽(yáng)離子交換樹(shù)脂

強(qiáng)酸型含磺酸基團(tuán)(R-SO3H)

中等酸型含磷酸基團(tuán)(-O-PO2H4)

弱酸型含酚基、羧基陰離子交換樹(shù)脂

強(qiáng)堿含季胺基團(tuán)[-N+(CH3)3]

弱堿含叔胺、伯胺基團(tuán)[-N(CH3)2

陰離子交換樹(shù)脂對(duì)化學(xué)試劑及熱都不如陽(yáng)離子交換樹(shù)脂穩(wěn)定。

樹(shù)脂resin（據(jù)所含交換基團(tuán)的性質(zhì)分）112.離子交換纖維素陰離子交換纖維素—如:DEAE-纖維素pH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì),具二乙胺乙基陽(yáng)離子交換纖維素—如:CM-纖維素一般pH>4條件下使用,具有羧甲基2.離子交換纖維素123.離子交換凝膠—分離大分子物質(zhì)如：葡聚糖（Sephadex）、聚丙烯酰胺（PAG）、瓊脂糖（Sepharose）3.離子交換凝膠—分離大分子物質(zhì)13三、操作注意點(diǎn)

（一）離子交換劑的選擇原則：根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇—同一性質(zhì)離子交換劑中選用對(duì)被分離物質(zhì)各組分之間結(jié)合力差異大的型號(hào)交換劑，以保證通過(guò)離子交換層析后能得到比較滿意的結(jié)果。三、操作注意點(diǎn)

（一）離子交換劑的選擇14考慮因素：1.被分離物質(zhì)帶何種電荷2.被分離物質(zhì)分子的大小大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素3.被分離物質(zhì)所處的環(huán)境4.被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)5.被分離物質(zhì)的大概數(shù)量考慮因素：15根據(jù)分離過(guò)程的實(shí)驗(yàn)條件強(qiáng)酸強(qiáng)堿—應(yīng)用廣泛弱酸型—只能在堿性pH范圍內(nèi)使用弱堿型—只能在酸性pH范圍內(nèi)使用根據(jù)分離過(guò)程的實(shí)驗(yàn)條件16（二）緩沖液的選擇原則：不能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，所帶電荷應(yīng)與樣品一致。避免使樣品變性（二）緩沖液的選擇17(三)洗脫劑

原則：所用洗脫液比吸著物質(zhì)具有更活潑的離子或基團(tuán)改變pH或離子強(qiáng)度增強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力降低分離物與離子交換劑的結(jié)合力洗脫方式：梯度洗脫(三)洗脫劑18四、應(yīng)用

分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的生物分子四、應(yīng)用

分離多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他帶電的生物分子19離子交換層析法分離氨基酸及測(cè)定

離子交換層析法分離氨基酸及測(cè)定20[原理]

所用樣品為天冬氨酸和賴氨酸的混合液，分別屬酸性氨基酸(pI2.77)、堿性氨基酸(pI9.74)，在緩沖溶液中分別帶正電荷和負(fù)電荷，與強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂Dowex50親和力有很大不同，在一定的洗脫條件下洗脫，將它們分離。利用氨基酸可與茚三酮反應(yīng)生成有色化合物進(jìn)行氨基酸鑒定。[原理]所用樣品為天冬氨酸和賴氨酸的混合液，分21紫色物質(zhì)，用于α－氨基酸的比色測(cè)定和紙層析顯色與水含茚三酮的反應(yīng)：紫色物質(zhì)，用于α－氨基酸的比色測(cè)定和紙層析顯色與水含茚三酮的22

AspLyspH4.2pH>10Asp23[器材]

1.

層析柱等2.

沸水浴[器材]1.

層析柱等24[試劑]

Dowex502mol/LNaOHpH5.3檸檬酸緩沖液樣品液：氨基酸混合液茚三酮混合液[試劑]Dowex5025實(shí)驗(yàn)步驟1．樹(shù)脂的處理將干的強(qiáng)酸型樹(shù)脂用蒸餾水浸泡過(guò)夜，使之充分溶脹。用4倍體積的2mol/L的鹽酸浸泡1小時(shí)，傾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氫氧化鈉處理，做法同上。最后用欲使用的緩沖液浸泡。2．裝柱取直徑1cm,長(zhǎng)度10－12cm的層析柱。將柱垂直至于鐵架上。自頂部注入上述經(jīng)處理的樹(shù)脂懸浮液，關(guān)閉層析柱出口，待樹(shù)脂沉降后，放出過(guò)量溶液，再加入一些樹(shù)脂，至樹(shù)脂沉降至8~10cm的高度即可。裝柱要求連續(xù)、均勻，無(wú)紋格、無(wú)氣泡，表面平整。液面不低于樹(shù)脂。實(shí)驗(yàn)步驟26

3．平衡將緩沖液瓶與恒流泵相連，恒流泵出口與層析柱入口相連，樹(shù)脂表面保留3－4cm液層，開(kāi)動(dòng)衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH與洗脫液相同。

4.加樣揭去層析柱上口蓋子，待柱內(nèi)液面至樹(shù)脂表面1－2mm關(guān)閉出口，沿管壁四周小心加入0.5ml樣品，慢慢打開(kāi)出口，同時(shí)開(kāi)始收集流出液。當(dāng)樣品液彎月面靠近樹(shù)脂頂端時(shí)，即刻加入少量檸檬酸緩沖液沖洗加樣品處數(shù)次，然后注入檸檬酸緩沖液至液面高3－4cm左右，接恒流泵。

5.洗脫以緩沖液洗脫，開(kāi)始用試管收集洗脫液，每管收集1mL，共收集60—80管。3．平衡27

6．洗脫及氨基酸的鑒定

向各管收集液中加1mL水合茚三酮顯色劑并混勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5min后冷卻至室溫，再加入3mL的0.1%硫酸銅溶液?；靹?，以收集液第2管為空白，測(cè)定A570波長(zhǎng)的光吸收值，以光吸收值為縱坐標(biāo)，以洗脫液體積為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。6．洗脫及氨基酸的鑒定28實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)氨基酸的解離性質(zhì)，分析該實(shí)驗(yàn)條件下氨基酸從層析柱洗脫下來(lái)的順序。實(shí)驗(yàn)結(jié)果29Separationofaminoacidsonacati