芍藥苷-6-o-苯磺酸酯在caco-2細(xì)胞模型中吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究

芍藥苷-6-o'-苯磺酸酯在caco-2細(xì)胞模型中吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究

白芍總物質(zhì)（tcg）提取于牡丹干燥的根系。臨床上，tcg治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)（ra）的治療效果明顯，但療效緩慢。1材料和方法1.1材料表面1.1.1色譜級(jí)及其應(yīng)用CP-25:白色粉末狀,自制,純度>98%;DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自美國Gibco公司;甲醇、乙腈為色譜級(jí),購于Merck公司;Transwell12孔板購自Corning公司;MTT購自白鯊生物科技有限公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;GF120918購自美國Sigma公司,純度>95%;MK571購自美國Sigma公司,純度>95%;KO143購自美國Sigma公司,純度>98%。1.1.2實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞植物Caco-2細(xì)胞購于ATCC(A-mericanTypeCultureCollection)1.1.3高效液相色譜儀SW-CJ系列潔凈工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備工程有限公司;Agilent1200高效液相色譜儀購自美國安捷倫公司;AA-200DS電子分析天平購自Denver儀器公司;CO1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.125-2細(xì)胞模型的測定方法是建立cp-251.2.1.流動(dòng)相、柱溫度和檢測波長Agilent1200高效液相色譜儀色譜儀;AglientTC-C18(5mm×250mm);流動(dòng)相:甲醇-水(53∶47);柱溫:30℃;流速:0.8ml/min;進(jìn)樣量:20μl;檢測波長:230nm。在該條件下CP-25的色譜峰與相鄰峰基線分離度較好,峰形對(duì)稱。1.2.1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將CP-25儲(chǔ)備液溶液用HBSS液分別稀釋成1、2、5、10、20、40、80μg/ml的質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液,取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋混合1min,放置15min后,取上清液0.2ml進(jìn)樣測定,記錄峰面積。以峰面積為Y,質(zhì)量濃度為X(μg/ml)作線性回歸,計(jì)算相關(guān)回歸方程。1.2.1.不同濃度渦流帶水浴槽中注漿峰面積的測定精密稱取CP-25標(biāo)準(zhǔn)品,用HBSS液溶解并定容至10μg/ml,置于37℃恒溫水浴槽中保溫,分別于0、0.5、1、1.5、2、3h取樣渦旋混合1min,放置15min后,取上清液0.2ml按照1.2.1.1項(xiàng)下進(jìn)行操作,記錄相應(yīng)峰面積。1.2.1.樣品制備方法取線性范圍內(nèi)低(5μg/ml)、中(10μg/ml)、高(20μg/ml)3個(gè)濃度樣品,按1.2.1.1項(xiàng)下操作,每個(gè)濃度樣品制備5份。同一樣品1d內(nèi)測定5次的結(jié)果為日內(nèi)精密度,連續(xù)5d測定同一樣品的結(jié)果為日間精密度。1.2.1.加標(biāo)回收率的測定取CP-25線性范圍內(nèi)低(5μg/ml)、中(10μg/ml)、高(20μg/ml)3個(gè)濃度的樣品,按1.2.1.1項(xiàng)下操作并記錄峰面積。將CP-25峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,即得CP-25的實(shí)際加入的濃度,以測定質(zhì)量濃度與加入質(zhì)量濃度之比計(jì)算回收率即得CP-25低、中、高3個(gè)濃度的回收率。另用流動(dòng)相制備相同濃度的CP-25樣品溶液,直接進(jìn)樣并記錄其峰面積,兩峰面積之比即為相對(duì)回收率。1.2.2caco-2細(xì)胞模型的構(gòu)建1.2.2.dmem培養(yǎng)基Caco-2細(xì)胞在含10%FBS、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺和1%的鏈青霉素的DMEM培養(yǎng)基中于37℃、相對(duì)濕度95%、5%CO1.2.2.2c-2細(xì)胞層的構(gòu)建將Caco-2細(xì)胞以密度為1×101.2.2.