基因突變重組與檢測技術(shù)課件

基因突變重組與檢測技術(shù)

衛(wèi)生部北京醫(yī)院肖飛臨床基因擴增實驗室檢測培訓課程基因突變重組臨床基因擴增實驗室檢測培訓課程內(nèi)容介紹二、基因重組技術(shù)三、基因突變的檢測方法1.分子雜交技術(shù)3.高通量基因測序技術(shù)一、基因突變的產(chǎn)生與后果2.基因測序技術(shù)內(nèi)容介紹二、基因重組技術(shù)三、基因突變的檢測方法1.分子雜交遺傳中心法則回顧轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄DNARNA蛋白質(zhì)復制遺傳中心法則回顧轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄DNARNA蛋白質(zhì)復制第一節(jié)基因突變的產(chǎn)生與后果點突變基因缺失插入基因異位或重排表觀遺傳學基因突變的種類第一節(jié)基因突變的產(chǎn)生與后果點突變基DNA分子中發(fā)生堿基對的替換、增添和缺失，而引起的基因序列的改變一、基因突變的定義┯┯┯┯

ＡＴＧＣ

ＴＡＣＧ

┷┷┷┷┯┯┯┯┯

ＡＴＡＧＣ

ＴＡＴＣＧ

┷┷┷┷┷┯┯┯┯

ＡＴＧＣ

ＴＡＣＧ

┷┷┷┷┯┯┯

ＡＧＣ

ＴＣＧ

┷┷┷┯┯┯┯

ＡＣＧＣ

ＴＧＣＧ

┷┷┷┷┯┯┯┯

ＡＴＧＣ

ＴＡＣＧ

┷┷┷┷增添缺失替換DNA分子中發(fā)生堿基對的替換、增添和一、基因突變的定義基因突變的原因和類型外界因素物理因素化學因素生物因素內(nèi)部因素DNA修復功能減弱類型原因自然突變?nèi)斯ふT變基因突變的原因和類型外界因素物理因素化學因素生物因素內(nèi)部因素基因突變的特點和意義意義：新基因產(chǎn)生的途徑，是生物變異的根本來源，是生物進化的途徑。特點普遍性:生物界中普遍存在隨機性:可發(fā)生在生物個體發(fā)育任何時期不定向性：突變無明顯偏倚低頻性:自然狀態(tài)下突變頻率很低10－5-10-8多害少利性：多數(shù)有害,少數(shù)有利基因突變的特點和意義意義：新基因產(chǎn)生的途徑，是生物變異的根本點突變的實例：鐮刀型細胞貧血癥的形成病人的血紅蛋白的一條多肽鏈發(fā)生了什么變化？…－脯氨酸－谷氨酸－谷氨酸—……－脯氨酸－纈氨酸－谷氨酸—…正常異常點突變的實例：病人的血紅蛋白的一條多肽鏈發(fā)生了什么變化？…－CTTGAA谷氨酸纈氨酸DNAmRNA氨基酸蛋白質(zhì)正常異常GUACATGTA突變GAA_____原因_____原因根本直接點突變的實例：鐮刀型細胞貧血癥CTTGAA谷氨酸纈氨酸DNAmRNA氨基酸蛋白質(zhì)正常異常G與腫瘤相關(guān)的常見點突變類型基因生長因子Sis,α-TGF,生長因子受體Erb(EGFR),HER2/neu,細胞信號傳導因子H-,K-,N-ras,src,raf,轉(zhuǎn)錄因子N-,c-,L-myc,c-jun,fos細胞周期因子PRAD1(cyclinD)凋亡相關(guān)基因bcl-2,bcl-X與腫瘤相關(guān)的常見點突變類型基因生長因子Sis,α-TGF,腫瘤突變—取樣的特殊性注意事項：必須從腫瘤組織中取樣SampleSelectionbyLaserCaptureMicrodissection腫瘤突變—取樣的特殊性注意事項：必須從腫瘤組織中取樣Samp基因缺失基因缺失可以是1-2個堿基，也可以是一個片段甚或一個外顯子的缺失。基因片段的缺失可使該基因激活，轉(zhuǎn)錄異常，使基因正常的生物學功能喪失。在腫瘤發(fā)生中，多為抑癌基因的缺失。常見的抑癌基因缺失包括：RB-theretinoblastomagenp53genep16-INK4a基因缺失基因缺失可以是1-2個堿基，也可以是一個片段甚或一個基因插入基因插入多由病毒感染造成。病毒腫瘤人類T-淋巴細胞白血病病毒I型白血病人類巨細胞病毒（CMV）血液系統(tǒng)惡性腫瘤嗜肝DNA病毒肝癌人類乳頭狀瘤病毒（HPV）宮頸癌EB病毒（EBV）鼻咽癌基因插入基因插入多由病毒感染造成。病毒腫瘤人類T基因異位與重排指細胞基因組中DNA順序重新排列組合的現(xiàn)象

