抗生素的測定-測定方法

生鮮乳中抗生素殘留檢驗(yàn)原理一試劑和材料二檢驗(yàn)程序四菌種、培養(yǎng)基和試劑三操作步驟五報(bào)告六一、原理

樣品經(jīng)過80℃殺菌后，添加嗜熱鏈球菌菌液。培養(yǎng)一段時(shí)間后，嗜熱鏈球菌開始增殖。這個(gè)時(shí)候加入代謝底物2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC），若該樣品中不含有抗生素或抗生素濃度低于檢測限，嗜熱鏈球菌講繼續(xù)增殖，還原TTC成為紅色物質(zhì)。相反，如果樣品中含有高于檢測限的抑菌劑，則嗜熱鏈球菌受邀到抑制，因此指示劑TTC不還原，保持原色。噬熱鏈球菌抑制法二、試劑和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：冰箱：2℃~5℃、-20℃~-5℃恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃帶蓋恒溫水浴鍋：36℃±1℃、80℃±2℃天平：感量0.1g、0.001g無菌吸管：1ml（具0.01ml刻度），10.0ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸頭無菌試管：18mm×180mm溫度計(jì)：0℃~100℃旋渦混勻器噬熱鏈球菌抑制法三、菌種、培養(yǎng)基和試劑噬熱鏈球菌抑制法1．菌種：嗜熱鏈球菌2．滅菌脫脂乳3．4%2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液：：1g2，3，5-氯化三苯四氮唑溶于5mL滅菌蒸餾水中，裝褐色瓶中于2℃～5℃保存。臨用時(shí)用滅菌蒸餾水5倍稀釋。成為4%的水溶液。4．青霉素G參照溶液：稱取青霉素G鉀鹽標(biāo)準(zhǔn)品30.0mg，溶于無菌磷酸鹽緩沖液中，使其濃度為100IΜ/mL～1000IΜ/mL。再將該溶液用滅菌脫脂乳稀釋至0.6IΜ/mL，分裝于無菌小管中，密封備用。四、檢驗(yàn)程序高效液相色譜法五、操作步驟噬熱鏈球菌抑制法菌種活化取一接種環(huán)嗜熱鏈球菌菌種，接種在9ml滅菌脫脂乳中，置36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h~15h后，置2℃~5℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ?5d轉(zhuǎn)種一次。測試菌液將經(jīng)過活化的嗜熱鏈球菌金鐘接種滅菌脫脂乳，36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15h±1h，加入相同體積的滅菌脫脂乳混勻稀釋成測試菌液。培養(yǎng)取樣品9ml，置18mm×180mm試管內(nèi)，每份樣品另外做一份平行樣。同時(shí)再做因性和陽性對照各一份，陽性對照管用9ml青霉素G參照溶液，隱形對照管用9ml滅菌脫脂乳。多有試管置80℃±2℃水浴加熱5min，冷卻至37℃一下，加入測試菌液1ml，輕輕旋轉(zhuǎn)試管混勻。36℃±1℃水浴培養(yǎng)2h，加4%TTC水溶液0.3ml，在旋渦混勻器上混合15s或振動(dòng)試管混勻。36℃±1℃水浴避光培養(yǎng)30min，觀察顏色變化。如果顏色沒有變化，于水浴中繼續(xù)避光培養(yǎng)30min作最終觀察。觀察時(shí)要迅速，避免光照過久出現(xiàn)干擾。五、操作步驟噬熱鏈球菌抑制法判斷方法在白色背景前觀察，是觀眾樣品呈乳的原色時(shí)，指示乳中有抗生素存在，為陽性結(jié)果，試管中樣品呈紅色為陰性結(jié)果。如最終觀察現(xiàn)象仍為可以，建議重新檢測。六、報(bào)告噬熱鏈球菌抑制法報(bào)告：最終觀察時(shí)，樣品變?yōu)榧t色，報(bào)告為抗生素殘留陰性。樣品依然呈乳的原色，報(bào)告為抗生素殘留陽性。本方法檢測幾種常見抗生素的最低檢出限為：青霉素0.004IU，鏈霉素0.5IU，慶大霉素0.4IU，卡那霉素5IU。生鮮乳中抗生素殘留檢驗(yàn)原理一試劑和材料二檢驗(yàn)程序四菌種、培養(yǎng)基和試劑三操作步驟五報(bào)告六一、原理