細(xì)胞跨膜電阻值的測定細(xì)胞在接種后的4、8、12、16、20、22d分別用MillicellERS-2細(xì)胞電阻儀測定細(xì)胞跨膜電阻值,按照下列公式計(jì)算跨膜電阻值(transepithelialelectricalresistance,TEER):TEER=(R1.2.3cp-25對(duì)caco-2細(xì)胞模型中的吸收和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究1.2.3.1tt法檢測cp-25對(duì)caco-2單調(diào)層的毒性胰酶消化對(duì)數(shù)生長期Caco-2細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以每孔5×101.2.3.將CP-25溶解于HBSS培養(yǎng)基中,制備不同濃度的CP-25,分別為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg/ml。細(xì)胞在不同濃度的CP-25HBSS培養(yǎng)基中孵育2h,2h后分別在AP側(cè)和BL側(cè)吸取0.2ml溶液按照1.2.1.1項(xiàng)下操作,記錄其峰面積。1.2.3.設(shè)立含藥細(xì)胞將濃度為5、10、20μg/ml的CP-25以0.5ml體積分別加入AP側(cè),并將1.5mlHBSS培養(yǎng)基加入到BL側(cè)。隨后將含藥細(xì)胞放置在4℃下培養(yǎng)2h。2h后,從每個(gè)樣品的BL側(cè)取出0.2ml溶液按照1.2.1.1項(xiàng)下操作,記錄其峰面積。1.2.3.gf-4009、ml-971和ko133將CP-25用甲醇溶解并用HBSS培養(yǎng)基稀釋,其含藥稀釋液用于溶解GF-120918、MK-571和KO143。P-gp拮抗劑GF120918(100μmol/L)1.3表中的滲透系數(shù)pP其中,ΔQ/Δt為化合物單位時(shí)間內(nèi)的透過速率,A為細(xì)胞表面積,即為本模型中支持膜的面積(1.12cm1.4表中的滲透比計(jì)算公式pdrPDR是受試物從BL面到AP面和AP面搭配BL面之比,其大小反映了受試物吸收機(jī)制。PDR由下式計(jì)算:其中,P1.5數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的測定值皆以u(píng)e0af±s表示。數(shù)據(jù)分析采用SPSS18.0軟件,組間差異比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn),P<0.05表示兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1hplc圖像的特異性2.2溶液干擾及模型內(nèi)溶液干擾HPLC測定Caco-2細(xì)胞模型HBSS液中的CP-25,出峰時(shí)間11.6min,出峰時(shí)間適宜,無明顯Caco-2模型內(nèi)溶液干擾。CP-25標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=24.403X-23.678(r2.3caco-2細(xì)胞的ter值的測量Caco-2細(xì)胞接種Transwell小室后逐漸形成細(xì)胞單層,TEER值逐漸升高,22d時(shí)達(dá)到(580±35)℃·cm2.4cp-25在不同濃度cp-25下的毒性CP-25對(duì)Caco-2單細(xì)胞層的毒性結(jié)果如圖3所示,CP-25在0.2~20μg/ml范圍48h內(nèi)未見毒性。因此,本研究使用此范圍內(nèi)的濃度進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。2.5不同濃度對(duì)cp-25的轉(zhuǎn)移的影響結(jié)果如表1所示,CP-25的P2.6不同溫度對(duì)cp-25的旋轉(zhuǎn)的影響結(jié)果如表2所示,與37℃時(shí)P2.7對(duì)cp-25的pP-gp抑制劑GF120918(100μmol/L)、MRP2抑制劑MK571(50μmol/L)和BCRP抑制劑KO143(10μmol/L)對(duì)CP-25的P3cp-25對(duì)外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性良好的口服吸收是新藥篩選的先決條件,藥物溶解度和胃腸道的滲透性是影響口服吸收的主要因素。一般來說,藥物溶解度和滲透性與其物理化學(xué)性質(zhì)如親脂性、分子大小、氫鍵強(qiáng)度和電離強(qiáng)度有關(guān)。然而,預(yù)測人的口服吸收卻相對(duì)復(fù)雜,特別是在早期藥物開發(fā)階段。一些體外實(shí)驗(yàn)方法廣泛用于新藥的篩選和藥物相關(guān)吸收機(jī)制的研究,Caco-2細(xì)胞體外分化成類似人的腸上皮細(xì)胞時(shí)可表達(dá)腸道特有的水解酶載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)溫度十分敏感,載體是存在于細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,只有在合適的溫度條件下才具有生物活性。本實(shí)驗(yàn)在4℃條件下時(shí),CP-25和Pae(5、10、20μg/ml)的PP-gp、MRP2和BCRP是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中研究最多的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白綜上所述