無菌檢驗(yàn)技術(shù)-供試品的無菌檢查

項(xiàng)目七無菌檢驗(yàn)技術(shù)任務(wù)4供試品的無菌檢查技能點(diǎn)5薄膜過濾集菌器操作規(guī)程5.膜過濾集菌器操作規(guī)程5.1目的：為了規(guī)范、統(tǒng)一無菌檢查方法，確保微生物檢測準(zhǔn)確、安全進(jìn)行，建立薄膜過濾法操作規(guī)程。5.2范圍：本規(guī)程適用于2015版中國藥典注射劑的無菌檢查。5.3職責(zé)：質(zhì)檢室質(zhì)檢員負(fù)責(zé)本操作規(guī)程的執(zhí)行，質(zhì)保室質(zhì)監(jiān)員負(fù)責(zé)本操作規(guī)程的監(jiān)督檢查。5.4內(nèi)容：5.4.1薄膜過濾法薄膜過濾法是將供試品通過集菌儀的定向蠕動(dòng)加壓作用，實(shí)施正壓過濾并在濾器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以檢驗(yàn)供試品是否含菌的方法。

薄膜過濾集菌器操作規(guī)程膜過濾集菌器裝置圖薄膜過濾集菌器操作規(guī)程(1)薄膜過濾法的簡要方法供試品通過進(jìn)樣管連續(xù)被注入集菌儀培養(yǎng)器中，利用集菌培養(yǎng)器內(nèi)形成的正壓，通過不大于0.45μm孔徑的濾膜過濾，供試品可能存在的微生物被截留收集在濾膜上，通過沖洗濾膜除去抑菌成分；然后把所需培養(yǎng)基通過進(jìn)樣管直接注入集菌器培養(yǎng)器中，放置在規(guī)定的溫度下培養(yǎng)，觀察是否有菌生長。該方法適宜抗菌藥品的無菌檢查。（2）操作步驟①供試液的配制(同直接接種法)按無菌操作取出規(guī)定量的供試品，用適宜的溶劑溶解、稀釋到規(guī)定的濃度：吸取適量供試品藥液，加入0.9%無菌氯化鈉溶液或其他適宜的溶劑至100m1(供試液)，搖勻。薄膜過濾集菌器操作規(guī)程②過濾啟動(dòng)蠕動(dòng)泵，過濾。如采用開放式過濾裝置，打開濾器蓋，在火焰旁無菌操作立即將供試液倒入直徑約為50m、孔徑不大于0.45μm微孔濾膜的薄膜過濾器中，關(guān)閉濾器蓋，打開排液架閥門，啟動(dòng)真空泵進(jìn)行減壓抽濾，濾干。③沖洗用滅菌0.9%氯化鈉溶液或其他適宜的溶劑照上述操作沖洗濾膜不得少于3次，每次100ml。沖洗次數(shù)應(yīng)由驗(yàn)證試驗(yàn)確定，至陽性對照菌正常生長。大容量非抗菌作用的供試品，薄膜過濾后，無須沖洗。

薄膜過濾集菌器操作規(guī)程④接種、培養(yǎng)如用全封閉式過濾器，分別將100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)。集菌培養(yǎng)器底部的排液管口擰上，將沖洗液瓶取下?lián)Q上相應(yīng)的培養(yǎng)瓶，啟動(dòng)電源，將培養(yǎng)基泵人指定的培養(yǎng)器內(nèi)，關(guān)閉電源。將已操作完畢的含培養(yǎng)基的集菌培養(yǎng)器移出無菌室，取其中一管作為陽性對照，依陽性對照菌選擇原則加入相應(yīng)的對照菌液。薄膜過濾集菌器操作規(guī)程如用傳統(tǒng)開放式過濾器，過濾后，打開抽氣瓶塞排氣管的螺旋夾，將過濾器取下取出濾器的玻璃筒，用滅菌鑷子將濾膜放入滅菌的平皿中。用滅菌剪刀將濾膜平均分成4份，用滅菌鑷子取3份分別放入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基管各1份。陽性對照管應(yīng)根據(jù)供試品的特性加入相應(yīng)對照菌，如抗細(xì)菌藥物，以金黃色球菌為對照菌；抗厭氧菌藥物，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌藥物，以白色念珠為對照菌。每次操作時(shí),均應(yīng)取相應(yīng)溶劑、稀釋劑及沖洗液同法操作，作為陰性對照

所有供試組、陽性對照組、陰性對照組都要按規(guī)定溫度與時(shí)間培養(yǎng)、觀察。

⑤結(jié)果判定同直接接種法。薄膜過濾集菌器操作規(guī)程項(xiàng)目七無菌檢驗(yàn)技術(shù)任務(wù)4供試品的無菌檢查技能點(diǎn)4直接接種法操作規(guī)程4.直接接種法操作規(guī)程4.1目的：為了規(guī)范、統(tǒng)一無菌檢查方法，確保微生物檢測準(zhǔn)確、安全進(jìn)行，建立直接接種法操作規(guī)程。4.2范圍：本規(guī)程適用于2015版中國藥典注射劑的無菌檢查。4.3職責(zé)：質(zhì)檢室質(zhì)檢員負(fù)責(zé)本操作規(guī)程的執(zhí)行，質(zhì)保室質(zhì)監(jiān)員負(fù)責(zé)本操作規(guī)程的監(jiān)督檢查。4.4內(nèi)容：4.4.1直接接種法直接接種法即取規(guī)定量的供試品分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外，每個(gè)容器中供試品的體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時(shí)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基裝量不少于10ml。

