控制菌及螨類檢查技術(shù)-藥品中沙門(mén)菌檢查

項(xiàng)目九控制菌檢查及螨類檢查技術(shù)任務(wù)6藥品中沙門(mén)菌檢查知識(shí)點(diǎn)6藥品中沙門(mén)菌檢查方法7.1沙門(mén)菌沙門(mén)菌屬是腸桿菌科的重要致病菌，沙門(mén)菌可通過(guò)人、畜、禽的糞便或與帶菌者接觸，直接或間接的污染藥品原料、輔料及生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，所以來(lái)源于動(dòng)物的藥物，如臟器、糞便、全蟲(chóng)體等污染幾率較高。因此，藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，以動(dòng)物來(lái)源的藥物、動(dòng)物臟器制品不得檢出沙門(mén)菌。7.1.1形態(tài)特征

沙門(mén)菌為革蘭陰性桿菌，無(wú)芽孢，菌體端鈍圓，除個(gè)別菌種外，都具有周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，一般無(wú)莢膜，少數(shù)有包膜。7.1.2培養(yǎng)特征

沙門(mén)菌為需氧或兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適pH為6.8～7.8。在鑒別培養(yǎng)基上，菌落細(xì)小，透明或半透明。由于一般不分解乳糖，菌落無(wú)色，產(chǎn)生H2S，故在膽鹽硫乳(DHL)瓊脂上形成黑色或中心黑色的菌落。藥品中沙門(mén)菌檢查方法7.1.3生化反應(yīng)

沙門(mén)菌分解葡萄糖、麥芽糖、甘露醇，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不分解乳糖、蔗糖：靛基質(zhì)試驗(yàn)-：尿素酶試驗(yàn)-；氰化鉀試驗(yàn)-；賴氨酸脫羧試驗(yàn)+；硫化氫反應(yīng)+或-；動(dòng)力檢查+。7.1.4抵抗力

沙門(mén)菌對(duì)熱、消毒藥和外界不良因素的抵抗力與大腸埃希菌相似，在水中能存活數(shù)周至數(shù)月；在糞便中存活1～2個(gè)月。60℃10～20min被殺死，在5%石碳酸、0.2%升汞溶液中5min被殺死。對(duì)氯霉素、土霉素敏感。膽鹽和煌綠對(duì)沙門(mén)菌的抑制作用較大腸埃希菌小得多，故可用于該菌分離。藥品中沙門(mén)菌檢查方法7.2檢查程序供試液的制備見(jiàn)“藥品中微生物總數(shù)的檢查。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)：供試品進(jìn)行控制菌檢查時(shí)，應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的加菌量為10～100cfu，供試品和增菌培養(yǎng)基用量及檢查按供試品的控制菌檢查。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的目的：檢查供試品是否有抑菌作用及培養(yǎng)條件是否適宜。陰性對(duì)照試驗(yàn)：取稀釋劑10m1加入100m1(或200ml)相應(yīng)控制菌檢查用的增菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。

陰性對(duì)照試驗(yàn)的目的：檢查稀釋劑是否滿足要求及培養(yǎng)條件是否適宜。藥品中沙門(mén)菌檢查方法7.2.1增菌培養(yǎng)預(yù)增菌取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3份，每份200m1,1份加入10g或者10ml供試品，混勻；1份加入供試品及陽(yáng)性對(duì)照菌10～10cfu，混勻；1份加入稀釋劑10ml作陰性對(duì)照,30～35℃培養(yǎng)18～24h，觀察。搖動(dòng)陰性對(duì)照瓶后應(yīng)清亮透明，無(wú)生長(zhǎng)。增菌培養(yǎng)輕微搖動(dòng)供試品增菌培養(yǎng)瓶，分別吸取1m接種于一管含10ml硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)18～24h。7.2.2分離培養(yǎng)

