體內(nèi)藥物分析-生物樣品的預(yù)處理的目的與方法（藥物分析課件）

三、生物樣品的預(yù)處理與制備技術(shù)

生物樣品的預(yù)處理大致分為以下五類

1．有機(jī)破壞法

2．去除蛋白法

3．溶劑萃取法

4．綴合物的水解

5．化學(xué)衍生化法（一）有機(jī)破壞法

應(yīng)用——微量元素測(cè)定

方法

1．濕法破壞

2．干法破壞

3．氧瓶燃燒法返回毛發(fā)樣品的制備

三、預(yù)處理與制備第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理1.濕法破壞

常用試劑—硝酸或硝酸-高氯酸

特點(diǎn)—破壞能力強(qiáng)、反應(yīng)激烈，無(wú)機(jī)金屬離子為高價(jià)態(tài)

應(yīng)用—適用于血、尿、組織等生物樣品的破壞

缺點(diǎn)—含氮雜環(huán)藥物的破壞不夠完全

注意—切勿蒸干、以免爆炸

樣品用量—金屬元素量10~100

g，血樣

10~15ml、尿樣50ml返回毛發(fā)樣品的制備第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回毛發(fā)樣品的制備第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理高溫爐高溫破壞應(yīng)用——適合人發(fā)樣品的破壞2.

干法破壞3.氧瓶燃燒（oxygenflaskcombustion）

特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、快速、設(shè)備簡(jiǎn)單 儀器裝置

應(yīng)用：血漿、人發(fā)中鹵素、硫、硒等血漿：血漿1ml分次點(diǎn)于無(wú)灰濾紙上→60℃烘干→按規(guī)定折疊后固定 人發(fā)：洗凈、干燥（60℃~80℃）→剪碎→稱取0.1~0.3g置無(wú)灰濾紙中心→按規(guī)定折疊固定

返回毛發(fā)樣品的制備第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理（二）去除蛋白質(zhì)

非破壞性生物樣品預(yù)處理的第一步可使結(jié)合型藥物釋放

1.去除蛋白后取上清液直接分析測(cè)定

2.去除蛋白后取上清液經(jīng)進(jìn)一步分離純化、濃集后分析測(cè)定第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理返回第二節(jié)

三、預(yù)處理與制備

去除蛋白質(zhì)的方法

1.加入與水混溶的有機(jī)溶劑—蛋白質(zhì)脫水沉淀

2.加入中性鹽—“鹽析”沉淀蛋白質(zhì)

3.加入強(qiáng)酸—與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子(銨基)

形成不溶性鹽沉淀

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理

去除蛋白質(zhì)的方法

4.加入重金屬鹽—與蛋白質(zhì)陰離子

(羧基)形成不溶性鹽沉淀

5.超濾法—半透膜濾除可溶性生物大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì))6.酶水解法—蛋白分解酶分解蛋白質(zhì)

7.加熱法—蛋白質(zhì)變性凝固第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理1.加入與水相混溶的有機(jī)溶劑常用有機(jī)溶劑:乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃血樣與溶劑體積比—1∶(1~3)可除去90%以上蛋白質(zhì)(附圖三)

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理乙腈—塊狀絮凝物、易于分離；成分損失可能性大，上清液pH為8.5~9.5甲醇—細(xì)小顆粒沉淀、不易分離；成分損失可能性小，上清液pH為8.5~9.5超速離心分離（12000r/min)—離心1~2min2.加入中性鹽常用中性鹽—飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽及枸櫞酸鹽等試劑用量—血清與飽和硫酸銨比例為1∶2時(shí)除去90%以上的蛋白質(zhì)(附圖四)

分離—高速(12000r/min)離心 上清液液性——pH7.0~7.7第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理3.加入強(qiáng)酸常用的強(qiáng)酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、

5%偏磷酸等試劑用量——血清與強(qiáng)酸比例為1∶0.6時(shí)，除去90%以上的蛋白質(zhì)(附圖四)分離——高速(12000r/min)離心1~2min上清液液性——pH0~4過(guò)量三氯醋酸——煮沸分解為氯仿和二氧化碳高氯酸——碳酸鉀、醋酸鉀或氫氧化鈉等中和后加乙醇使產(chǎn)生高氯酸鉀（鈉）沉淀第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理4.

加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑

當(dāng)溶液pH高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子中帶陰電荷的羧基與金屬陽(yáng)離子形成不溶性鹽沉淀

常用沉淀劑—CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH

血清與沉淀劑比例—1∶(1~3)， 分離—高速(10000r/min)離心 上清液液性—pH分別為5.7~7.3和6.5~7.5第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理5.超濾法性質(zhì)—以多孔性半透膜(超濾膜)作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)；特點(diǎn)—無(wú)需加熱；無(wú)需添加化學(xué)試劑；無(wú)相變化；無(wú)破壞性應(yīng)用—游離藥物首選方法，尤其適合TDM操作—分子量截留值在5萬(wàn)左右的超濾膜過(guò)濾可將分子量大的血漿蛋白以及結(jié)合了的藥物的血漿蛋白分離第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理

6．酶水解法

加入適量的酶和緩沖液，置水浴上水解一定時(shí)間，過(guò)濾或離心，取上清液供萃取用

最常用的酶—蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在較寬的pH范圍(pH7.0~11.0)內(nèi)使蛋白的肽鍵降解，在50~60℃具有最大活力

第三章生物樣品與樣品制備第一節(jié)生物樣品的種類采集返回去除蛋白質(zhì)方法7.

