海洋酵母菌胞外酶的生產(chǎn)、純酶性質(zhì)及基因克隆

海洋酵母菌胞外酶的生產(chǎn)、純酶性質(zhì)及基因克隆

海洋中的植物通常被認(rèn)為是指能夠在水中生存時(shí)間長(zhǎng)的遺傳因子。作者認(rèn)為，與在淡水培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)相比，海床上的細(xì)菌生長(zhǎng)更好，不受影響。作者認(rèn)為，與在海環(huán)境中的細(xì)菌生長(zhǎng)相比，這些培養(yǎng)菌在海床上的生長(zhǎng)是不受影響的。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)絕對(duì)依賴鈉祖母的鞭毛。陸地酵母細(xì)胞可以合成多種生物活性物質(zhì),如蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、多糖、脂肪酸、磷脂、多聚胺、有機(jī)酸、蝦青素、海藻糖、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、幾丁質(zhì)酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等,多年來一直受到廣泛關(guān)注,僅在上個(gè)世紀(jì),啤酒和葡萄酒工業(yè)每年可以創(chuàng)造100多億美元的收入,給世界各國創(chuàng)造了數(shù)以萬計(jì)的就業(yè)機(jī)會(huì)。海洋藻類,海洋絲狀真菌和海洋細(xì)菌多年來一直受到很大的重視,并得到了廣泛的研究和開發(fā)應(yīng)用,而對(duì)海洋酵母菌資源和它們產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)至今了解的非常少。海洋占了整個(gè)地球面積的70%,海洋擁有豐富的生物資源,包括酵母菌和酵母菌基因資源1普魯蘭類酵母h2-3和h2-3蛋白酶在洗滌劑工業(yè)、皮革工業(yè)、銀回收、醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、飼料工業(yè)、化學(xué)工業(yè)和廢水處理等方面有重要的用途本實(shí)驗(yàn)室在海洋高鹽環(huán)境中分離到了許多可以產(chǎn)生蛋白酶的酵母菌由于陸地普魯蘭類酵母生產(chǎn)的普魯藍(lán)多糖已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在食品、化妝品和醫(yī)藥工業(yè)中,說明這種酵母菌是安全的微生物利用簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)方法、反向PCR和RT-PCR等方法得到了普魯蘭類酵母(經(jīng)過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)另外1株海洋酵母普魯蘭類酵母菌HN2-3菌株產(chǎn)生的純堿性蛋白酶水解毛蝦蛋白產(chǎn)生的短肽ACE抑制活力還要高,可達(dá)88.3%,而從南極海水中分離的海洋普魯蘭類酵母菌株N13d產(chǎn)生的純堿性蛋白酶水解螺旋藻蛋白產(chǎn)生的短肽抗氧化活力最大,為82.8%。但是很遺憾的是所有這些活性肽都沒有抗微生物活性。2白酶抑制劑酶活劑酸性蛋白酶通常被認(rèn)為是一類天冬氨?；鞍酌?包括胃蛋白酶、凝乳酶、腎素、組織蛋白酶D、以及一些微生物產(chǎn)生的酸性蛋白酶,如天冬氨酸蛋白酶和青霉蛋白酶,這類蛋白酶通常在酸性pH=3~4之間活性最高,并廣泛存在于各種微生物中,包括胞內(nèi)酶和胞外酶2種形式。酸性蛋白酶通常含有2個(gè)疏水的保守區(qū),以胃蛋白酶為例,就包括N端的Asp32-Thr-Gly-Ser序列,以及C端的Asp215-Thr-Gly-Ser/Thr序列,這2個(gè)保守區(qū)都具有活性中心天冬氨?；稽c(diǎn)(Asp32和Asp215)通過篩選,本實(shí)驗(yàn)得到了1株具有酸性蛋白酶活性的海洋酵母菌,經(jīng)鑒定為梅奇酵母(3海洋酵母菌種庫菊糖是果糖由菊糖酶(Inulinase)是能夠水解通過篩選發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)室海洋酵母菌種庫中存在4株在海水或人工海水配制的培養(yǎng)基中可以產(chǎn)生大量菊糖酶的海洋酵母菌,它們分別是季也蒙畢赤酵母(另外,利用簡(jiǎn)并引物PCR技術(shù)作者已經(jīng)克隆到了編碼季也蒙畢赤酵母(4海洋酵母菌的篩選纖維素是由葡萄糖通過纖維素酶可以作為洗滌劑的添加劑和轉(zhuǎn)化纖維素生產(chǎn)葡萄糖,纖維素酶和酒精酵母菌共同作用于纖維素可以生產(chǎn)燃料酒精,可以產(chǎn)生纖維素酶的酵母菌可以用于轉(zhuǎn)化秸稈中得纖維素生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白通過對(duì)300多株海洋酵母菌進(jìn)行篩選,本實(shí)驗(yàn)得到了活力最高的1株海洋酵母菌普魯蘭類酵母(5淀粉酶酵母菌的大量生產(chǎn)淀粉酶在面包和發(fā)酵工業(yè)、淀粉液化和糖化、紡織工業(yè)、紙張制造業(yè)、洗滌劑業(yè)、醫(yī)藥和臨床化學(xué)分析、食品和藥物工業(yè)中有許多重要用途。由于在世界大部分地區(qū)淀粉價(jià)格低廉、原料來源方便,所以淀粉是大規(guī)模生產(chǎn)酵母菌細(xì)胞的最好原料。