淋巴細胞白血病

t(9;22):BCR-ABL t(12;21):TEL-AML1 t(1;19):E2A-PBX1 t(4;11):MLL-AF4

髓細胞白血病

Inv(16):CBF-MYH11 t(8;22):AML-ETO t(9;22):BCR-ABL5'partnerClass3'partnerTMPRSS2IERGTMPRSS2IETV1TMPRSS2IETV4HERV-K_22q11.23IIETV1SLC45A3IIETV1C15orf21IIIETV1HNRPA2B1IVETV1KLK2IIETV4CANT1IIETV4ACSL3IIETV1SLC45A3IIERGFLJ35294IIETV1DDX5IVETV1TMPRSS2IETV5SLC45A3IIETV5EST14IIETV1HERVK17IIETV1ETV家族常見融合基因基因異位與重排指細胞基因組中DNA順序重新排列組合的現(xiàn)象 淋表觀遺傳學1.概念：基因的DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達水平與功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可遺傳的表型。2.特征:(1)可遺傳；(2)可逆性；(3)DNA不變3.表觀遺傳學的現(xiàn)象：(1)DNA甲基化(2)組蛋白修飾(3)MicroRNA(4)Genomicimprinting(5)端粒酶表觀遺傳學1.概念：基因的DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基表觀遺傳學——甲基化表觀遺傳學——甲基化表觀遺傳學——組蛋白修飾組蛋白（去）乙?；疍e/Acetylation組蛋白甲基化Methylation組蛋白磷酸化Phosphorylation組蛋白泛素化Ubiquitination組蛋白糖基化ADP-Rybosilation組蛋白與Swi/Snf復合體的結(jié)合Swi/Snfcomplex,which,invitro,usestheenergyofATPhydrolysistodisrupthistone-DNAinteractions多數(shù)化學修飾的化學基團可以減少組蛋白的正電性，從而使其與DNA結(jié)合變疏松，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。表觀遺傳學——組蛋白修飾組蛋白（去）乙?；疍e/Acety表觀遺傳學——microRNA細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄后長片段的miRNA（Pri-miRNA)Drosha酶處理70－100個nt的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA（pre-miRNA）運輸?shù)桨|(zhì)Dicer剪切19－23個nt組成的成熟的miRNA結(jié)合到由RNA介導的RISC或類似相同的復合物中，參與RNA干擾，由miRNA和靶基因mRNA的堿基配對引導RISC降解目的片段或是阻礙其翻譯過程表觀遺傳學——microRNA細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄后長片段的miRN表觀遺傳學——microRNA50％的miRNAs位于或靠近腫瘤中易發(fā)生改變的染色體區(qū)域內(nèi).常見的斷裂位點，靠近或在可能的癌基因或抑癌基因范圍內(nèi)最小擴增區(qū)域，可能包含癌基因最小雜合子缺失區(qū)域，通常認為抑癌基因定位在這些區(qū)域中脆性位點（FRA),FRA是容易發(fā)生姐妹染色質(zhì)交換，易位，缺失，擴增的位點，或者質(zhì)粒DNA和腫瘤相關(guān)病毒易插入位點表觀遺傳學——microRNA50％的miRNAs位于或靠近第二節(jié)基因重組技術(shù)