輕微搖動(dòng)供試品增菌培養(yǎng)瓶及陽(yáng)性對(duì)照瓶，分別以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液劃線于膽鹽硫乳瓊脂(DHL)或沙門(mén)菌志賀菌瓊脂(SS)平板及曙紅亞甲藍(lán)瓊脂(EMB)或麥康凱瓊脂平板各1個(gè)，倒置培養(yǎng)24～48h，必要時(shí)延長(zhǎng)至40～48h。檢查平板有無(wú)疑似沙門(mén)菌菌落。沙門(mén)菌在上述平板上的菌落形態(tài)特征見(jiàn)下表。藥品中沙門(mén)菌檢查方法沙門(mén)菌的菌落特征藥品中沙門(mén)菌檢查方法平板菌落特征膽鹽硫乳瓊脂(DHL)無(wú)色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無(wú)黑色。沙門(mén)菌志賀菌瓊脂(SS)無(wú)色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色。曙紅亞甲藍(lán)瓊脂(EMB)無(wú)色至淡橙色，半透明或不透明，光滑濕潤(rùn)的圓形菌落。麥康凱瓊脂（MacC）無(wú)色至淡橙色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)為暗色。由于沙門(mén)菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產(chǎn)酸，菌落不著色，一般為無(wú)色半透明，多數(shù)沙門(mén)菌因產(chǎn)生H2S，菌落中心呈現(xiàn)黑色甚至全黑色，在DHL瓊脂平版上輕為明顯，在SS瓊脂平板上，H2S特征有時(shí)不明顯，沙門(mén)菌屬亞屬因多數(shù)屬株發(fā)酵乳糖，故在上述平板上的乳糖發(fā)酵菌落呈現(xiàn)粉紅或紫色，但由于產(chǎn)生H2S，在有H2S指示系統(tǒng)的平板上仍出現(xiàn)黑色中心。在上述培養(yǎng)基上，有些非沙門(mén)菌屬細(xì)菌，也可呈現(xiàn)類似門(mén)滿菌菌落形態(tài)，須進(jìn)一步鑒別。由于藥物的影響或非典型菌株的存在，沙門(mén)菌菌落可呈現(xiàn)非典型形態(tài)，如色澤變深，菌落粗糙等，應(yīng)注意辨別。7.2.3初步鑒別試驗(yàn)

從每個(gè)供試品的分離平板上挑取2～3個(gè)疑似菌落(落形態(tài)特征與表10-4所列的形態(tài)特征相符或疑似)分別接種于三糖鐵斜面，接種時(shí)應(yīng)以接種針輕輕接觸單個(gè)菌落中心部位，沾取培養(yǎng)物劃線于三糖鐵瓊脂斜面并穿刺到底層或光穿刺底層再劃線斜面，培養(yǎng)18～24，觀察結(jié)果。藥品中沙門(mén)菌檢查方法疑似沙門(mén)菌在三糖鐵瓊脂斜面上的反應(yīng)為：①斜面紅色(產(chǎn)堿)，底層黑色(產(chǎn)H2S)并顯示黃色(產(chǎn)酸)；②斜面紅色，底層黃色；③斜面黃色，底層黑色，并顯示黃色。多數(shù)沙門(mén)菌在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)生氣體，使底層瓊脂出現(xiàn)氣泡或使瓊脂斷裂，但也有不產(chǎn)生氣體的菌種。對(duì)在三糖鐵瓊脂斜面黃色并同時(shí)底層無(wú)黑色，或斜面及底層均為紅色者可以排除沙門(mén)菌。將疑似沙門(mén)菌的三糖鐵瓊脂或營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作生化試驗(yàn)，血清凝集試驗(yàn)及革蘭染色，鏡檢。沙門(mén)菌應(yīng)為革蘭陰性桿菌。7.2.4生化試驗(yàn)7.2.4.1靛基質(zhì)試驗(yàn)

用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種到蛋白胨水培養(yǎng)基中，照大腸埃希旋靛基質(zhì)試驗(yàn)項(xiàng)下操作、判斷結(jié)果。沙門(mén)菌應(yīng)為陰性反應(yīng)。7.2.4.2脲酶試驗(yàn)

用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，劃線接種于脲瓊脂斜面，培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。斜面變紅色為陽(yáng)性反應(yīng)，沙門(mén)菌屬為陰性反應(yīng)。藥品中沙門(mén)菌檢查方法7.2.4.3氰化鉀試驗(yàn)

