流式細(xì)胞儀BD-FACSCanto-II課件

總覽流式細(xì)胞術(shù)基本知識流式細(xì)胞儀的組成數(shù)據(jù)采集與分析總覽流式細(xì)胞術(shù)基本知識1流式細(xì)胞技術(shù)是什么？流式細(xì)胞術(shù)在流動的狀態(tài)中檢測細(xì)胞或顆粒的各項特性特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)多參數(shù)分析可檢測的樣本種類多樣：外周血，骨髓，細(xì)胞穿刺液，洗脫液，實體組織，培養(yǎng)細(xì)胞，微生物FlowCytometryFlow:FluidCyto:CellMetry:Measurement流式細(xì)胞技術(shù)是什么？流式細(xì)胞術(shù)FlowCytometry2流式細(xì)胞術(shù)檢測樣本0.4um40um流式細(xì)胞術(shù)檢測樣本0.4um40um3流式細(xì)胞術(shù)檢測指標(biāo)

流式細(xì)胞術(shù)提供的信息：

-相對細(xì)胞大小-相對細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度-染色過細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度流式細(xì)胞術(shù)檢測指標(biāo)

4細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞粒度DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量染色體分析細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點細(xì)胞受體細(xì)胞凋亡在上述信號基礎(chǔ)上的細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞功能在上述信號基礎(chǔ)上的細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用5流式細(xì)胞儀組成液流系統(tǒng)：形成層流系統(tǒng)，聚焦細(xì)胞光學(xué)系統(tǒng)：產(chǎn)生和收集光學(xué)信號電子系統(tǒng)：光信號轉(zhuǎn)化為電信號，進(jìn)行信號處理流式細(xì)胞儀組成6FluidicsDiagramSheathFlowsheathtankSampleFlowsheathinteriorreservoirwasteinteriorreservoirsheathfiltersampleinjectiontube(SIT)testtubeorplateflowcellinterrogationpointbubblefilterwastetankFluidicsDiagramSheathFlowshe7液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)8光學(xué)系統(tǒng)

激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)包括:-激光器-透鏡和反射鏡，將激光引導(dǎo)到檢測區(qū)域收集光學(xué)系統(tǒng)包括:濾光片，將產(chǎn)生的光信號引導(dǎo)到對應(yīng)的光學(xué)接收器光學(xué)系統(tǒng)

激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)包括:9流式細(xì)胞儀BD-FACSCanto-II課件10流式細(xì)胞儀BD-FACSCanto-II課件11光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)12流式細(xì)胞儀BD-FACSCanto-II課件13光學(xué)系統(tǒng)-濾光片460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50

Longpass Shortpass Bandpass光學(xué)系統(tǒng)-濾光片46050054046014流式細(xì)胞儀BD-FACSCanto-II課件15流式細(xì)胞儀BD-FACSCanto-II課件16電子系統(tǒng)LaserLaserLaserTimeVoltageTimeVoltageTimeVoltage電子系統(tǒng)LaserLaserLaserTimeVoltage17電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)18電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)19Review懸浮狀態(tài)的細(xì)胞單個流過流動室細(xì)胞被激發(fā)產(chǎn)生散射光和熒光信號信號被采集轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號存儲于電腦上液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)電子系統(tǒng)Review懸浮狀態(tài)的細(xì)胞液流系統(tǒng)電子系統(tǒng)20回顧流式細(xì)胞儀的三大組成部分？濾光片LP600代表什么意思？BP400/40呢？回顧流式細(xì)胞儀的三大組成部分？21數(shù)據(jù)采集

三種數(shù)據(jù)：

-前向散射光FSC-側(cè)向散射光SSC-各種熒光散射光FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3，F(xiàn)L4數(shù)據(jù)采集

