亞硝酸鹽還原酶高產(chǎn)菌株的篩選與鑒定

亞硝酸鹽還原酶高產(chǎn)菌株的篩選與鑒定

亞硝酸鹽（nit）的外觀與用鹽非常相似，顏色為白色或黃色，通常存在于自然界和日常生活中。在自然環(huán)境下，NIT由硝酸鹽還原生成和銨鹽氧化生成，硝酸鹽和銨鹽本身都是無毒的，在特定條件下經(jīng)化學(xué)反應(yīng)后就會生成有毒的NIT,NIT被用作添加劑是法定許可的，而且常作為添加劑廣泛用于食品加工中。當(dāng)然，NIT的使用量須嚴(yán)格管控，GB2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定其使用量不得超過150mg/kg，殘留量不得超過30mg/kg亞硝酸鹽還原酶（nitritereductase,NIR）能夠還原亞硝酸鹽，生成NH植物乳桿菌等產(chǎn)生的NIR在25℃～38℃時酶活均較高，其最適溫度為30℃左右，當(dāng)溫度為15℃時，NIR的酶活會受到抑制，酶活力降至原來的10%；當(dāng)溫度為50℃時，酶會失去活性。NIR在pH值為5～6時，酶均表現(xiàn)有較明顯活力，酶的最適反應(yīng)pH值為5.5。與酸性環(huán)境不一樣，在堿性環(huán)境中，酶活性將受到限制甚至全部消失。在這些最適反應(yīng)條件下，測得酶的米氏常數(shù)Km值為120.5μg/mL目前研究表明，只有部分乳酸菌會產(chǎn)生NIR，且會因基因表達(dá)差異而產(chǎn)生不同類型的亞硝酸鹽還原酶。本文對自然發(fā)酵泡菜中產(chǎn)生的亞硝酸鹽微生物進(jìn)行分離純化，對其中降解NIT效率最高的菌株鼠李糖乳桿菌N-6的培養(yǎng)基和部分培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，對酶液進(jìn)行初步純化，并測定純化后的酶活性。1材料和方法1.1試劑與儀器：培養(yǎng)基、引物自然發(fā)酵泡菜：市售；MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨2g、葡萄糖4g、乙酸鈉1g、硫酸鎂0.04g、硫酸錳0.01g、牛肉粉1g、酵母粉0.8g、磷酸氫二鉀0.4g、檸檬酸三銨0.4g、吐溫800.2mL、蒸餾水200mL；平板篩選培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基加入2.8g瓊脂，200mL去離子水；鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、葡萄糖、乙酸鈉、鹽酸萘乙二胺、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、對氨基苯磺酸、硼酸鈉、乙酸鋅、亞氰化鉀、鹽酸、冰乙酸（分析純）：北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；以上試劑均為分析純。1.2熱浴鍋、反滲透和冷凍高速離心BS2202S型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；BXM-30R高壓滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HH-SY11-Ni1電熱恒溫水浴鍋：北京長安科學(xué)儀器廠；UVmini-1240紫外可見分光光度計：日本島津公司；4k153-18k冷凍高速離心機(jī)：Sigma公司；DYY-12C電泳儀：北京六一儀器廠。1.3亞硝酸鈉含量測定1.3.1色瓶中對氨基苯磺酸溶液鹽酸萘乙二胺溶液：準(zhǔn)確稱取0.1g鹽酸萘乙二胺，溶解于50mL超純水中，混勻，置棕色瓶中，避光4℃保存待用；對氨基苯磺酸溶液：稱取0.4g對氨基苯磺酸，溶于100mL20%鹽酸中，置于棕色瓶中混勻，避光保存待用。