直接接種法操作規(guī)程4.4.2實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備①無菌室內(nèi)應(yīng)準(zhǔn)備好消毒溶液、乙醇燈、火柴、鑷子、75%乙醇棉、記號(hào)筆等。②供試品在移入緩沖間前應(yīng)除去外包裝、消毒外表面并編號(hào)。③將已滅過菌的注射器及針頭，15ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基11管培養(yǎng)基管，10ml改良馬丁培養(yǎng)基10管，經(jīng)外包裝消毒后，連同其他用具（包括無菌衣，帽、口罩等）移入緩沖間。④開啟操作間紫外燈和空氣過濾裝置并使其工作1h以上。⑤操作人員用肥皂、水清洗雙手，關(guān)閉紫外光燈，進(jìn)入緩沖間，換拖鞋，再用75%乙醇棉球擦手，穿戴衣、帽、口罩、手套。將所需物品剝?nèi)ヅＦぜ垼迫霟o菌間每次試驗(yàn)中所用物品必須計(jì)劃好，并有備用物品。

直接接種法操作規(guī)程4.4.3供試品的制備在無菌室內(nèi)，先用75%乙醇或碘仿棉球擦試供試品內(nèi)包裝壁及瓶塞，待干，以無菌的方式取內(nèi)容物，制成一定濃度的供試品溶液。①當(dāng)供試品為粉針劑，瓶蓋為橡膠塞時(shí)，用注射器吸取規(guī)定的溶劑，在已消毒好的橡膠塞中心位置刺入小瓶加入溶劑，溶解，混勻后吸出溶液，或選用其他適宜的方法制成一定濃度的供試品溶液。②如為注射液、供角膜創(chuàng)傷及手術(shù)用的滴眼劑成滅菌溶液等可用注射器吸取藥液或選用其他適宜的方法制成一定濃度的供試品溶液。③按規(guī)定或需滅活的供試品可用滅活劑溶解，將瓶內(nèi)供試液抽出稀釋至規(guī)定的濃度。直接接種法操作規(guī)程供試品如為注射用無菌粉末的原料藥(大包裝粉針劑)，為縮短取樣時(shí)的暴露時(shí)間，應(yīng)由兩人按無菌操作開啟容器取出內(nèi)容物，再用適當(dāng)溶劑制成一定濃度的供試品溶液。注意：供試品處理時(shí)所用的溶劑、乳化劑、分散劑、中和劑(滅活劑)及其用量應(yīng)驗(yàn)證是有效的，并對微生物生長無影響。⑤抗菌類藥物及含防腐劑藥物，即有抑菌作用的供試品，可先用中和法、滅活法能或稀釋法使其不再具有抑菌作用，再用直接接種法檢查。直接接種法操作規(guī)程中和法(滅活法)：在培養(yǎng)基中加入合適的中和劑，使藥物不再具有抑菌作用，或抑菌作用可以忽略不計(jì)，如對青霉素藥物進(jìn)行無菌檢查時(shí)，常在培養(yǎng)基中加入中和劑青霉素酶。中和劑本身必須對微生物沒有毒性，同時(shí)滅活劑與抗菌藥物相互作用的產(chǎn)物對微生物也沒有毒性。滅活劑的中和作用必須迅速而完全。稀釋法：有些供試品有抑菌作用或含有抑菌作用的物質(zhì)而沒有適當(dāng)?shù)闹泻蛣?，可加入較大量的培養(yǎng)基，使供試品稀釋至不具抑菌作用的濃度即可。亦可按薄膜過濾法檢查。

直接接種法操作規(guī)程4.4.4供試品無菌檢查的接種①硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基接種按無菌操作取上述制備妥的供試品1ml，沿著培養(yǎng)基管壁分別接種于裝有15ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基11管，其中1管在操作結(jié)束后移至接種室接種金黃色葡萄球菌對照菌液lml作為陽性對照，置30-35℃，培養(yǎng)14天。②改良馬丁培養(yǎng)基接種取上述制備好的供試品lml，沿著培養(yǎng)基管壁分別接種于10ml改良馬丁培養(yǎng)基10管，輕輕搖動(dòng)使勻，于23～28℃，培養(yǎng)14日。③陰性對照每次操作時(shí)，均應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑，同法操作，作為陰性對照。直接接種法操作規(guī)程(4)培養(yǎng)及觀察培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長、填寫檢查記錄表，陽性對照管培養(yǎng)24后應(yīng)有菌生長。如加入供試品后的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)渾濁培養(yǎng)14日后，不能從外觀上判斷有微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量接種于同種新鮮培養(yǎng)基中或斜面上，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)48h，真菌培養(yǎng)72h，觀察是否再現(xiàn)渾濁成斜面上有無菌生長；或用接種環(huán)取培養(yǎng)液涂片，染色，顯微鏡下鏡檢，進(jìn)行判斷是否有菌。(5)結(jié)果判定當(dāng)陽性對照管渾濁并確定有菌生長，陰性對照管無菌生長時(shí)，方可據(jù)所觀察到的結(jié)果判定。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判斷供試品符合規(guī)定若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無效即生長的微生物非供試品所含。直接接種法操作規(guī)程當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判試驗(yàn)結(jié)果無效。①無菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求。②回顧無菌試驗(yàn)過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；③供試品管中生長的生物經(jīng)定后，確證是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品和(或)無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試時(shí)，重新取同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。