整合基因重組轉(zhuǎn)化（自然）轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)座

質(zhì)?；蚬こ藼AC（人工）YAC

基因重組第二節(jié)基因重組技術(shù)基因重組基因重組—整合整合：

噬菌體感染大腸桿菌的第一步噬菌體粘附于細胞壁上，將自身的DNA注入菌體中。此

DNA可與細菌染色體重組，成為細菌染色體的一部分。溶原菌：整合了噬菌體基因組的細菌。裂解：噬菌體感染大腸桿菌的第二步

DNA利用菌體的酶系統(tǒng)，復制自身及外殼蛋白，組裝成大量新噬菌體，并將細菌漲破?；蛑亟M—整合整合：噬菌體感染大腸桿菌的第一步基因重組—轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：由外來DNA引起生物類型改變的過程稱為轉(zhuǎn)化。細菌的轉(zhuǎn)化基因重組—轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：由外來DNA引起生物類型改變的過程稱為基因重組—轉(zhuǎn)化病毒癌基因感染宿主細胞后，可整合到宿主染色體上，從而使宿主細胞癌變。轉(zhuǎn)染：噬菌體感染宿主菌后，核酸進入菌體內(nèi)的過程?；蛑亟M—轉(zhuǎn)化病毒癌基因感染宿主細胞后，可整合到宿主染色體上基因重組—轉(zhuǎn)導溶原菌中

DNA可以原樣地切離出來，也可以把鄰近的宿主DNA在切離時帶走一部分。后者稱轉(zhuǎn)導。帶有宿主DNA的噬菌體稱轉(zhuǎn)導噬菌體。來源于宿主的基因稱轉(zhuǎn)導基因?；蛑亟M—轉(zhuǎn)導溶原菌中DNA可以原樣地切離出來，也可以把基因重組—轉(zhuǎn)位轉(zhuǎn)位：一個或一組基因從一處轉(zhuǎn)到基因組的另一個位置。這些游動的基因稱為轉(zhuǎn)位子(transposon)?；蛑亟M—轉(zhuǎn)位轉(zhuǎn)位：一個或一組基因從一處轉(zhuǎn)到基因組的另一個位基因工程技術(shù)酶目的基因載體基因宿主基本要素基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學?；蚬こ碳夹g(shù)酶基本要素基因質(zhì)粒

(plasmid)特點能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。質(zhì)粒(plasmid)特點克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體。載體克隆載體(cloningvector)載體目的基因1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

（見第22章）目的基因1.化學合成法重組DNA技術(shù)中常用的工具酶-限制性核酸內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ重組DNA技術(shù)中常用的工具酶-限制性核酸內(nèi)切酶定義GGATC第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；命名HindⅢⅡ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGⅡ類酶識別序列特點——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)BamHⅠGATCTAGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGEcoRVGATATCCTATAGATCTAG+平端切口粘端切口BamHⅠGATGGATCC+GGATCCEcoRVGAT不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源大腸桿菌表達系統(tǒng)酵母表達系統(tǒng)哺乳細胞表達系統(tǒng)幾種不同的蛋白表達系統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng)酵母哺乳細胞表達系統(tǒng)幾種不同的蛋白表達系統(tǒng)

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成促紅細胞生成素剌激白細胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(

1b,

2a,

2b,

)抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂目錄重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他酵母人工染色體其他人工染色體染色體要確保在細胞分裂中保持穩(wěn)定，必須要能夠自我復制和向子細胞中平均分配。它需要3個關(guān)鍵序列，包括自主復制DNA序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）著絲粒DNA序列（centromereDNAsequence，CEN)端粒DNA序列（telomereDNAsequence,TEL）人工染色體染色體要確保在細胞分裂中保持穩(wěn)定，必須要能夠自我復人工染色體