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.1g亞硝酸鈉，加入超純水溶解，移入500mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，此溶液即為亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.3.2鹽酸反應(yīng)物的制備準(zhǔn)確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、5.0mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于50mL容量瓶中，加入40mL超純水，搖勻，加入2mL對氨基苯磺酸溶液，搖勻，置于避光處反應(yīng)5min；再加入1mL鹽酸萘乙二胺溶液，定容至50mL，混勻，避光靜置15min。設(shè)置分光光度計波長為538nm，分別測定吸光值，以亞硝酸鈉溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線。亞硝酸鈉在0～0.25μg/mL的濃度范圍內(nèi)與A1.4高產(chǎn)nir菌篩選1.4.1雙歧桿菌酸奶培養(yǎng)活化培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基，配制100mLMRS培養(yǎng)基，接種1g雙歧桿菌酸奶發(fā)酵劑，置于搖床中30℃，180r/min，培養(yǎng)24h。1.4.2培養(yǎng)基培養(yǎng)方法配制300mLMRS瓊脂培養(yǎng)基將活化好的新鮮種子液分別稀釋1、10、100、1000倍，將這4種濃度的菌液以涂布法接種在平板中，每個濃度接種2個平板，30℃培養(yǎng)24h。配制500mLMRS液體培養(yǎng)基，121℃滅菌20min，選取長勢較好菌落，用接種環(huán)分別接種到錐形瓶中，30℃培養(yǎng)24h。從平板中篩選的菌落序號分別為N-1、N-2、N-3、N-4、N-5、N-6、N-10、N-14、N-17、N-21、N-22、N-25、N-28、N-29、N-311.4.3用乙二胺鈉分光光度法測定了植物分解亞硝酸鹽的能力1.4.3.亞鐵氰化鉀溶液飽和硼酸鈉溶液：稱取50g硼酸鈉，溶于1000mL熱水中，冷卻備用；乙酸鋅溶液：稱取22g乙酸鋅，加入3mL冰乙酸，最后再加水稀釋到100mL；亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6g亞鐵氰化鉀，加水至100mL，攪拌溶解；鹽酸萘乙二胺溶液：稱取0.1g鹽酸萘乙二胺，溶解于50mL水中，攪拌混勻，放入棕色瓶中備用；對氨基苯磺酸溶液：稱取0.4g對氨基苯磺酸，溶解于100mL去離子水中，放進(jìn)棕色瓶中備用。配制NaNO1.4.3.總糖含量的提取試樣處理：吸取5mL樣品，分別置于250mL三角瓶中，加入飽和硼砂溶液12.5mL，搖勻后再加入約50mL蒸餾水，沸水鍋里加熱15min，取出后冷卻至25℃，再轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，加入5mL亞鐵氰化鉀溶液，混勻，再加入5mL乙酸鋅溶液，定容到100mL，充分混勻，靜置約30min，沉淀樣品中的蛋白質(zhì)。這沉淀進(jìn)行抽濾，棄去初濾液30mL，收集剩余的濾液。吸取2mL上述濾液于50mL容量瓶中，加水40mL，搖晃均勻，先加入2mL對氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置5min，再加入1mL鹽酸萘乙二胺溶液，定容至50mL，混勻，避光靜置15min，在波長538nm處測定吸光值1.5rt-pcr反應(yīng)條件引物序列為27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;1492r:GGCTACCTTGTTACGACTT。PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min,95℃變形30s,58℃退火30s,72℃延伸1.5min，共循環(huán)30次，最后72℃延伸10min?；驕y序：由北京華大測序公司進(jìn)行。1.6碳源種類對養(yǎng)殖的影響篩選出的高產(chǎn)菌株，以NIT為指標(biāo)，以碳源、氮源、磷源、培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)方式作為影響因素進(jìn)行單因素試驗，初始培養(yǎng)條件設(shè)定為2%葡萄糖、0.5%酪蛋白胨、0.2%磷酸二氫鉀、培養(yǎng)溫度37℃，動態(tài)培養(yǎng)，其中碳源分別選取蔗糖、葡萄糖和乳糖，并以不加碳源為空白對照。