22當(dāng)使用激光光源時，在前向方向（和激光行進(jìn)的方向相同）上可用前向散射光接收通道接收到一定量的散射光前向散射光的強(qiáng)度是和細(xì)胞或其他檢測顆粒的大小、形狀密切相關(guān)的數(shù)據(jù)采集-前向散射光當(dāng)使用激光光源時，在前向方向（和激光行進(jìn)的方向相同）上可用前23當(dāng)激光光源被使用時，側(cè)向也有一定量的散射光產(chǎn)生，可以用90o角的側(cè)向散射光檢測通道來采集側(cè)向散射光的強(qiáng)度和細(xì)胞或其他檢測顆粒的顆粒密度、內(nèi)部復(fù)雜程度密切相關(guān)數(shù)據(jù)采集-側(cè)向散射光當(dāng)激光光源被使用時，側(cè)向也有一定量的散射光產(chǎn)生，數(shù)據(jù)采集-側(cè)24外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點圖

顆粒雜質(zhì)、氣泡對檢測的影響外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點圖

顆粒雜質(zhì)、氣泡25細(xì)胞標(biāo)記上熒光物質(zhì)后，這種熒光物質(zhì)要求特定波長的激發(fā)光來激發(fā)，同時發(fā)出特定波長的光熒光物質(zhì)被激發(fā)以后產(chǎn)生的發(fā)射光將由特定的熒光通道來接收特定檢測是通過光學(xué)濾片和透鏡來控制的數(shù)據(jù)采集-熒光信號熒光強(qiáng)度是和細(xì)胞上標(biāo)記上的熒光染料的量正相關(guān)數(shù)據(jù)采集-熒光信號熒光強(qiáng)度是和細(xì)胞上標(biāo)記上的熒光染料的量正相26數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)采集27電壓

信號放大方式：log、lin信號類型：A,W,H電壓的調(diào)節(jié):根據(jù)陰性對照管來調(diào)節(jié)電壓

信號放大方式：log、lin28閾值可以以任意參數(shù)及多個參數(shù)的組合作為閾值大多數(shù)樣本都可以設(shè)定FSC/SSC閾值以下的信號不存儲根據(jù)陰性對照管來調(diào)節(jié)目的是將不需要的雜質(zhì)信號，噪音信號，無用的細(xì)胞信號等扣除，使收集到的都是有用信號閾值可以以任意參數(shù)及多個參數(shù)的組合作為閾值29流式細(xì)胞儀BD-FACSCanto-II課件30流式細(xì)胞儀BD-FACSCanto-II課件31補(bǔ)償

補(bǔ)償方式：任意兩個通道之間，可以采用手動或自動補(bǔ)償。補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié):根據(jù)單染對照管來調(diào)節(jié)補(bǔ)償

補(bǔ)償方式：任意兩個通道之間，可以采用手動或自動補(bǔ)償。32流式細(xì)胞儀BD-FACSCanto-II課件33流式細(xì)胞儀BD-FACSCanto-II課件34流式細(xì)胞儀BD-FACSCanto-II課件35流式細(xì)胞儀BD-FACSCanto-II課件36流式細(xì)胞儀BD-FACSCanto-II課件371.)Compensation-TooLittle;TooMuch1.)Compensation-TooLittle;382.)BasicPrinciplesofCompensation-%Compensationisindependentoffluorescenceintensity2.)BasicPrinciplesofCompen393.)Compensation-

TooDim,TooBrightCompensationControlsSmallerrorsincompensationofadimcontrol(A)canresultinlargecompensationerrorswithbrightreagents(B&C).3.)Compensation-

40數(shù)據(jù)分析流式數(shù)據(jù)直方圖散點圖等高線圖密度圖三維圖統(tǒng)計數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)分析41直方圖直方圖(DistributionHistogram)橫坐標(biāo)代表熒光信號或散射光信號相對強(qiáng)度，單位是對數(shù)，可以是線性或?qū)?shù)坐標(biāo)?？v坐標(biāo)一般是細(xì)胞數(shù)。直方圖直方圖(DistributionHistogram)42散點圖散點圖(DotPlot)X坐標(biāo)為該細(xì)胞一參數(shù)相對含量，Y坐標(biāo)為該細(xì)胞另一參數(shù)的含量，可以將細(xì)胞亞群分開。散點圖散點圖(DotPlot)43等高線圖和密度圖等高線圖和密度圖44三維圖