培養(yǎng)基預(yù)先混合嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞，并含有pH指示劑（溴甲酚紫），加入樣品并孵育后，若該樣品中不含有抗生素或抗生素的濃度低于檢測限，細(xì)菌芽孢將在培養(yǎng)基中生長并利用糖產(chǎn)酸，pH指示劑的紫色變?yōu)辄S色。相反，如果樣品中含有高于檢測限的抗生素，則細(xì)菌芽孢不會(huì)生長，pH指示劑的顏色保持不變，仍為紫色。嗜熱脂肪芽胞桿菌抑制法二、試劑和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：冰箱：2℃~5℃、-20℃~-5℃恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃、56±1℃恒溫水浴鍋：65℃±1℃、80℃±2℃無菌吸管或100μl、200μl微量移液器及吸頭無菌試管：18mm×180mm、15mm×100mm溫度計(jì)：0℃~100℃離心機(jī)：轉(zhuǎn)速5000r/min嗜熱脂肪芽胞桿菌抑制法三、菌種、培養(yǎng)基和試劑嗜熱脂肪芽胞桿菌抑制法1．菌種：嗜熱脂肪芽孢桿菌卡利德變種2．滅菌脫脂乳3．無菌磷酸鹽緩沖溶液。4．青霉素G參照溶液：稱取青霉素G鉀鹽標(biāo)準(zhǔn)品30.0mg，溶于無菌磷酸鹽緩沖液中，使其濃度為100IΜ/mL～1000IΜ/mL。再將該溶液用滅菌脫脂乳稀釋至0.6IΜ/mL，分裝于無菌小管中，密封備用。5．溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基:稱取溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基干粉15g，加入蒸餾水或去離子水1000mL，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝試管，115℃高壓滅菌30min。四、檢驗(yàn)程序嗜熱脂肪芽胞桿菌抑制法五、操作步驟嗜熱脂肪芽胞桿菌抑制法測試培養(yǎng)基在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中加入適量芽胞懸液，混合均勻，使最終芽胞濃度為8×105CFΜ/mL～2×l06CFΜ/mL。混合芽孢懸液的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基分裝小試管，每管200μL，密封防止水分蒸發(fā)。配置好的測試培養(yǎng)基可以在2℃～5℃保存6個(gè)月。培養(yǎng)操作吸取樣品100μL加入含有芽胞的測試培養(yǎng)基中，輕輕旋轉(zhuǎn)試管混勻，每份撿樣做2份，另外再做陰性和陽性對照個(gè)1份，陽性對照管為100μL青霉素G參照溶液，陰性對照管為100μL無抗生素的脫脂乳。于65℃±2℃水浴培養(yǎng)2.5h，觀察培養(yǎng)基顏色的變化，若沒有顏色變化，繼續(xù)水浴培養(yǎng)30min做最終觀察。結(jié)果報(bào)告。五、操作步驟嗜熱脂肪芽胞桿菌抑制法判斷方法在白色背景前從側(cè)面和地步觀察小試管內(nèi)培養(yǎng)基顏色。