乙肝疫苗的制備講義課件

乙肝疫苗的制備乙肝疫苗的制備基因工程

定義：又稱為重組DNA技術(shù)，指將某些特定的基因或DNA片斷，通過載體或其它手段送入受體細(xì)胞，使它們在受體細(xì)胞中增殖并表達(dá)的一種遺傳學(xué)操作。是生產(chǎn)出符合人類需要的產(chǎn)品或創(chuàng)造出生物的新性狀并能穩(wěn)定遺傳。

作用：可把來自任何生物的基因轉(zhuǎn)移到與其毫無關(guān)系的任何其他受體細(xì)胞中，可以任意改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造出生物的新性狀。某一段DNA可在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，為制備大量純化的DNA片段提供了可能.基因工程

定義：又稱為重組DNA技術(shù)，指將某些特定的基因或獲得目的基因表達(dá)載體重組的表達(dá)載體酶切、連接宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等原核生物細(xì)胞植物細(xì)胞動物細(xì)胞卵細(xì)胞培養(yǎng)的動物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動物胚胎發(fā)育藥物、疫苗轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因微生物基因工程藥物人類細(xì)胞基因治療獲得目的基因表達(dá)載體重組的表達(dá)載體酶切、連接宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)3蛋白質(zhì)名稱

用途促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotrophichormone）治療風(fēng)濕（rheumaticdisease）B細(xì)胞生長因子（B-cellgrowthfactor）治療免疫系統(tǒng)功能失調(diào)降鈣素(calcitonin)治療軟骨病(osteomalacia)集落刺激因子(colonystimulatingfactor)治療血液病、腫瘤輔助治療絨毛膜促性腺激素(chorionicgonadotropin)治療不排卵癥內(nèi)啡肽和腦啡肽(endorphineandenkephalin)鎮(zhèn)痛劑(analgesicagent)上皮生長因子(epidermalgrowthfactor)促進(jìn)傷口愈合紅細(xì)胞生成素(erythropoietin)治療貧血(anemia)凝血因子Ⅷ(factorⅧ)治療血友病(hemophilia)凝血因子Ⅸ(factorⅨ)治療血友病生長激素(growthhormone)促進(jìn)生長生長激素釋放因子(growthhormonereleasingfactor)促進(jìn)生長胰島素(insulin)治療糖尿病(diabetes)干擾素(interferon)抗病毒抗腫瘤白細(xì)胞介素(interleukin)治療癌癥蛋白質(zhì)名稱4乙肝疫苗的制備講義ppt課件5基因重組乙肝疫苗用基因重組技術(shù)把乙型肝炎病毒的表面抗原（HbsAg）基因片段插入酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞的基因中，在體外培養(yǎng)增殖過程中組裝或分泌出乙型肝炎表面抗原，然后把表面抗原收集起來提純之后做成乙型肝炎疫苗?；蛑亟M乙肝疫苗6乙肝疫苗的制備乙肝疫苗的制備7目的基因的獲取編碼乙型肝炎表面抗原的基因的獲取

一般的目的基因的獲取方法有：反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)法cDNA文庫的建立？目的基因的獲取編碼乙型肝炎表面抗原的基因的獲取cDNA文庫的8cDNA文庫的建立cDNA文庫的建立9工程菌的構(gòu)建CHO細(xì)胞的特點(diǎn)①具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能,表達(dá)的糖基化藥

物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然蛋白分子②具有產(chǎn)物胞外分泌功

能,便于下游產(chǎn)物分離純化;③具有重組基因的高效

擴(kuò)增和表達(dá)能力;④具有貼壁生長特性,且有較高的

耐受剪切力和滲透壓能力,可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng),表達(dá)水平較高;

⑤CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞(fibrob2last),很少分泌自身的內(nèi)源蛋白,利于外源蛋白的后分離工程菌的構(gòu)建CHO細(xì)胞的特點(diǎn)10材料菌株﹑質(zhì)粒及細(xì)胞大腸桿菌DH5α和質(zhì)粒pMD18-Sm（攜帶改變稀有密碼子后的S基因）質(zhì)粒pCIneoCHO／dhfr-細(xì)胞pMD18-T載體材料11主要試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNAligase、質(zhì)粒DNA提取

和柱式膠回收試劑盒乙型肝炎表面抗原檢測試劑盒DMEM和透析胎牛血清胰蛋白酶、氨甲喋呤（MTX）和脂質(zhì)體LipofectamineTMHBsAg血凝檢測試劑盒主要試劑12

目的基因的表達(dá)目的基因的表達(dá)13

蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化14濃縮與初步純化離子交換層析疏水層析親和層析固液分離離心沉淀膜過濾雙水相萃取高度純化DNA的去除熱原質(zhì)的去除病毒的去除濃縮與初步純化15分離純化的基本要求技術(shù)條件溫和，保持其生物活性選擇性好，達(dá)到有效分離純化的目的技術(shù)間可以直接連接，節(jié)省工藝步驟收率高，過程快選擇分離純化方法的依據(jù)根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇根據(jù)分離單元之間的銜接來選擇根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇分離純化的基本要求16分離純化工藝流程分離純化工藝流程171、發(fā)酵液的預(yù)處理連續(xù)高速離心，除去細(xì)胞殘片，再超濾濃縮2、疏水柱層析介質(zhì)：ButylSSepharoseFF加入適量硫酸銨，調(diào)節(jié)電導(dǎo)率與柱層析平衡液電導(dǎo)率相等按照平衡柱床、上樣吸附、平衡液洗柱、降低硫酸銨濃度解析、清柱再生程序?qū)游?/p>

1、發(fā)酵液的預(yù)處理183、陰離子交換柱層析介質(zhì)：DEAESepharoseFFHBsAg活性蛋白經(jīng)SephadexG-25柱脫鹽換液，使緩沖鹽系統(tǒng)的PH、離子強(qiáng)度和IEC平衡液