將3個關(guān)鍵序列用分子生物學方法拼接起來就得到人造微小染色體（artificialminichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因組分析、基因功能鑒定、基因治療以及研究染色體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等研究中得到了廣泛的應(yīng)用，具有極為重要的價值。目前，正在研究或應(yīng)用的有：酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）哺乳動物人工染色體(mammalianartificialchromosome)。人工染色體將3個關(guān)鍵序列用分子生物學方法拼接起來就酵母人工染色體(YeastArtificialChromosome,YAC)酵母人工染色體(YeastArtificialChrom第三節(jié)基因突變的檢測方法分子雜交技術(shù)FISHSouthernblotNorthernblot芯片雜交3.高通量基因測序技術(shù)2.基因測序技術(shù)化學降解測序Sanger測序第三節(jié)基因突變的檢測方法分子雜交技術(shù)3.前列腺癌細胞中TMPRSS2-ERG融合基因檢測（FISH法）熒光原位雜交（FISH）前列腺癌細胞中TMPRSS2-ERG融合基因檢測（FISHSouthern和Northernblot原理和應(yīng)用Southern和Northernblot原理和應(yīng)用Southern和Northernblot原理和應(yīng)用Southern和Northernblot原理和應(yīng)用基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理Geneprobes（cDNA、DNA）substrate

Ready-to-usemicroarrayOligoprobesAGCTorarrayer基因芯片原理GeneprobessubstrateR基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理基因芯片原理基因測序技術(shù)簡介他們給DNA的測序帶來了一場革命，分享了1980年的諾貝爾化學獎。后來Sanger法發(fā)展為自動化測序法，并為人類基因組測序做出了卓越貢獻。FredSanger

發(fā)明的末端合成終止法(sanger法)WalterGilbert發(fā)明的化學裂解法

Maxam-Gillbert法基因測序技術(shù)簡介他們給DNA的測序帶來了一場革Maxam-Gilbert化學裂解法一個末端標記的DNA片段在幾組互相獨立的的化學反應(yīng)分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對某一種或某一類堿基。因此生成一系列放射性標記的分子，從共同起點（放射性標記末端）延續(xù)到發(fā)生化學降解的位點。每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原DNA全片段上的位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標記的分子。Maxam-Gilbert化學裂解法一個末端標記的DNA片段基因測序技術(shù)簡介G反應(yīng)：DMS使G在中性和高溫條件下脫落。G+A反應(yīng)：酸性條件（如甲酸）可使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，利用哌啶使A、G脫落。T+C反應(yīng)：肼（低鹽）C反應(yīng)：肼（高鹽）測定DNA長度~250bp。堿基特異性化學切割反應(yīng)：硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中鳥嘌呤（G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶環(huán)斷裂；但高鹽條件下，只C斷裂，而不與T反應(yīng)。哌啶：從修飾甲基處斷裂核苷酸鏈。在不同的酸、堿、高鹽和低鹽條件下，三種化學試劑按不同組合可以特異地切割核苷酸序列中特定的堿基?；驕y序技術(shù)簡介G反應(yīng)：DMS使G在中性和高溫條Maxam-Gilbert化學裂解法Maxam-Gilbert化學裂解法末端合成終止法(sanger法)原理2‘,3’-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）與普通dNTP不同之處在于其脫氧核糖的3‘位置少一個羥基，可在DNA聚合酶作用下通過其5'三磷酸基團摻入到正在增長的DNA鏈中，但ddNTP因缺乏3‘羥基而不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，當正在增長的DNA鏈末端堿基為ddNTP時，則鏈延伸反應(yīng)終止，不可能繼續(xù)延伸。這樣，在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP后，鏈延伸將與偶然發(fā)生卻十分特異的鏈終止展開競爭，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于從用以起始DNA合成引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止的位置之間的距離，結(jié)果將產(chǎn)生4類寡核苷酸，它們分別終止于模板鏈的每一個A、C、G或T的位置上。末端合成終止法(sanger法)原理2‘,3’-雙脫氧核苷末端合成終止法(sanger法)原理雙脫氧鏈終止法的測序基礎(chǔ)是以雙脫氧苷三磷酸為循環(huán)測序反應(yīng)的鏈終止劑。末端合成終止法(sanger法)原理雙脫氧鏈終止法的測序基末端合成終止法(sanger法)原理POHdNTPddNT