保持培養(yǎng)基原有的紫色為陽性結(jié)果，培養(yǎng)基編程黃色或黃綠色為陰性結(jié)果，顏色處于二者之間，為可疑結(jié)果。對于可疑結(jié)果應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)30min再進(jìn)行最終觀察。如果培養(yǎng)基顏色仍然處于黃色-紫色之間，表示抗生素濃度接近方法的最低檢出限，此時(shí)建議重新檢測一次.六、報(bào)告嗜熱脂肪芽胞桿菌抑制法報(bào)告：最終觀察室，培養(yǎng)基依然保持原有的紫色，可疑報(bào)告為抗生素殘留陽性。培養(yǎng)基變?yōu)槌庶S色或黃綠色時(shí)，可以報(bào)告為抗生素殘留陰性。本方法檢測幾種常見抗生素的最低檢出限為：青霉素3μg/l，鏈霉素50μg/l，慶大霉素30μg/l，卡那霉素50μg/l。生鮮乳中抗生素殘留檢驗(yàn)概述乳中抗生素的來源一抗生素的危害二抗生素殘留的檢測方法四牛乳中抗生素殘留的管理三一、乳中抗生素的來源

隨著奶牛飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展，抗生素在預(yù)防和治療奶牛疾病方面得到廣泛的應(yīng)用。生鮮牛乳中抗生素的來源主要有以下幾個(gè)方面：抗生素殘留檢驗(yàn)一、乳中抗生素的來源1、治療泌乳期病牛時(shí)，對泌乳牛用藥不當(dāng)或不注意安全時(shí)間，抗生素會(huì)從奶牛體內(nèi)轉(zhuǎn)移到乳腺，使殘留抗生素進(jìn)入牛乳中，尤其是使用乳房灌注法治療乳腺炎時(shí)，易造成牛乳中抗生素殘留。資料表明，治療后的奶牛，其擠出的牛乳5d內(nèi)都有抗生素殘留。2、為了預(yù)防奶牛疾病并提高產(chǎn)量，在牛飼料中添加飼料添加劑已十分普遍，其中含有一定比例的抗生素，主要作用是預(yù)防疾病，這也是牛乳抗生素殘留的重要原因?？股貧埩魴z驗(yàn)一、乳中抗生素的來源3、由于牧場管理不善，擠乳、儲乳沒有嚴(yán)格的衛(wèi)生制度和配套的設(shè)施，尤其在高溫季節(jié)為防止乳的酸敗，往往向牛乳中摻雜各種抗生素，造成牛乳中抗生素殘留。4、用經(jīng)抗生素治療的奶牛用過的擠乳器給正常奶牛擠乳，可使正常牛的乳中殘留抗生素，所以擠乳是乳中抗生素殘留的另一個(gè)來源?？股貧埩魴z驗(yàn)二、抗生素的危害抗生素殘留檢驗(yàn)1、對人的危害牛乳中含有抗生素，對長期飲用者來說無疑是等于長期服用小劑量的抗生素，對抗生素有過敏體質(zhì)的人服用殘留抗生素的乳后會(huì)發(fā)生過敏反應(yīng)。即使是正常飲用者，體內(nèi)的某些條件性致病菌易產(chǎn)生耐藥性，一旦患病再用同種抗生素治療很難奏效。二、抗生素的危害抗生素殘留檢驗(yàn)2、對奶牛養(yǎng)殖的危害抗生素是奶牛場治療乳房炎的常規(guī)藥物，由于長期大量使用，使耐藥菌株增加，使一些奶牛乳房炎病例變得難以用常規(guī)方法治愈。這種情況又促使臨診獸醫(yī)在治療過程中加大抗生素的用量二、抗生素的危害抗生素殘留檢驗(yàn)3、對加工企業(yè)的危害牛乳中抗生素殘留不僅對人的健康造成很大的危害，而且對乳品加工企業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失，因?yàn)椋Ｈ橹锌股貧埩魰?huì)影響乳制品品質(zhì)，如果用含抗生素的乳制作酸奶或乳酪等，則殘留在其中的抗生素會(huì)抑制細(xì)菌的發(fā)酵，使產(chǎn)量和質(zhì)量降低。嚴(yán)重者會(huì)造成生產(chǎn)不能正常進(jìn)行。三、牛乳中抗生素殘留的管理抗生素殘留檢驗(yàn)由于牛乳中的抗生素對人體及其加工企業(yè)