氮源分別選取蛋白胨、酪蛋白胨及胰蛋白胨，以不加氮源為空白對照，磷源分別選取磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉及磷酸二氫鉀，以不加磷源為無磷空白對照，培養(yǎng)溫度分別選取20、30、37、40℃，培養(yǎng)方式選用動態(tài)和靜態(tài)兩種不同培養(yǎng)方式1.7亞硝酸鹽還原酶的提取和分離1.7.1測定蛋白質(zhì)濃度雙縮脲法測定蛋白含量，首先制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得蛋白質(zhì)含量的回歸方程曲線y=0.0773x+0.005，回歸系數(shù)R1.7.2酶活性測定1.7.2.1.酶活性計算酶活力單位定義：每小時降解1μg亞硝酸鹽所需要的酶量為一個酶活力單位（U），即1U=1μg/h。1.7.2.2-酶活性反應(yīng)系統(tǒng)取干凈試管，加入1%葡萄糖1mL,50μg/mLNaNO1.7.3制備與提取的粗酶溶液亞硝酸還原酶粗酶液的提取制備方法為溶菌酶和超聲波破碎，具體制備過程參照文獻(xiàn)1.7.3.超聲波破碎法將初篩獲得的菌株分別接入含0.2mg/mL亞硝酸鈉的培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h。分別取菌液100mL,6000r/min4℃離心10min。收集沉淀，棄去上清液，用10mL磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）。振蕩，將菌體懸浮，加入溶菌酶，使其濃度為5mg/mL,30℃反應(yīng)24h。經(jīng)過超聲波破碎后，8000r/min4℃離心15min。取上清液即為粗酶液1.7.3.硫酸銨分級沉淀本研究采用硫酸銨沉淀法來沉淀上清液中的蛋白成分。根據(jù)鹽析粗酶液的體積，稱取30%硫酸銨，置于4℃冰箱4h，再離心（20min、6000r/min），留上清液去沉淀。向上清液中繼續(xù)添加硫酸銨（飽和度達(dá)到60%),4℃放置4h，離心（15min,1200r/min），收集沉淀。將沉淀溶于粗酶液同體積的磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L、pH7.2)1.7.3.3分析選用的透析袋截留范圍是8000～14000，透析袋的預(yù)處理參考文獻(xiàn)1.7.3.蛋白質(zhì)的提取選擇的陰離子交換層析為DEAE瓊脂糖凝膠CL-6B，層析柱規(guī)格為1.6cm×30cm。具體操作步驟如下：根據(jù)柱子大小取適量的凝膠。凝膠高度達(dá)到柱子高度的80%左右，自然沉降。沉降完成后用去離子水平衡12h，備用，取粗酶液，上樣量3mL。上樣前過0.22mm孔徑聚醚砜濾膜，除去不溶物。洗脫：用含0.5mol/LNaCl的0.002mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽在2mL/min的流速下進(jìn)行洗脫，洗脫液每5min收集一管，每管3mL，共收集80管；檢測：經(jīng)酶標(biāo)儀在280nm波長下測定每一管蛋白溶液的吸光值，并繪制層析圖譜。然后收集峰值較高處的蛋白，用雙縮脲法檢測蛋白質(zhì)含量；再生：用洗脫液洗脫各組分直到完全洗脫，即可加入新的樣品，繼續(xù)使用。1.8處理數(shù)據(jù)利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總，并利用Origin95進(jìn)行繪圖。2結(jié)果與分析2.1菌落初步篩選不同菌落作用后的亞硝酸鈉含量見圖1。通過鹽酸萘乙二胺分光光度法測試菌株分解亞硝酸鹽能力，由圖1可知，亞硝酸鈉含量越高，意味著降解率越底，因此初步篩選出亞硝酸鈉含量較低的菌落，分別為N-6、N-25、N-28、N-31。2.2乳酸桿菌對nit的降解率不同菌落的NIT降解率結(jié)果見圖2。