實(shí)驗(yàn)六-網(wǎng)織紅-血小板計(jì)數(shù)課件

要求熟悉網(wǎng)織紅細(xì)胞染色的原理及形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，掌握計(jì)數(shù)方法，了解注意事項(xiàng)和臨床應(yīng)用。學(xué)會(huì)鏡下辨認(rèn)血小板的形態(tài)，掌握血小板計(jì)數(shù)的方法和參考值，了解注意事項(xiàng)及臨床應(yīng)用。CompanyLogo要求熟悉網(wǎng)織紅細(xì)胞染色的原理及形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，掌握計(jì)數(shù)方法，了解1紅系祖細(xì)胞原紅早幼紅中幼紅晚幼紅網(wǎng)織紅紅細(xì)胞一、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)骨髓外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞（reticulocyte,Ret）是有核紅細(xì)胞轉(zhuǎn)向無核到完全成熟紅細(xì)胞的過度型細(xì)胞，其胞質(zhì)中尚殘留部分嗜堿性物質(zhì)(核糖體和核糖核酸)，能被煌焦油藍(lán)、燦爛甲酚藍(lán)、中性紅等活體染料染色。根據(jù)網(wǎng)織紅細(xì)胞的形態(tài)特征和成熟程度將其分為四型：

I型(絲球型)，沉淀顆粒呈致密結(jié)塊的網(wǎng)織紅細(xì)胞；Ⅱ型(網(wǎng)型)，沉淀顆粒呈疏松結(jié)構(gòu)；Ⅲ型(破網(wǎng)型)，沉淀顆粒呈散在結(jié)構(gòu)；在外周血中僅占0.15%Ⅳ型(點(diǎn)粒型)，沉淀顆粒呈少數(shù)散在分布。多見于外周血，60%以上CompanyLogo紅系祖細(xì)胞原紅早幼紅中幼紅晚幼紅網(wǎng)織紅紅細(xì)胞一、網(wǎng)織紅細(xì)2CompanyLogoCompanyLogo3(一)染色原理

網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)RNA的磷酸基（帶負(fù)電荷）能與溴甲酚藍(lán)、新亞甲藍(lán)等堿性染料的有色反應(yīng)基（帶正點(diǎn)荷）結(jié)合，形成核酸與堿性染料復(fù)合物的藍(lán)黑色多聚顆粒，其顆粒又聯(lián)綴成線狀甚至網(wǎng)狀。凡含有兩個(gè)以上深染顆粒（或具有線網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）的無核紅細(xì)胞，即為網(wǎng)織紅細(xì)胞。CompanyLogo(一)染色原理CompanyLogo4(二)試劑煌焦油藍(lán)染液（1%）煌焦油藍(lán)1g枸櫞酸鈉0.4g氯化鈉0.85g蒸餾水加到100ml，充分溶解過濾備用。CompanyLogo(二)試劑CompanyLogo5（三）操作

顯微鏡計(jì)數(shù)法

2d染料+2d全血（1：1）混勻后染15min，傾少許玻片上，制備薄膜片，晃動(dòng)玻片使迅速干燥，低倍鏡瀏覽全片，選細(xì)胞分布均勻無重疊染色良好部位，油鏡下觀察1000個(gè)紅細(xì)胞中網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)目。參考范圍成人：0.008~0.02