將培養(yǎng)物先接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～-24，用接種環(huán)沾取培養(yǎng)液1環(huán)，接種至氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，另取一環(huán)培養(yǎng)液接種于不含氰化鉀的同樣培養(yǎng)基內(nèi)作對(duì)照管，接種后即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。對(duì)照管內(nèi)有菌生長(zhǎng)(混濁)，而試驗(yàn)管也有菌生長(zhǎng)為陽(yáng)性反應(yīng)；對(duì)照管有菌生長(zhǎng)(混濁)而試驗(yàn)管無(wú)菌生長(zhǎng)(清亮)為陰性反應(yīng)。沙門(mén)菌應(yīng)為陰性反應(yīng)。本試驗(yàn)十分注意密封管口，夏天分裝培養(yǎng)基宜在冰浴中進(jìn)行，防止氰化鉀分解，產(chǎn)生氫氰酸逸出，致使培養(yǎng)基內(nèi)氰化鉀濃度降低，不能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，造成假陽(yáng)性。氰化鉀為劇毒品，操作時(shí)須謹(jǐn)慎，切勿用口吸液。用后的培養(yǎng)基，每管加數(shù)粒硫酸亞鐵和20%的氫氧化鉀0.5ml，去毒，然后再滅菌，洗滌。藥品中沙門(mén)菌檢查方法7.2.4.4氨酸脫羧酶試驗(yàn)

用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種在賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基中，同時(shí)接種1支不含賴氨酸的同樣培養(yǎng)基作為對(duì)照管，培養(yǎng)24～48h觀察結(jié)果。對(duì)照管黃色(產(chǎn)酸)，試驗(yàn)管呈紫色為陽(yáng)性反應(yīng)(賴氨酸脫羧產(chǎn)堿)；試驗(yàn)管黃色為陰性反應(yīng)。沙門(mén)菌應(yīng)為陽(yáng)性反應(yīng)。7.2.4.5動(dòng)力試驗(yàn)

用接種針沾取培養(yǎng)物，穿刺接種于半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂管中，培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。有動(dòng)力的細(xì)菌能在穿刺線以外的培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散生長(zhǎng)使培養(yǎng)基呈混濁現(xiàn)象；無(wú)動(dòng)力的細(xì)菌僅能沿穿刺線生長(zhǎng)，不向外擴(kuò)散，培養(yǎng)基仍呈清晰透明狀。無(wú)動(dòng)力表現(xiàn)的培養(yǎng)物，應(yīng)在室溫保留2～3天后，再行觀察。沙門(mén)菌除雞雛沙門(mén)菌及無(wú)動(dòng)力的變種外，均具有周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，動(dòng)力試驗(yàn)陽(yáng)性。7.2.4.6血清凝集試驗(yàn)