由于從環(huán)境得到的大部分酵母菌是安全的,所以最近幾年人們對(duì)淀粉酶的酵母菌產(chǎn)生了很大的興趣,主要目的是利用產(chǎn)淀粉酶酵母菌轉(zhuǎn)化淀粉質(zhì)原料直接生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白和燃料酒精。目前發(fā)現(xiàn)的可以產(chǎn)淀粉酶的陸地酵母菌包括:油脂酵母(本研究通過篩選得到了1株淀粉酶活力最高的普魯蘭類酵母(6脂酶微生物的產(chǎn)生脂酶是指可以催化三?；视退猱a(chǎn)生甘油和游離脂肪酸或催化甘油與長(zhǎng)鏈脂肪酸合成酯的酶。脂酶廣泛存在于自然界中,但是僅僅微生物產(chǎn)生的脂酶具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值,因?yàn)槲⑸锂a(chǎn)生的脂酶產(chǎn)量高,而且功能多樣。脂酶在生產(chǎn)量上是僅次于蛋白酶和糖化酶之后第三大應(yīng)用酶?？梢援a(chǎn)生脂酶的微生物有細(xì)菌、真菌、酵母菌和放線菌。能產(chǎn)生大量脂酶的陸地酵母菌有:褶皺假絲酵母(編碼普魯蘭類酵母(7嗜殺行為的檢測(cè)海洋病原細(xì)菌和病毒引起的海洋養(yǎng)殖動(dòng)物病害最近幾年給海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,除了海洋細(xì)菌和病毒可以引起海洋動(dòng)物疾病外,最近發(fā)現(xiàn)某些海洋酵母菌也可以引起海洋動(dòng)物疾病,并給海水養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失,由于酵母菌是真菌,而真菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能與人類和動(dòng)物的類似,這樣給這些疾病的控制帶來了很多難以解決的問題。如中國海洋大學(xué)ChiZM等人在組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)1種海洋酵母菌克魯維酵母(很多研究表明有很多具有嗜殺能力的酵母菌以及它們的嗜殺因子可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、發(fā)酵、食品和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上,嗜殺因子作用于目標(biāo)時(shí)不需要細(xì)胞之間直接的接觸,酵母菌產(chǎn)生的大量小分子量的蛋白或糖蛋白就會(huì)對(duì)比較敏感的相同或相近種屬的酵母菌細(xì)胞有殺死作用。而這種嗜殺菌自身對(duì)所產(chǎn)嗜殺因子具有免疫力經(jīng)過純化發(fā)現(xiàn)該嗜殺因子的分子量為47.0kDa,最適作用溫度和pH分別為40℃和4.5,在60℃下還相當(dāng)穩(wěn)定,該酶為絲氨酸金屬酶。大部分金屬離子對(duì)奇異畢赤酵母(該奇異畢赤酵母(利用PCR技術(shù)已經(jīng)克隆到編碼該嗜殺因子的基因,整個(gè)ORF由1281個(gè)堿基組成,編碼427個(gè)氨基酸。該蛋白的信號(hào)肽序列與奇異畢赤酵母(8生物酶系統(tǒng)的研究進(jìn)展植酸酶(phytase)可以催化植酸(6-磷酸肌醇)釋放出磷酸鹽,植酸是各種谷物、糧食、豆類和多油種子中主要的含磷化合物,所以植酸酶可以組入到各種商品化家禽、豬和魚類飼料中,以便于分解其中的植酸,釋放出無機(jī)磷酸,從而減少動(dòng)物飼料中無機(jī)磷的添加量,使飼料中的植酸得到分解釋放出磷酸供給動(dòng)物磷的需求,減少向環(huán)境中排放含磷化合物,有利于保護(hù)環(huán)境最近,由于對(duì)海產(chǎn)品的需求量增加,全球的海水養(yǎng)殖業(yè)得到了飛速發(fā)展,但是由于高密度養(yǎng)殖和環(huán)境污染加劇導(dǎo)致環(huán)境中含磷化合物嚴(yán)重污染。因?yàn)楹Ｑ髣?dòng)物腸道中缺少植酸酶微生物易生長(zhǎng)且產(chǎn)酶高的特點(diǎn)使其成為生產(chǎn)植酸酶最經(jīng)濟(jì)的來源,目前生產(chǎn)植酸酶的微生物主要是利用陸地絲狀真菌重組菌株,基因來源主要是曲霉的植酸酶基因作者認(rèn)為應(yīng)用到海水養(yǎng)殖業(yè)飼料中的植酸酶最好是來自于海洋酵母菌。可是目前對(duì)產(chǎn)植酸酶的海洋酵母菌了解得非常少。最近幾年對(duì)實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)植酸酶的酵母菌進(jìn)行了研究,篩選了327株海洋酵母菌,其中有10株表現(xiàn)出了較高的植酸酶活力,它們分別屬于葡萄有孢漢遜酵母(經(jīng)過純化發(fā)現(xiàn)該酶分子量為98.2kDa,最適作用溫度和pH分別為65℃和5.0,該酶在不同pH條件下穩(wěn)定性要比其他酵母菌產(chǎn)生的植酸酶好。金屬離子Mn編碼奧默柯達(dá)酵母(9脂酶作為食品加工技術(shù)表1列出了上述幾種胞外酶純化后的酶大小、酶活力、最適pH和溫度、基本酶學(xué)性質(zhì)和酶基因序列登錄號(hào)。從以上的最新研究成果看來,海洋酵母菌產(chǎn)生的很多胞外酶具有許多獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì),酶活性高,酶活穩(wěn)定,具有非常重要的潛在實(shí)際用途。尤其是纖維素酶、堿性蛋白酶、菊糖酶、脂酶、植酸酶和嗜殺因子。如其中的脂酶在科研方面可以作為水解、合成、分析、生物轉(zhuǎn)化和親和層析的研究工具,在工業(yè)生產(chǎn)方面可以用于催化酯類的合成、用于釀造