直接接種法操作規(guī)程項(xiàng)目七無菌檢驗(yàn)技術(shù)任務(wù)4供試品的無菌檢查知識(shí)點(diǎn)4供試品的無菌檢查供試品的無菌檢查4供試品的無菌檢查4.1檢驗(yàn)數(shù)量從理論上講，無菌產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)是沒有任何的微生物污染的產(chǎn)品，由于產(chǎn)品的無菌檢查方法是破壞性的，所以不可能對每批的產(chǎn)品一一進(jìn)行檢查，因此，一般都是從每批產(chǎn)品中抽取一定量的樣品進(jìn)行無菌檢查，以此結(jié)果判斷每批產(chǎn)品是否符合無菌的要求。另外，由于無菌產(chǎn)品的污染率極低，因此抽樣方法和檢驗(yàn)數(shù)量直接影響著無菌檢查的結(jié)果。檢驗(yàn)數(shù)量是指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。檢驗(yàn)數(shù)量的多少受很多方面因素的制約，例如檢查的目的、要求、代表性及抽樣方法以及實(shí)際工作量和經(jīng)濟(jì)損失等因素。供試品的無菌檢查《中國藥典》2010年版規(guī)定：除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按表1規(guī)定；上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)按表2、表3規(guī)定。一般情況下，供試品無菌檢查若用薄膜過濾法，應(yīng)增加1/2的最小檢驗(yàn)數(shù)量作陽性對照；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品無菌檢查時(shí)每個(gè)培養(yǎng)基容器接種的樣品量作陽性對照用。總之，檢驗(yàn)數(shù)量力求以最少樣本量準(zhǔn)確反映總體的質(zhì)量?！吨袊幍洹?010年版關(guān)于檢驗(yàn)的數(shù)量與國外藥典基本一致，對于生產(chǎn)廠的出廠產(chǎn)品加大了檢驗(yàn)量：但藥檢部門的監(jiān)督檢查的抽樣量仍較少，與國外水平存在差距。供試品的無菌檢查表1批出廠產(chǎn)品最少檢驗(yàn)數(shù)量供試品批產(chǎn)量N（個(gè)）接種每種培養(yǎng)基所需的最少檢驗(yàn)數(shù)量小體積注射劑（≦100ml）≦10010%或4個(gè)（取較多者）100﹤N≦50010個(gè)﹥5002%或20個(gè)（取較少者）大體積注射劑（﹥100ml）2%或10個(gè)（取較少者）眼用及其他非注射產(chǎn)品≦2005%或2個(gè)（取較多者）﹥20010個(gè)桶裝固體原料≦4每個(gè)容器4﹤N≦5020%或4個(gè)容器（取較多者）﹥502%或10個(gè)容器（取較多者）抗生素原料6個(gè)容器醫(yī)療器具≦10010%或4個(gè)（取較多者）100﹤N≦50010個(gè)﹥5002%或20個(gè)（取較少者）供試品的無菌檢查表2液體制劑最少檢驗(yàn)量及上市抽檢樣品的最少檢驗(yàn)量供試品裝量V（ml）每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量供試品最少檢驗(yàn)數(shù)量（瓶或支）≤1全量101﹤V﹤5半量105≤V﹤202ml1020≤V﹤505ml1050≤V﹤10010ml1050≤V﹤100（靜脈給藥）半量10100≤V﹤500半量10﹥500500ml10供試品的無菌檢查4.2檢驗(yàn)量檢驗(yàn)量是指一次試驗(yàn)所用的供試品總量(g或ml)。除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基的供試品量按表2、表3規(guī)定。若每支(瓶)品的量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時(shí)，檢驗(yàn)量應(yīng)不少于直接接種法的供試品總接種量，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。以欲檢查上市產(chǎn)品青霉素鈉注射劑為例，參照表表3，每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量為150mg，供試品最少檢驗(yàn)數(shù)量為10支。但由于青霉素為抗生素，應(yīng)采用薄膜過濾法，將每支全部內(nèi)容物過濾沖洗。供試品的無菌檢查4.3陽性對照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用(如維生素B12注射液)及抗革蘭陽性菌(如