制備1片潔凈的滅菌載玻片，在近中央一端，以直徑3mm接種環(huán)沾取沙門(mén)菌屬O多價(jià)1血清2～3環(huán)制成與玻片橫徑相垂直的條形涂抹，長(zhǎng)約1.5cm，寬約0.5cm。另一端用生理鹽水代替血清同法操作，作為陰性對(duì)照。藥品中沙門(mén)菌檢查方法用接種環(huán)分別挑取三糖鐵瓊脂斜面或營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物少許，在血清和鹽水中混勻。菌量要適當(dāng)，勿過(guò)濃。將玻片前后傾斜數(shù)次，以暗色背景襯底，在良好的照明條件下進(jìn)行觀察，陰性對(duì)照不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，試驗(yàn)組任何程度的凝集現(xiàn)象都是陽(yáng)性反應(yīng)。陽(yáng)性反應(yīng)通常在3min內(nèi)發(fā)生，有時(shí)因血清效價(jià)低，反應(yīng)遲緩時(shí)，應(yīng)將玻片置培養(yǎng)皿內(nèi)，并放一個(gè)溫棉球在旁邊，蓋上皿蓋，經(jīng)過(guò)約20min，再觀察結(jié)果.若仍然沒(méi)有出現(xiàn)凝集，應(yīng)取斜面培養(yǎng)物，置含少量生理鹽水的試管中，制成濃菌液，在100℃水浴中保溫30min(除去可能存在的Vi抗原)，待冷，再做凝集試驗(yàn)，如出現(xiàn)凝集，仍判為陽(yáng)性反應(yīng)；如不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則為陰性反應(yīng)。7.2.5結(jié)果判斷7.2.5.1供試品培養(yǎng)物為革蘭陰性桿菌，三糖鐵瓊脂反應(yīng)及生化反應(yīng)符合沙門(mén)菌屬反應(yīng)，沙門(mén)菌屬O多價(jià)1血清凝集試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)(含待檢培養(yǎng)物經(jīng)100℃30min處理后凝集試驗(yàn)為陽(yáng)性反應(yīng))，報(bào)告10g或10ml供試品檢出沙門(mén)菌。藥品中沙門(mén)菌檢查方法7.2.5.2供試品培養(yǎng)物三糖鐵瓊脂反應(yīng)及生化反應(yīng)不符合沙門(mén)菌屬反應(yīng)，沙門(mén)菌屬0多價(jià)1血清凝集試驗(yàn)陰性反應(yīng)(含待檢培養(yǎng)物經(jīng)100℃30min處理后凝集試驗(yàn)為陰性反應(yīng)），報(bào)告10g或10m供試品未檢出沙門(mén)菌。7.2.5.3供試品培養(yǎng)物出現(xiàn)下列情況應(yīng)繼續(xù)鑒定或保留菌種送交有關(guān)單位進(jìn)一步鑒定后，再作報(bào)告。①供試品培養(yǎng)物生化反應(yīng)符合沙門(mén)菌屬反應(yīng)②供試品培養(yǎng)物生化反應(yīng)不符合沙門(mén)菌屬反應(yīng)，沙門(mén)菌屬O多價(jià)1凝集試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)。7.2.6注意事項(xiàng)7.2.6.1試驗(yàn)用培養(yǎng)基，需經(jīng)過(guò)質(zhì)量鑒定，用已知典型反應(yīng)菌株(如乙型副傷寒沙門(mén)菌CMCC(B)50041)進(jìn)行測(cè)試，其靈敏度及特征性反應(yīng)應(yīng)符合要求。培養(yǎng)基需在規(guī)定條件保存，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用，分離平板使用前應(yīng)置30～35元溫箱內(nèi)倒置孵育1～2h使其表面漏濕潤(rùn)，利于分離沙門(mén)菌。藥品中沙門(mén)菌檢查方法7.2.6.2對(duì)供試品進(jìn)行測(cè)試的同時(shí)，需做陽(yáng)性菌對(duì)照及陰性對(duì)照。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)顯示陽(yáng)性結(jié)果，否則檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，在進(jìn)行陽(yáng)性菌對(duì)照試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)與供試品檢驗(yàn)分開(kāi)操作，避免污染。特別是用種環(huán)的沾取菌液進(jìn)行接種或分離時(shí)，避免動(dòng)作過(guò)大，形成氣溶膠，污染供試品檢驗(yàn)用具及操作環(huán)境。7.2.6.3為保證試驗(yàn)方法的可靠性，對(duì)分離平板上的疑似菌落，應(yīng)多選取幾個(gè)菌落同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。挑取菌落時(shí)，不要在分離平板菌落密集部位挑取可疑菌落，而應(yīng)在菌落分部稀疏部位挑選。7.2.6.4生化試驗(yàn)及血清學(xué)試驗(yàn)的被鑒定培養(yǎng)物必須是純培養(yǎng)物，否則，不可能得到正確結(jié)果。如遇血清學(xué)凝集試驗(yàn)陽(yáng)性而生化試驗(yàn)不符合時(shí)，應(yīng)首先檢查培養(yǎng)物的純度。對(duì)已污染的培養(yǎng)物，不應(yīng)丟棄，因?yàn)槲廴揪赡苎谏w沙門(mén)菌，故應(yīng)對(duì)被污染的培養(yǎng)物進(jìn)行重新分離，仔細(xì)選取單個(gè)菌落再進(jìn)行試驗(yàn)。藥品中沙門(mén)菌檢查方法7.2.6.5所有生化反應(yīng)均需按照規(guī)定的試驗(yàn)要求進(jìn)行，如觀察三糖鐵瓊脂斜面反應(yīng)的時(shí)間，應(yīng)在24±2h，時(shí)間過(guò)短過(guò)長(zhǎng)，都可能出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果判斷。又如氯化鉀試驗(yàn)，試管口應(yīng)密塞，否則氰化鉀濃度降低，使抑菌作用下降，產(chǎn)生錯(cuò)誤的判定。7.2.6.