如圖2所示，從泡菜樣品中，初步篩選得出N-6、N-25、N-28、N-31號乳酸桿菌可高效降解NIT，其中N-6的降解率最高。經(jīng)16SrDNA序列測序鑒定為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）。2.3鼠李糖乳桿菌nir的最佳條件探索試驗得出了鼠李糖乳桿菌N-6為最高產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶的乳桿菌，因此將進(jìn)一步研究探索出影響鼠李糖乳桿菌產(chǎn)生NIR的最佳條件。影響乳桿菌降解NIT因素有很多，包括碳源、氮源、磷源、培養(yǎng)方式及培養(yǎng)溫度等，本文對上述影響因素進(jìn)行試驗，得到鼠李糖乳桿菌產(chǎn)生NIR的最佳條件。2.3.1最佳碳源對鼠李糖乳桿菌t不同碳源對鼠李糖乳桿菌降解亞硝酸鹽結(jié)果見圖3。由圖3可知，無碳對照的NIT降解率為0.01%，由此說明碳源對鼠李糖乳桿菌影響較大，其中葡萄糖為最佳碳源，其降解率為52.22%，其降解亞硝酸鈉的能力明顯更強(qiáng)。這可能是由于鼠李糖乳桿菌自身對糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝效率會因糖而異，導(dǎo)致在降解亞硝酸鹽上的差別。2.3.2大鼠李糖乳桿菌nit的降解不同氮源對降解NIT的影響見圖4。由圖4可知，無氮對照的NIT降解率為44.44%，其中氮源為酪蛋白胨時鼠李糖乳桿菌的降解率最高，為68.89%。因此，此菌的最佳氮源為酪蛋白胨。2.3.3鼠李糖乳桿菌最佳磷源的確定不同磷源對鼠李糖乳桿菌降解亞硝酸鹽結(jié)果見圖5。由圖5可知，無磷對照的降解率高于磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉，而低于磷酸二氫鉀，因此鼠李糖乳桿菌的最佳磷源為磷酸二氫鉀。2.3.4溫度對大鼠李糖菌的分解亞硝酸鹽的影響不同培養(yǎng)溫度對鼠李糖乳桿菌降解亞硝酸鹽結(jié)果見圖6。由圖6可知，鼠李糖乳桿菌的最適培養(yǎng)溫度為37℃。2.3.5鼠李糖乳桿菌對亞硝酸鹽的降解率采用靜置培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)（搖床通氣培養(yǎng)）兩種培養(yǎng)方式，結(jié)果見圖7。由圖7可知，動態(tài)培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌時，其亞硝酸鹽降解率較高，而靜態(tài)培養(yǎng)對亞硝酸鹽降解率相對較低，在動態(tài)培養(yǎng)中培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分能被充分利用，菌株活力變強(qiáng)，而靜態(tài)培養(yǎng)的菌株則相對不能充分利用營養(yǎng)。2.4亞硝酸鹽還原酶的分離和精制2.4.1離心處理對蛋白酶活性的影響鹽析過程酶活性見表1。由表1可知，經(jīng)30%硫酸銨鹽析處理，離心后所得蛋白沉淀測得酶活：303.875U/mL；經(jīng)60%硫酸銨處理上清液，離心后所得蛋白沉淀測得酶活力：309.375U/mL，上清液中無酶活性。上清液已經(jīng)無法檢測出酶活性，表明酶蛋白已經(jīng)完全經(jīng)鹽析沉淀下來，得到很好的分離。同時也表明，60%的硫酸銨濃度更有利于蛋白質(zhì)的析出。因此，對于此還原酶來說，鹽析時選擇較高濃度的鹽濃度（60%）比較有利于蛋白質(zhì)沉淀完全。2.4.2酶活力檢測結(jié)果DEAE瓊脂糖凝膠CL-6B層析圖譜見圖8。如圖8所示，DEAE瓊脂糖凝膠CL-6B層析圖譜包含4個洗脫峰值，收集這4個峰值附近的幾個酶活力高的洗脫液進(jìn)行濃縮，測定蛋白含量和酶活力。A處的洗脫液酶活力最高為764.49U/mL，其它洗脫峰經(jīng)檢測后均無酶活，可能為雜蛋白。粗酶液、鹽析、透析與陰離子交換柱的蛋白含量與酶活力見表2。由表2可知，經(jīng)過鹽析后亞硝酸鹽還原酶的活性無顯著提升，在采用透析袋，透析24h后，經(jīng)透析后測得還原酶活力為：208.48U/mL。經(jīng)透析除鹽后，相對于上述鹽析后的酶液酶活性有所提高。經(jīng)DEAE柱層析分離純化后還