加熱法

測(cè)定對(duì)熱穩(wěn)定性好的組分時(shí)，可采用加熱的方法將一些熱變性蛋白沉淀 加熱溫度視欲測(cè)組分的熱穩(wěn)定性而定，通?？杉訜岬?0℃；蛋白沉淀后可用離心或過(guò)濾除去

優(yōu)點(diǎn)——方法最簡(jiǎn)單

缺點(diǎn)——只能除去熱變性蛋白

第三章生物樣品與樣品制備第二節(jié)生物樣品的預(yù)處理一、生物樣品預(yù)處理的目的

使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放

——測(cè)定藥物的總濃度

使樣品純化——消除生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾

提高檢測(cè)靈敏度——適應(yīng)和符合測(cè)定方法要求的靈敏度

防止分析儀器的污染和劣化——提高分析儀器的耐受程度、改善分析結(jié)果（一）使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放

藥物——吸收——蛋白結(jié)合物

Ⅰ相代謝——代謝物

Ⅱ相代謝——綴合物在體內(nèi)存在形式：游離型藥物+代謝物

+藥物或代謝物與蛋白結(jié)合物

+藥物或代謝物Ⅱ相代謝的綴合物預(yù)處理—藥物或代謝物從“結(jié)合物”或綴合物中釋放，測(cè)定藥物或代謝物的總濃度（二）樣品純化

生物樣品的基質(zhì)——組成復(fù)雜、干擾多

血清中含有高分子的蛋白質(zhì)和低分子的糖、脂肪、尿素等有機(jī)物，也含有Na+、K+、Cl-等無(wú)機(jī)物

尿液中含有尿素、肌酸、尿囊素、氨、Na+、K+、Cl-等

藥物組分——藥物含量低，一般為

g或

ng水平，經(jīng)預(yù)處理使純化、富集（三）提高檢測(cè)靈敏度預(yù)處理—降低背景噪音—提高靈敏度特異性強(qiáng)、靈敏度高的分析方法

—

預(yù)處理簡(jiǎn)單不具備分離功能的方法(光譜法)

—

預(yù)處理十分重要（四）防止分析儀器的污染和劣化

生物樣品基質(zhì)中脂肪、蛋白質(zhì)、不溶性顆粒污染分析儀器

根據(jù)分析儀器的耐受程度，選擇不同的預(yù)處理方法

返回第二節(jié)

高效液相色譜法—去除血漿（或血清）中的蛋白質(zhì)

預(yù)處理—改善分析結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度，延長(zhǎng)色譜柱的壽命（除固體雜質(zhì)）

—改善選擇性（排除生物基質(zhì)的干擾）

—改善組分可測(cè)性（被測(cè)組分的富集）

—改善組分色譜行為（化學(xué)衍生化）

返回第二節(jié)（四）防止分析儀器的污染和劣化二、樣品制備時(shí)應(yīng)考慮的問(wèn)題

1．被測(cè)組分的理化性質(zhì)、存在形式、濃度范圍2．測(cè)定目的3．生物樣品種類和基質(zhì)的干擾類型

返回第二節(jié)二、樣品制備時(shí)應(yīng)考慮的問(wèn)題

4．樣品的化學(xué)組成5．藥物的蛋白結(jié)合率6．被測(cè)組分在預(yù)處理過(guò)程中的穩(wěn)定性7．樣品在收集、儲(chǔ)存和預(yù)處理中容器的污染8．保證必要的專屬性、靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度的前提下預(yù)處理過(guò)程盡量簡(jiǎn)單返回第二節(jié)1.藥物的理化性質(zhì)和存在形式酸堿性(pKa)、溶解性——提取性質(zhì)揮發(fā)性——揮發(fā)損失及氣相色譜法的應(yīng)用光譜特性——分析儀器的選擇官能團(tuán)性質(zhì)——化學(xué)衍生化和檢測(cè)器應(yīng)用化學(xué)穩(wěn)定性——處理?xiàng)l件的選擇存在形式及血漿蛋白結(jié)合率——預(yù)處理方法

2.待測(cè)藥物的濃度范圍不同藥物在體內(nèi)中濃度相差極為懸殊

——地高辛治療血濃為1~2ng/ml

——水楊酸鹽治療血濃為20~100

g/ml

濃度大——預(yù)處理要求稍低 濃度低——樣品制備要求高返回第二節(jié)

二、樣品制備考慮3.藥物測(cè)定目的

測(cè)定藥物及代謝物

——要求使代謝物從綴合物中釋放出來(lái)并在不同pH介質(zhì)中分離獲得酸性、中性或堿性代謝物，對(duì)樣品預(yù)處理的要求全面、細(xì)致返回第二節(jié)

二、樣品制備考慮4.選用的生物樣品類型

待測(cè)生物樣品的類型決定樣品預(yù)處理方法：

血漿、血清——常需去除蛋白質(zhì)

唾液——