新生兒：0.02~0.06其它方法：網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)儀熒光激活細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)CompanyLogo（三）操作顯微鏡計(jì)數(shù)法CompanyLogo6CompanyLogoCompanyLogo7（四）注意事項(xiàng)1、紅細(xì)胞必須含兩個(gè)或兩個(gè)以上藍(lán)色顆粒，且無需微調(diào)顯微鏡即可見。顆粒必須遠(yuǎn)離細(xì)胞邊緣，以免與變性珠蛋白小體混淆。2、染色時(shí)間必須充分，當(dāng)室溫較低時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間或置37℃水浴箱內(nèi)。3、制片應(yīng)厚薄適宜，否則會(huì)造成網(wǎng)織紅細(xì)胞分布不均。4、網(wǎng)織紅細(xì)胞體積較大，常在血膜尾部和兩側(cè)較多，計(jì)數(shù)應(yīng)該兼顧。5、復(fù)染會(huì)使網(wǎng)織紅數(shù)值降低，因此不采用瑞氏染料復(fù)染，用二甲苯擦涂片也會(huì)使結(jié)果降低。6、染料配制必須祛除沉渣。CompanyLogo（四）注意事項(xiàng)CompanyLogo8方法學(xué)評(píng)價(jià)顯微鏡法可直接觀察細(xì)胞形態(tài)，不需特殊儀器，其中試管法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性較好，被列為手工網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的參考方法但工作效率不高，實(shí)驗(yàn)精密度低。受主觀因素影響較多，且耗時(shí)費(fèi)力。儀器法測(cè)定快速，重復(fù)性好，避免主觀因素，易于標(biāo)準(zhǔn)化，測(cè)量細(xì)胞多，精確性高。根據(jù)熒光強(qiáng)度可反映網(wǎng)織紅細(xì)胞幼稚程度，并計(jì)算出網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟指數(shù)但幼稚白細(xì)胞、晚幼紅細(xì)胞及巨大血小板等可干擾計(jì)數(shù)結(jié)果，儀器價(jià)格貴，試劑成本較高。CompanyLogo方法學(xué)評(píng)價(jià)顯微鏡法CompanyLogo9臨床應(yīng)用網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)是反映骨髓紅細(xì)胞造血功能的重要指標(biāo)網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)增多①溶血性貧血②放療化療后，造血恢復(fù)③貧血治療有效時(shí)④脾功能亢進(jìn)⑤紅細(xì)胞生成素治療后⑥骨髓移植功能良好的指標(biāo)網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)降低①再生障礙性貧血②慢性病性貧血，如惡性腫瘤、慢性腎衰、內(nèi)分泌疾病等CompanyLogo臨床應(yīng)用網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)是反映骨髓紅細(xì)胞造血功能的重要指標(biāo)C10二、血小板計(jì)數(shù)（一）原理將血液用適當(dāng)?shù)南♂屢合♂尯?，充入?jì)數(shù)池中，計(jì)數(shù)一定體積內(nèi)血小板的數(shù)目，再換算成每升血液中的血小板數(shù)。（二）試劑與器材分為破壞紅細(xì)胞稀釋液：如草酸銨溶液不破壞紅細(xì)胞稀釋液：如紅細(xì)胞稀釋液血細(xì)胞計(jì)數(shù)板CompanyLogo二、血小板計(jì)數(shù)（一）原理CompanyLogo11（三）操作步驟1、2ml紅細(xì)胞稀釋液2、采集10ul末梢血，充分混勻3、混勻的血小板懸液充池，靜置10min，高倍鏡下計(jì)數(shù)中央大方格的血小板數(shù)。4、計(jì)算：N*10*200*106/L參考范圍

（100-300）*109/LCompanyLogo（三）操作步驟CompanyLogo12CompanyLogoCompanyLogo13（四）注意事項(xiàng)1、針刺應(yīng)稍深，保證采血順暢，忌擠壓，操作要迅速，無需擦掉第一滴血，若同時(shí)做其他實(shí)驗(yàn)時(shí)，先做血小板計(jì)數(shù)。2、所用器材和稀釋液必須清潔，無菌無塵。器材應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化3、血小板易聚集，充池前應(yīng)充分混勻但不能用力太大，會(huì)破壞血小板4、待血小板下沉后再計(jì)數(shù)，否則結(jié)果偏低5、應(yīng)在1h內(nèi)計(jì)數(shù)完畢，否則結(jié)果偏低6、注意血小板與雜質(zhì)、結(jié)晶等區(qū)別。7.檢查前，應(yīng)避免服用影響到血小板功能的藥物CompanyLogo（四）注意事項(xiàng)CompanyLogo14（五）方法學(xué)評(píng)價(jià)目視顯微鏡法不需特殊儀器，操作簡(jiǎn)便，成本低，但影響因素較多，耗時(shí)費(fèi)力。血細(xì)胞分析儀法重復(fù)性好，測(cè)定速度快，適用于臨床應(yīng)用。目前血細(xì)胞分析儀逐步普及，一般均以全血作為標(biāo)本。但由于血細(xì)胞分析儀不能完全將血小板與其他類似大小的物質(zhì)(如紅細(xì)胞或白細(xì)胞碎片、灰塵等雜物)區(qū)別開來，因此計(jì)數(shù)結(jié)果有時(shí)仍需顯微鏡目視計(jì)數(shù)法來作校正。CompanyLogo（五）方法學(xué)評(píng)價(jià)目視顯微鏡法CompanyLogo15（六）臨床意義1．生理性正常人血小板數(shù)1d內(nèi)可有6%～10%的變化，表現(xiàn)為早晨較低，午后較高；春季較低，冬季略高；平原較低，高原較高；月經(jīng)前較低，月經(jīng)后較高；妊娠中晚期升高，分娩后即降低；運(yùn)動(dòng)后升高，休息后恢復(fù)；靜脈血比毛細(xì)血管血高10%。CompanyLogo（六）臨床意義1．生理性正常人血小板數(shù)1d內(nèi)可有6%～116

2．病理性

（1）

血小板減少：血小板數(shù)量低于100×109/L，原因：①血小板生成障礙：如再障、巨幼貧、急白、骨髓纖維化、放射線損傷；②血小板破壞增加：如ITP、脾亢；③血小板消耗增多：如DIC、TTP、SLE、輸血后血小板減少癥④血小板分布異常：如脾腫大（肝硬化）、血液被稀釋（輸入大量庫(kù)存血或血漿）

CompanyLogo2．病理性CompanyLogo17

（2）血小板增多：數(shù)量超過400×109/L。原因：①骨髓增生性疾?。喝缭l(fā)性血小板增多癥、真性紅細(xì)胞增多